Kontaktløs dielectrophoresis (cDEP) oppnår sortering og berikelse av partikler via sine iboende dielektriske egenskaper. Fluidic elektrode kanaler erstatte metallelektroder tradisjonelle til DEP, passet cDEP til ikke-ødeleggende steril karakterisering og sortering av biologiske partikler. Vi demonstrerer hvordan å forberede en cDEP microdevice og gjennomføre celle karakterisering og sortering eksperimenter.
Dielectrophoresis (DEP) er det fenomen hvorved polariserte partikler i et ikke-uniformt elektrisk felt gjennomgå translasjonsbevegelse, og kan brukes for å dirigere bevegelsen av mikropartikler i en overflate markør-uavhengig måte. Tradisjonelt DEP enheter omfatter plane metallelektroder mønstret i utvalget kanalen. Denne fremgangsmåten kan være kostbart og krever et spesialisert renromsmiljø. Nylig har en kontakt-fri tilnærming kalt kontaktløs dielectrophoresis (cDEP) blitt utviklet. Denne metoden benytter det klassiske prinsippet DEP og samtidig unngå direkte kontakt mellom elektrodene og prøven etter mønster fluidic elektroder og en sample-kanal fra en enkelt polydimetylsiloksan (PDMS)-substrat, og kan anvendes som en rask mikrofluid strategi for å sortere og berike mikropartikler. Unikt for denne metoden er at det elektriske felt genereres via fluidtekniske kanaler elektrode inneholdende en sterkt ledende fluid, som er adskilt fra detsample-kanal ved et tynt isolerende barriere. Fordi metallelektroder ikke direkte i kontakt med prøven, blir elektrolyse, elektrodedelaminering, og prøveforurensning unngås. I tillegg gjør dette til en billig og enkel fremstillingsprosess.
cDEP er dermed godt egnet for å manipulere sensitive biologiske partikler. Den dielectrophoretic kraft som virker på partiklene avhenger ikke bare ved romlige gradienter av det elektriske felt som genereres av tilpasses utformingen av geometrien i apparatet, men den iboende biofysiske egenskapene til cellen. Som sådan, er cDEP en etikett-fri teknikk som unngår avhengig av overflate uttrykt molekylære biomarkører som kan bli ulikt uttrykt i en befolkning, som samtidig gir karakterisering, berikelse, og sortering av bioparticles.
Her viser vi det grunnleggende fabrikasjon og eksperimentering ved hjelp cDEP. Vi forklarer den enkle utarbeidelse av en cDEP chip bruker myk litografiy teknikker. Vi diskuterer den eksperimentelle fremgangsmåte for å karakterisere overgangsfrekvensen av en partikkel eller celle, den frekvens ved hvilken den dielectrophoretic kraften er null. Endelig vi demonstrere bruken av denne teknikken for sortering av en blanding av eggstokkreft celler og fluorescerende mikrosfærer (perler).
Biologisk prøve berikelse og partikkel sortering er ofte nødvendig for senere analyse. En For eksempel isolering av sjeldne celler fra kroppsvæsker har viktige indikasjoner for kreft deteksjon og individualisert medisin. 2,3 De mest brukte berikelse teknikker er fluorescerende aktivert celle sortering (FACS ) 4 og magnetisk aktivert celle sortering (MACS), 5 som er avhengige av uttrykt overflate markører for å skille celler. Andre strategier omfatter hydrodynamisk 6 eller treghets 7,8 sortering, optiske pinsetter, 9 acoustophoresis, 10 og dielectrophoresis. 11,12 Dielectrophoresis er bevegelse av et polarisert partikkel i nærvær av et ikke-uniformt elektrisk felt. 13. DEP har vært brukt et bredt spekter av applikasjoner, 2,14 inkludert sortering celler basert på levedyktighet, 15 karakter bioelektriske egenskaper av celler, 16 og sortereing ved induserte endringer i biofysiske egenskaper av cellene. 17,18 Tradisjonelle DEP benytter plane elektroder mønstret i et mikrofluidkanal for å anvende en spenning og indusere et ikke-uniformt elektrisk felt. 13. Selv om dette er en kraftfull teknikk, kan utfordringer oppstår, så som elektrode delaminering og elektrolyse. Isolator-baserte dielectrophoresis (iDEP) 19 har adressert utfordringene i begroing, elektrode delaminering, og romlig nedbrytning av elektroden feltet gjennom mønster isolerende strukturer som induserer uensartet i en DC elektrisk felt. iDEP har vært brukt for selektivt å separere levende og døde bakterieceller, 19 isolere bakteriesporer, 20 og manipulere DNA, 21 blant andre anvendelser. Joule oppvarming kan være en utfordring fordi det kan forekomme som et resultat av den høye likespenning ofte nødvendig. For å bøte disse utfordringene, har kontaktfrie DEP Microdevices blitt utviklet. 22-24
