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无标记细胞分离与富集通过非接触式介电泳

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DOI：

10.3791/50634

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2013年9月3日

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering and Science, Virginia Tech, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Virginia Tech

本文内容

摘要

非接触式介电泳（cDEP）利用颗粒固有的介电特性实现其分选与富集。流体电极通道取代了传统介电泳中的金属电极，使cDEP适用于对生物颗粒进行无损、无菌的表征与分选。本文演示了如何制备cDEP微装置，并开展细胞表征与分选实验。

摘要

介电电泳（DEP）是指极化粒子在非均匀电场中发生平移运动的现象，可用于不依赖表面标记物来操控微粒的运动。传统上，DEP 装置包含在样品通道中图案化的平面金属电极。这种方法成本较高，且需要专门的洁净室环境。近年来，一种称为无接触介电电泳（cDEP）的无接触方法被开发出来。该方法利用经典的 DEP 原理，通过使用单一聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底分别构建流体电极和样品通道，避免了电极与样品的直接接触，因而可作为一种快速微流控策略，用于微粒的分选与富集。该方法的独特之处在于，电场由含有高导电性液体的流体电极通道产生，这些通道通过一层薄的绝缘屏障与样品通道隔开。由于金属电极不直接接触样品，从而避免了电解、电极剥离和样品污染等问题。此外，该方法还实现了低成本且简单的制造工艺。

因此，cDEP 非常适用于操控敏感的生物颗粒。作用于颗粒上的介电泳力不仅取决于由设备几何结构的可定制设计所产生的电场的空间梯度，还取决于细胞固有的生物物理特性。因此，cDEP 是一种无标记技术，无需依赖可能在细胞群体中表达水平不一的表面分子生物标志物，同时仍可实现对生物颗粒的表征、富集与分选。

本文展示了使用互补介电泳（cDEP）进行器件制备和实验的基本方法。我们介绍了利用软光刻技术简单制备cDEP芯片的过程。随后讨论了表征粒子或细胞交叉频率的实验步骤，该频率即介电泳力为零时的频率。最后，我们演示了该技术在分离卵巢癌细胞与荧光微球（微珠）混合物中的应用。

引言

生物样本富集和颗粒分选通常是后续分析所必需的。1 例如，从体液中分离稀有细胞在癌症检测和个体化医学中具有重要应用。2,3 最常用的富集技术是荧光激活细胞分选（FACS）4 和磁激活细胞分选（MACS）5，这些方法依赖于细胞表面标志物的表达来区分细胞。其他策略包括流体动力学6 或惯性7,8 分选、光镊9、声泳10 和介电电泳11,12。介电电泳是指极化颗粒在非均匀电场中发生移动的现象。13 介电电泳已被广泛应用于多种场景2,14，包括基于细胞活性进行分选15、表征细胞的生物电特性16，以及根据细胞生物物理特性的诱导变化进行分选17,18。传统的介电电泳技术利用在微流控通道内图案化的平面电极施加电压，从而产生非均匀电场。13 尽管这是一种强大的技术，但仍可能面临一些挑战，例如电极脱层和电解现象。基于绝缘体的介电电泳（iDEP）19 通过设计绝缘结构，在直流电场中引入非均匀性，解决了污染、电极脱层以及电极场空间退化等问题。iDEP 已被用于选择性分离活菌与死菌细胞19、分离细菌孢子20 以及操控 DNA21 等多种应用。焦耳热效应可能构成挑战，因为它常因所需的高直流电压而产生。为缓解这些问题，已开发出无接触式介电电泳微装置22-24。

本文介绍的技术利用了非接触式介电泳（cDEP），其名称源于金属电极与样品通道之间无直接接触。22 该策略的独特之处在于，用充满高导电性溶液的流体电极通道替代了传统的金属电极。这些流体电极通过交流电压，经由一层薄的绝缘屏障以电容耦合方式与样品通道相连。由于消除了样品与电极的直接接触，从而减少了介电泳方法中常见的问题，如电解和气泡产生、样品污染以及电极剥离。因此，cDEP 特别适用于生物样品，因为它能够维持样品中细胞的活性。重要的是，cDEP 能够保持样品的无菌状态。芯片可在细胞培养超净台中制备，实验过程无需样品接触金属电极，也无需将样品暴露于环境中。只需在芯片出口处连接一个简单的储液池，即可实现无菌样品回收。此外，流体电极与样品通道均采用相同的生物相容性聚合物材料（PDMS）加工而成，这降低了定制金属电极图案所带来的高昂成本，缩短了制备时间，并将对专用洁净室设备的需求限制在可重复使用的硅模板的初始制备阶段。

由于介电泳（DEP）引起的粒子运动取决于粒子和介质的特性，以及电场的空间梯度。一个与粒子和频率相关的因子，称为 Clausius-Mossotti（CM）因子，其取值范围为 -0.5 到 1，决定了介电泳力的方向。CM 因子恰好为零时的频率被称为交叉频率，此时粒子不受介电泳力作用，且 CM 因子发生符号改变。对于惰性固体微球，当 CM 因子由负变正时，出现单一的交叉频率25。对于悬浮在电导率约为 0.01 S/m 的低电导缓冲液中的哺乳动物细胞，存在第一个交叉频率，指示由负介电泳（nDEP）向正介电泳（pDEP）的转变，该频率位于 10–100 kHz 附近，并受细胞的大小、形状、细胞骨架及膜特性的影响26,27。第二个交叉频率出现在由 pDEP 向 nDEP 转变的区域，频率数量级约为 10 MHz，受核质比、细胞质电导率和内质网的影响27。介电泳力可在无流体流动的情况下施加，但本文中我们利用流动的流体实现悬浮粒子的连续分选。粒子的平移运动由介电泳力与斯托克斯拖曳力共同决定。

我们已开发出可在两个频率范围内运行的装置。高频装置（100–600 kHz）利用正介电泳（pDEP）运行，通过在样品通道内的绝缘柱上选择性捕获目标细胞，实现了细胞的批量分选，例如前列腺肿瘤起始细胞（TICs）、小鼠卵巢表面上皮（MOSE）细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞或活化的THP-1细胞28–31。低频装置（5–100 kHz）可连续运行，当某一细胞群在特定频率下经历正介电泳（pDEP），而背景细胞群经历负介电泳（nDEP）时，可改变颗粒的运动轨迹以实现分选32–34。这些低频装置已被用于从红细胞中分离癌细胞、测定渐进性MOSE细胞系介电特性的变化，以及阐明非毒性鞘脂处理对逆转侵袭性MOSE细胞恶性特征的影响。此外，交叉介电泳（cDEP）微装置可设计为实现更高的通量，目前最高可达1 ml/hr31,35。

如所述，该制备工艺具有灵活性高、成本低的特点，能够实现定制化的器件结构设计，从而使本实验方法适用于多种应用场景。cDEP 的长期目标是实现在临床水平上的无标记细胞分选与富集，并可对样本进行回收以用于后续培养或处理。本文介绍的技术从器件制备到实验操作均简便且经济，提高了介电泳（DEP）技术的可及性。我们展示了cDEP芯片的制备方法以及实验操作流程，以实现卵巢癌细胞与荧光微球的分离与富集。

方案

1. 原型介电电泳微流控器件的制备：概述

  1. 采用光刻胶和深反应离子刻蚀（DRIE）技术，按照先前报道的步骤22将设计好的微通道结构（图1）刻蚀到硅片上（图2）。沉积一层薄的聚四氟乙烯（Teflon）以改善微器件从硅片上的释放性能。

微流控芯片示意图，显示汇电极/源电极、尺寸及流体流动路径分析。
图1. 低频连续分选装置示意图。 样品通道从左至右延伸，宽度为500 μm，在锯齿状收缩区域缩窄至100 μm。两对流体电极通道分别构成源电极和汇电极，通过一层20 μm厚的PDMS屏障与样品通道隔开。