<p class = "jove_content"> Teknikken presenteres her benytter kontaktløs dielectrophoresis (cDEP), så kalt for mangelen på direkte kontakt mellom metallelektroder og prøven kanal. 22 Unikt for denne strategien er utskifting av metalliske elektroder med væskeelektrode kanaler fylt med en svært ledende løsning. Disse fluid elektroder er kapasitivt koblet over en tynn isolerende barriere for prøven kanalen via en vekselspenning. Eliminere prøven kontakt med elektroder reduserer problemene forbundet med DEP-baserte metoder som elektrolyse og bobledannelse, prøvekontaminering, og elektroden delaminering. Som et resultat, er cDEP spesielt nyttig for biologiske prøver fordi den støtter levedyktighet av cellene i prøven. Viktigere, kan cDEP opprettholde prøven sterilitet. En brikken kan fremstilles i en cellekultur hette og eksperimentet kan gjennomføres uten at det kreves prøvekontakt til metallelektroder eller krever at prøven være åpen for environment. En enkel reservoar kan festes til chip uttaket til rette for sterilt prøve utvinning. I tillegg er fremstillingen av fluid elektroder av samme biokompatibel polymermateriale (PDMS) som prøven kanalen reduserer de høye kostnadene som påløper med tilpasset mønster av metallelektroder, den tid som er nødvendig for bearbeiding, og begrenser behovet for spesialisert renrommet utstyr til det første mønster av gjenbruk silisium wafer stempel.Bevegelse av partiklene på grunn av DEP avhenger av egenskapene til partikkelen og mediet, så vel som de romlige gradienter av det elektriske felt. En partikkel-og frekvens-avhengig faktor, kalt Clausius-Mossotti (CM) faktor, tar en verdi i området -0,5 til 1, og bestemmer retningen av DEP kraft. Den frekvensen som CM faktor er nøyaktig null kalles crossover frekvens. Dette er det punkt hvor ingen dielectrophoretic kraft utøves på en partikkel, og den CM faktor endringer kretsen. En single overgangsfrekvensen for inerte faste mikrosfærene oppstår når CM faktor endres fra negativ til positiv 25 For pattedyrceller i lav ledningsevne buffer av størrelsesorden på 0,01 S / m, en første delefrekvens som indikerer en overgang fra NDEP til pDEP eksisterer i nærheten av 10. – 100 kHz, og er påvirket av størrelsen, formen, cytoskjelett og membranegenskaper i cellen. 26,27 En andre delefrekvens ved en forskyvning fra pDEP til NDEP regime er av størrelsesorden 10 MHz, og er påvirket av den kjerne-cytoplasma-forhold, cytoplasma ledningsevne, og endoplasmatiske retikulum. 27. DEP kraft kan påføres uten tilstedeværelse av strømning, men her benytte et strømmende fluid for å oppnå kontinuerlig sortering av suspenderte partikler. Den kombinerte påvirkning av den dielectrophoretic kraft og Stokes 'drag force diktere translasjonsbevegelse av en partikkel.
Vi har utviklet enheter for drift i to frekvensområder. Høyere frequency enheter (100-600 kHz) har operert ved hjelp pDEP og oppnådde batch sortering av celler, som for eksempel prostata tumor initiere celler (tics), murine eggstokk overflaten epitel (Mose) celler, MDA-MB-231 brystkreftceller, eller leve THP -1 celler ved selektivt fangst celler av interesse på isolerende innlegg lokalisert i utvalget kanalen. 28-31 lavere frekvens (5-100 kHz) enheter kontinuerlig drift, og når den kjøres på en frekvens der en befolkning opplever pDEP mens bakgrunnen befolknings opplevelser NDEP, kan omdirigere partikkelbaner for å oppnå sortering. 32-34 Disse lavfrekvente enhetene er benyttet for å sortere kreftceller fra røde blodlegemer, og bestemme endringer i de dielektriske egenskaper av en progressiv MOSE cellelinje, og for å belyse virkningene av ikke- giftige sphingolipid behandlinger på rygging aggressive karakteristikkene av aggressive Mose celler. I tillegg kan cDEP Microdevices være konstruert for å operere på økt gjennomstrømning, for tiden opp til en ml / tr. 31,35
Som beskrevet, fleksibilitet og lave kostnader for fabrikasjonsprosessen muliggjør skreddersydde enhets geometrier, som tillater frem eksperimentell prosedyre for å være relevant for et bredt spekter av anvendelser. Det langsiktige målet med cDEP er å realisere label-fri celle sortering og berikelse på et klinisk nivå, med sample gjenoppretting for etterfølgende kultur eller foredling. Teknikken som presenteres her er en enkel og billig metode, fra fabrikasjon til eksperimentering, noe som øker tilgjengeligheten av DEP. Vi viser fremstilling av en cDEP chip og den eksperimentelle protokollen for å oppnå karakterisering og berikelse av eggstokkreft celler fra fluorescerende sfærer.