光刻工艺示意图：紫外光曝光、硅片上光刻胶图形化、PDMS 模塑步骤。
图 2. cDEP 装置的制备工艺。 (a) 紫外光通过cDEP装置几何形状的掩模图案照射光刻胶，反应持续60秒。 (b) 使用显影液去除光刻胶。 (c) 采用深反应离子刻蚀（DRIE）技术刻蚀出深50 μm的结构，并在70 °C条件下使用25%的四甲基氢氧化铵（TMAH）进行5分钟湿法刻蚀，以降低侧壁粗糙度。 (d) 涂覆特氟龙涂层，以改善装置从晶圆上的释放性能。 (e) 去除气泡后，将PDMS浇注到可重复使用的晶圆模板上，并在100 °F条件下固化45分钟。 (f) 将PDMS从晶圆上剥离。将PDMS和一块洁净的玻璃载片暴露于空气等离子体中2分钟，然后键合在一起。

  1. 用铝箔包裹硅片，以防止溢出。按10:1的弹性体与固化剂比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS），脱气约20分钟，然后浇注到硅片上。在100 °C下加热45分钟，以避免损坏印章的聚四氟乙烯涂层。让装置冷却至室温。
  2. 冷却后，取下铝箔，使用手术刀修剪PDMS，并用与管路尺寸匹配的钝头打孔器在微通道的入口/出口处打孔。此处使用1.5 mm的钝头打孔器。
  3. 依次用肥皂水、乙醇、去离子水冲洗玻璃载玻片，并用空气吹干。使用透明胶带清洁PDMS装置。在显微镜下检查，确保通道清洁无污染。将玻璃载玻片和PDMS装置暴露于空气等离子体中处理2分钟。将装置的通道面紧密压合到玻璃载玻片上，避免装置与载玻片之间产生气泡（图3）。

用于微波光子学研究的带有微带线结构的光子电路图。
图 3. (a) 在硅片印章制备过程中用于光刻的掩模版，以及 (b) 制备完成的 PDMS-玻璃器件，其中样品通道和流体电极通道分别填充了绿色和红色食用色素。尺寸信息见 图 1。点击此处查看高清大图。

2. 在DEP缓冲液中制备细胞悬液

  1. 配制低电导率（100 μS/cm）缓冲液，以下简称“DEP缓冲液”（8.5% 蔗糖 [w/v]、0.3% 葡萄糖 [w/v]、0.725% RPMI [v/v]）。16
  2. 将细胞重悬于DEP缓冲液中，浓度为3 × 106 个细胞/ml。本实验使用晚期癌变的小鼠卵巢表面上皮（MOSE-L）细胞。

注意：通过台盼蓝染料排斥法进行的细胞活力分析显示，早期阶段MOSE（MOSE-E）细胞在室温下悬浮于DEP缓冲液中5小时后，活力略有下降（从95.1%降至91.6%）。预计MOSE-L细胞也会出现类似的活力轻微下降，表明细胞不宜在DEP缓冲液中长期储存。

  1. 使用荧光膜通透性染料（如酶激活型Calcein AM）对细胞进行染色。
  2. 测定染色后细胞悬液的电导率，电导率应约为100 μS/cm。若电导率过高，将样品离心沉淀，重新悬浮于DEP缓冲液中（浓度为3 × 106 cells/ml），并重复电导率测定。