DEP er en kraftfull teknikk for bestemmelse av dielektriske egenskaper til partiklene, og å styre partikkelbevegelse mot sortering, isolasjon, eller berikelse anvendelser. På grunn av den skadelige effekten av direkte berøring med elektroden et eksempel, andre har tatt metoder som ligner på den tidligere presenterte fremgangsmåte for å unngå kontakt. For eksempel, Bashir et al. Utviklet kontaktfrie DEP enheter ved hjelp av en mikrofluid PDMS enhet atskilt fra kretskort elektroder av en tynn glass dekkglass, og denne teknikken er også gjort tilgjengelig i videoformat. 23,36
Her har vi vist fremstillingen av en cDEP chip og fluidic elektroder ved hjelp av en enkelt PDMS-substrat, og den eksperimentelle protokoll for separering av eggstokkreft celler fra en blanding av celler og fluorescent-perler. Den presenterte teknikken har blitt brukt til en rekke mer komplekse og fysiologisk relevante programmer, inkludert sortering live og døde celler, 28 tumor initiere celler fra prostatakreftceller, 30 kreftceller fra fortynnede røde blodceller, 31,32 og skille mellom faser av brystkreft 37 og eggstokk-kreft. 29. cDEP har også blitt benyttet for å blande partikler. 38. Disse applikasjoner tyder på at ved hjelp av enkel teknikk presentert, kan diverse formål oppnås ganske enkelt ved å endre utformingen av kanalgeometri.
. DEP er nyttig på mikroskala for manipulering av partikler 13 For sfæriske partikler, det translasjonelle dielectrophoretic kraften avhenger av størrelsen og elektriske egenskaper for partikkelen og den suspenderende medium, samt en gradient av det elektriske felt kvadrert:
hvor ε m er permittiviteten av de suspenderende medium, r er radiustil partikkelen, og Rc [k (ω)] er den reelle delen av Clausius-Mossotti (CM)-faktor. CM faktoren er et mål på den relative polarizability av partikkelen i forhold til suspensjonsmediet, og bestemmer retningen av dielectrophoretic kraft. Det er beskrevet som
der og er de komplekse permittivities av partikkelen og medium, respektivt. Komplekset permittiviteten, , Avhenger av ledningsevne (σ) og frekvens (ω). Den CM faktor av sfæriske partikler er teoretisk bundet mellom -0,5 og en. Dersom CM faktor er negativ, at partiklene får NDEP fordi mediet er mer polariserbar enn partikkelen, slik at partiklene beveger seg bort fra regionerhøye elektriske felt gradienter. Dersom CM faktoren er positiv, partiklene er mer polariserbar enn mediet og de opplever pDEP der de bevege seg mot områder med høye elektriske felt-gradient.
For biologiske partikler som er nonhomogeneous i struktur, slik som celler, kan Clausius-Mossotti faktoren bli bestemt fra en effektiv verdi for partikkel permittiviteten:
der og er den komplekse permittiviteten av den effektive komplekse permittiviteten til det indre av cellen, slik som i cytoplasma, og plasma membran, henholdsvis. r er radius av cellen, og d er tykkelsen av plasmamembranen 26
Når DEP oppstår med partikler suspendert i enfluid, vil bevegelse av partikkel i forhold til fluidet generere et drag kraft på partikkelen. Denne trekkraften må tas i betraktning ved bestemmelse av den samlede kraft som virker på partikkelen. For de tilfeller av interesse her, viskøse krefter dominerer, og partiklene er antatt sfærisk, liten og beveger seg med forholdsvis lav hastighet, slik at Stokes 'lov drag gir en god tilnærming for drag force:
hvor η er viskositeten til fluidet, er u p hastigheten av partikkelen, og f u er hastigheten av fluidet, som også kan være i bevegelse. Gitt dielectrophoretic kraft, kjent væske-og partikkelegenskaper, og en kjent strømningshastighet, kan balansen mellom trekkraften og den kraft dielectrophoretic løses for å anslå partikkelhastighet. Den skjærhastighet at cellene erfaring bør være under terskelen for når cell lysering kan forekomme.