3. 加载 cDEP 微流控芯片

  1. 将微流控芯片置于真空环境中 30 分钟。
  2. 同时，裁剪一段柔性管路，使其长度足以从注射泵延伸至放置微流控芯片的显微镜载物台。此处需要一段 6 英寸长的管路。将管路连接至注射器针头末端。
  3. 通过将目标收集样品体积除以管路的横截面积，估算出口管路所需的长度。按计算长度裁剪管路。
  4. 将细胞悬液吸入注射器中。检查管路和注射器内是否存在气泡。
  5. 将芯片从真空环境中取出后，立即插入出口管路，并迅速对样品通道进行引液，以避免通道内滞留空气气泡。引液时轻轻敲击注射器，以防止破裂厚度仅为 20 μm 的绝缘屏障；但已有观察表明，该屏障在接近 5 ml/hr 的持续高流速下仍可保持不破裂。
  6. 为引液电极通道，迅速将未装液体的移液枪头插入每个流体电极通道的一个出口端。向另一端缓慢加入含少量罗丹明 B 的 PBS 溶液 200 μl，并轻轻敲击以使液体进入电极通道。持续施加轻微压力，直至含罗丹明 B 的 PBS 溶液明显上升至空移液枪头的尖端。对每个电极通道重复此操作。罗丹明 B 仅用于荧光可视化观察流体电极通道。
  7. 引液完成后，用含罗丹明 B 的 PBS 溶液填充每个移液枪头储液端。避免在移液枪头储液端产生气泡，并通过轻柔地上下吸液去除任何可见气泡。断开出口管路并妥善弃置，随后插入新的出口管路储液装置以收集目标体积的样品。

4. 使用 cDEP 芯片表征细胞的交叉频率

  1. 将芯片置于配备数字相机的倒置显微镜载物台上（图4）。

cDEP芯片装置，包含注射泵、显微镜和电极；用于介电泳实验。
图4. (a) cDEP实验的整体装置示意图。cDEP芯片置于倒置显微镜的载物台上。摄像头将图像传输至计算机进行记录。注射泵维持恒定的入口流速。信号发生器产生的信号经高压放大器升压后，通过导线电极连接至cDEP芯片。示波器用于监测输送至芯片的信号。(b) cDEP芯片及其流体与电子连接部分的细节图。点击此处查看高清图像。

  1. 将注射器安装到注射泵上，并将导线电极插入微流控电极通道的储液区。
  2. 以 1 ml/hr 的流速泵送液体，确保注射泵与注射器之间接触良好。目视检查整个通道长度，确保细胞流动无阻碍，且无气泡或泄漏。随后将流速降低至 0.005 ml/hr。
    注意： 在其他几何结构的装置中，已实现高达 1 ml/hr31,35 的通量。
  3. 出于安全考虑，先接通函数发生器、高压放大器和示波器的电源，调节至所需的电压和频率，以测试电子设备性能。本实验中，这些参数设置为 200 V 和 20 kHz。确认设备运行正常后，关闭电源。将电极连接至高压放大器。
    注意： 操作本实验所用的高电压电子设备时，应遵守适当的电气安全规程。
  4. 当流动达到稳定状态后，施加设定频率下的目标电压。本实验中，电压为 200 VRMS，频率范围为 5–60 kHz。
  5. 使用图像处理技术（步骤 5）记录细胞响应的视频文件，以量化通道内细胞的分布情况，并确定交叉频率。具体操作为：保持电压恒定，系统性地改变频率。在实验开始和结束时，以及在各次实验运行之间随机记录对照组细胞分布，即未施加电场时的细胞分布情况。估算细胞从入口流至监测位置所需的时间（本实验中约为 5 分钟）。每次设定新频率后，等待该时间段，然后开始记录（本实验中记录一段持续 2 分钟的细胞分布视频）。

5. 用于表征交叉频率的图像处理

  1. 使用计算脚本逐帧分析每个视频，确定在通道中高介电泳力区域下游指定 x 坐标处每个荧光细胞或粒子的相对 y 位置（其中 z 方向为通道的垂直深度，y 方向为通道宽度，x 方向为通道长度），并绘制相对分布图。
  2. 将每个电压和频率下的分布中心线与对照分布的中心线进行比较。对于给定电压和不同频率的情况，确定交叉频率，即分布中心线与对照组 y 位置相匹配时的频率。