Karakterisering av de elektriske egenskapene til partiklene er nødvendig for å forutsi og kontrollere hvordan de vil reagere i henhold DEP dem. I dette arbeidet har vi spesielt utnyttet lavfrekvente cDEP med MOSE-L celler til å demonstrere protokollen for å avgjøre første crossover frekvens av celler, og deretter viste kontinuerlig sortering av polystyren perler og MOSE-L celler basert på sine opposisjon DEP svar.
Endring av geometrien av cDEP enheten vil endre den romlige gradienter av det elektriske felt, slik at enheter for å være konstruert for høy-frekvens-eller lavfrekvent drift, og for høy selektivitet og effektivitet for sortering for en bestemt celletype. I tillegg kan store gjennomgangs enheter bli utviklet ved å fabrikere bredere kanaler, 30 kanaler i parallell, 30 eller ved flerlags fabrikasjon 35, hvor elektrode kanaler er vertikalt stablet over og under et forholdsvis dyptprøvekanalen. Tynne membraner danner barriere mellom lagene. Foreløpige tester med enheter fabrikkert i polymethylmethacrylate (PMMA) og polykarbonat (PC) tynne filmer har vist DEP respons av MOSE-L celler. Aktuelle tiltak er underveis for å avgrense multi-lags high-throughput enheter og å forbedre det perifere systemet mot en eventuell plug-and-play-plattform. Å utvide fra den grunnleggende eksperimentell teknikk presentert, kan programmene og spesifikasjoner på enheten være skreddersydd for å passe bestemte krav, som for eksempel sortering versus karakterisering, eller legge prøve reservoarer og en semi-automatisert system til enheten.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes, er støttet delvis av National Science Foundation i henhold Grant No EFRI 0938047, og ved Virginia Tech Institutt for Kritisk Technology og Applied Science (ICTAS). Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til Dr. Eva Schmelz og Dr. Paul Roberts for deres type gave MOSE-L celler. Forfatterne erkjenner Angela Anderson for hennes assistanse med cellekulturer, Caitlan Swaffar for hennes hjelp med redigering av dette dokumentet og forbereder eksperimenter, og alle Bioelectromechanical Systems lab medlemmer.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning, Midland, MI,USA | Sylgard 184 | |
Glass slides | The Microscope Depot | 76079 | 2×3 inch-ground edges |
Microbore PTFE Tubing | Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA | EW-06417-31 | Thin walled 20 gauge, 0.032″ID x 0.056″OD, 100 ft/roll |
Luer-slip plastic syringes | National Scientific company | S7510-1 | |
Needle tip | Howard Electronic instruments | JG20-1.0 | 20 Gauge 1.0″, ID=0.025″ OD=0.036″ |
D(+)-Sucrose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S3-500 | |
D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous | Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ | AC410955000 | |
RPMI-1640 Medium | Quality Biological Inc. | 112-025-101 | |
Calcein AM, Molecular Probes | Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA | C3100MP | excitation wavelength 488/emission wavelength 516 |
Rhodamine B, O | Science Lab | SLR1465-100G | excitation wavelength 540/emission wavelength 625 |
Phosphate buffered saline (10X) | Gbiosciences, St. Louis, MO | RC-147 | |
Leica, inverted light microscope | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DMI 6000B | |
Leica DFC420, color camera | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | Leica DFC420 | |
Function generator | GW Instek, Taipei, Taiwan | GFG-3015 | |
Wideband power amplifier | Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA | AL-50HF-A | |
HFHV Output Transformer | AL-T50-V25/300-F100K-600K | ||
High voltage amplifier | Trek | Model 2205 | |
USB Modular Oscilloscope, 100 MHz | AgilentTechnologies | U2701A | |
Expanded Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001/002 (115/230V) | air plasma |
Scotch Magic tape | 3M | any available width is sufficient | |
1.5 mm puncher | Harris Uni-Core | Z708836-25EA | |
.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
FluoSpheres Sulfate Microspheres | Invitrogen | F8858 | 4.0 μm, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605) |
AZ 9260 photoresist | AZ Electronic Materials | ||
AZ 400 K developer | AZ Electronic Materials | ||
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25% | provided by Virginia Tech cleanroom | ||
Teflon coating | applied using DRIE machine | ||
Silicon wafer | University Wafer | 452 | 100 mm diameter, 500 μm thickness, one side polished (SSP) |
Deep Reactive Ion Etching (DRIE) | Alcatrel | AMS SDE 100 |