6. 改变实验以进行细胞分选或富集

  1. 将所需混合物悬浮于DEP缓冲液中，总体浓度为3 x 106 个颗粒/ml。此处，该混合物为MOSE-L细胞与4 μm荧光微珠的混合物，溶于DEP缓冲液中。按照先前所述步骤准备cDEP装置。
  2. 为从混合物中分选或富集细胞，需如前所述确定目标细胞与背景颗粒的交叉频率。实验操作频率应设定在目标细胞与背景颗粒的两个交叉频率之间，使两类颗粒所受介电泳力方向相反。分选MOSE-L细胞与4 μm微珠时，应将微装置工作频率设定在11.90±0.63 kHz以上，此为Salmanzadeh et al.33近期报道的MOSE-L细胞的第一个交叉频率。
  3. 为收集分选后样品的内容物，在收集目标体积时，用手指套住出口孔并轻轻拉出出口管路，即可移除出口端的管路。将收集到的目标体积转移至储液器中，用于后续分析。注意：其他样品回收方法可包括在芯片上连接一个永久性储液器，并通过简单移液方式取出样品。

结果

应通过定性观察样品通道中是否出现介电泳（DEP）现象，以确认在施加电场时装置正常工作。检测DEP存在的一种方法是将频率调节至远离交叉频率的数值，在这些频率下可预测到显著的正介电泳（pDEP）和负介电泳（nDEP）效应（对于缓冲液电导率为100 μS/cm的大多数哺乳动物癌细胞而言，通常在>40 kHz时观察pDEP，<10 kHz时观察nDEP）。需注意的是，惰性微球在其交叉频率以下表现为pDEP，而在交叉频率以上表现为nDEP。对于本文所述的锯齿状结构特征，在较高测试频率下应观察到细胞的pDEP现象，表现为细胞或颗粒在通道锯齿边缘处形成珠链结构并聚焦；而在较低测试频率下，nDEP现象应表现为细胞被限制在通道直边附近的区域。在这些低频条件下，细胞可能因电穿孔而发生裂解，因此样品中可见细胞数量可能减少，若使用酶激活型荧光染料，可见细胞可能呈现肿大或模糊形态。验证pDEP与nDEP发生的频率，可依据本实验方案所述方法确定交叉频率。对于本研究中使用的哺乳动物癌细胞（如MOSE-L细胞），我们在5 kHz时观察到nDEP（图5a），在60 kHz时观察到显著的pDEP（图5b）。MOSE-L细胞直径为17.7±3.3 μm（n = 268个细胞），微球标称直径为4 μm。关于MOSE-L细胞与肿瘤进展早期阶段MOSE细胞介电特性的全面分析，可参见Salmanzadeh 等33的近期研究。

如果在这些极端条件下未观察到 pDEP 和 nDEP 现象，则可能出现多种问题。样品电导率可能因污染物或细胞裂解而过高。由于气泡滞留在流体电极通道中，导致电流无法传导至与样品通道相邻的通道部分，从而可能无法产生足够的电场。不稳定的流动可能由以下原因引起：注射器或进样管路中滞留气泡；装置未在真空环境下保持足够时间，或撤去真空后未迅速填充而导致产生气泡；聚二甲基硅氧烷（PDMS）与玻璃载片粘合不良导致分层而发生泄漏；填充通道时施加过大的力导致屏障膜撕裂；或流速处于泵工作范围的极限值。

除了确定细胞的交叉频率外，该技术还可用于分离混合物，此处以MOSE-L细胞与微珠的混合物为例进行说明。本示例利用了4 μm微珠在MOSE-L细胞处于正向介电泳（pDEP）频率下所表现出的负向介电泳（nDEP）特性。当设备在200 VRMS和10 kHz条件下运行时（图6a），观察到细胞和微珠均因受到nDEP作用而混合在一起。而在50 kHz条件下，MOSE-L细胞向通道顶部移动，而微珠则被限制在通道的下部区域，从而实现了将混合物分离为两个组分的目的（图6b）。

疏水表面上细胞簇的荧光显微镜图像，突出显示黏附行为。
图 5. 通过改变施加电场的频率来操控 MOSE-L 细胞的位置。 图像拍摄于样品通道末端的锯齿状结构处，流体电极位于右侧角落。电极中充满含有罗丹明 B 的磷酸盐缓冲液（PBS），通过荧光显示通道结构。(a) 在 200 VRMS 和 5 kHz 条件下，MOSE-L 细胞经历负介电泳（nDEP）。(b) 在 200 VRMS 和 60 kHz 条件下，MOSE-L 细胞出现珠链现象并经历正介电泳（pDEP）。点击此处查看高清大图。

凝胶电泳中DNA分子的荧光显微图像，展示分离过程。
图6. 在低频cDEP装置的样品通道中，MOSE-L细胞（绿色）与4 μm微珠（红色）的混合物流经最终的锯齿状结构。 (a) 在200 V和10 kHz条件下，细胞与微珠混合。箭头指示的是因低频条件可能已死亡而呈现微弱信号的细胞。(b) 在200 V和50 kHz条件下，细胞经历正介电泳（pDEP）并移向通道结构边缘，而微珠经历负介电泳（nDEP）并保持在靠近直边区域的位置。 点击此处查看高清图像。

讨论

介电泳（DEP）是一种用于测定颗粒介电特性并引导颗粒运动以实现分选、分离或富集应用的强大技术。由于电极直接接触样品会产生不利影响，其他研究者已采用与前述方法类似的方式以避免接触。例如，Bashir 等人通过使用微流控PDMS装置，并将其与印刷电路板电极之间用一层薄玻璃盖片隔开，开发出了无接触式DEP装置，该技术也以视频形式提供。23,36

本文展示了如何使用单一PDMS基底制备cDEP芯片和流体电极，以及从细胞与荧光微珠的混合物中分离卵巢癌细胞的实验方案。该技术已成功应用于多种更复杂且具有生理相关性的场景，包括活细胞与死细胞的分选28、从前列腺癌细胞中分离肿瘤起始细胞30、从稀释的红细胞中分离癌细胞31,32，以及区分乳腺癌37和卵巢癌29的不同发展阶段。cDEP还被用于颗粒的混合38。这些应用表明，通过采用本文所介绍的简单技术，仅需改变通道几何结构的设计，即可实现多种不同的目的。

介电泳（DEP）在微米尺度上对粒子的操控具有重要应用价值。13 对于球形粒子，其平移介电泳力取决于粒子及其悬浮介质的尺寸和电学性质，同时也依赖于电场平方的梯度：

介电泳方程；电场相互作用公式；高级物理概念。
其中 εm 为悬浮介质的介电常数，r 为颗粒半径，Rc[k(ω)] 为 Clausius-Mossotti（CM）因子的实部。CM 因子用于衡量颗粒相对于悬浮介质的相对极化率，并决定介电泳力的方向。其表达式为

光学激发公式，\(K(\omega) = \frac{(\varepsilon_p^* - \varepsilon_m^*)}{(\varepsilon_p^* + 2\varepsilon_m^*)}\)。
其中 ε<sub>p</sub><sup>*</sup> 符号；用于材料科学方程和热力学分析。 和 静态平衡，εᵐ* 符号，物理学中的公式，用于教学目的的方法学图示。 分别为粒子和介质的复介电常数。复介电常数 复介电常数公式 ε*=ε+σ/jω，用于电磁分析。 取决于电导率（σ）和频率（ω）。球形粒子的克劳修斯-莫索提因子（CM因子）在理论上介于 -0.5 和 1 之间。若CM因子为负值，则粒子经历负介电泳（nDEP），因为介质的极化能力高于粒子，导致粒子向电场梯度较低的区域移动；若CM因子为正值，则粒子的极化能力高于介质，此时粒子经历正介电泳（pDEP），向电场梯度较高的区域移动。

对于结构非均一的生物颗粒（如细胞），可以从颗粒介电常数的有效值来确定 Clausius-Mossotti 因子：

静态平衡方程；层状球体中的介电常数；公式分析
其中 静态平衡；公式 ε*cyt；符号表示；教育、研究用途 和 静态平衡公式，ε*mem，与光谱分析中的膜电位相关 分别为细胞内部（如细胞质）和细胞质膜的有效复介电常数；r 为细胞半径，d 为质膜厚度。26

当悬浮在流体中的粒子发生介电电泳（DEP）时，粒子相对于流体的运动将在粒子上产生拖曳力。在确定作用于粒子的总力时，必须考虑该拖曳力。在本文所关注的情况下，黏性力占主导地位，且假设粒子为球形、尺寸较小，并以相对较低的速度运动，因此斯托克斯拖曳定律可对拖曳力提供良好的近似：

拖曳力方程，\( \vec{F}_{\text{Drag}}{=}6\pi\eta r(\vec{u}_p{-}\vec{u}_f) \)，物理公式。
其中 η 为流体的黏度，up 为颗粒的速度，uf 为流体的速度，流体本身也可能处于运动状态。已知介电泳力、流体与颗粒的性质以及流速时，可通过求解拖曳力与介电泳力之间的平衡关系，估算颗粒的速度。细胞所经历的剪切速率应低于导致细胞裂解发生的阈值。

表征颗粒的电学特性对于预测和控制其在介电电泳（DEP）条件下的响应行为至关重要。在本研究中，我们特别采用低频交流介电电泳（cDEP）处理MOSE-L细胞，以演示测定细胞第一 crossover 频率的实验方案；随后，基于聚苯乙烯微球与MOSE-L细胞相反的介电电泳响应，实现了两者的连续分选。

改变cDEP装置的几何结构会改变电场的空间梯度，从而可设计适用于高频或低频操作的装置，并针对特定细胞类型实现高选择性和高分选效率。此外，通过制造更宽的通道30、并行通道30，或采用多层制造技术35，可开发高通量装置；在多层制造中，电极通道在较深的样品通道上下垂直堆叠，薄层膜构成各层之间的屏障。在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚碳酸酯（PC）薄膜中制造的装置的初步测试已证实了MOSE-L细胞的介电泳（DEP）响应。目前的研究工作正在致力于优化多层高通量装置，并改进外围系统，以最终实现即插即用的平台。在本实验基本技术的基础上，可针对特定需求定制装置的应用和规格，例如用于分选或表征，或在装置中增加样品储液池和半自动化系统。

披露

Rafael Davalos 博士拥有一项关于非接触式介电电泳的待批专利。

致谢

本工作部分得到了国家科学基金会（资助号：EFRI 0938047）以及弗吉尼亚理工学院关键技术和应用科学研究所（ICTAS）的支持。作者谨向Eva Schmelz博士和Paul Roberts博士致以诚挚谢意，感谢他们慷慨提供MOSE-L细胞。作者还感谢Angela Anderson在细胞培养方面的协助，Caitlan Swaffar在文档编辑和实验准备中的帮助，以及生物机电系统实验室全体成员的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）Dow Corning, Midland, MI,USASylgard 184
载玻片The Microscope Depot760792x3 英寸磨边
微孔聚四氟乙烯（PTFE）管Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USAEW-06417-31薄壁20号，内径0.032" × 外径0.056"，每卷100英尺
鲁尔滑动塑料注射器National Scientific companyS7510-1
针头尖端Howard Electronic instrumentsJG20-1.020号，长度1.0"，内径=0.025"，外径=0.036"
D(+)-蔗糖Fisher Scientific, Fair Lawn, NJS3-500
D(+)-葡萄糖，分析纯试剂，无水Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJAC410955000
RPMI-1640培养基Quality Biological Inc.112-025-101
钙黄绿素AM，Molecular ProbesInvitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USAC3100MP激发波长488 nm / 发射波长516 nm
罗丹明B，OScience LabSLR1465-100G激发波长540 nm / 发射波长625 nm
磷酸盐缓冲液（10倍浓缩液）Gbiosciences, St. Louis, MORC-147
Leica倒置光学显微镜Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USALeica DMI 6000B
Leica DFC420彩色相机Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USALeica DFC420
函数发生器GW Instek, 中国台湾GFG-3015
宽带功率放大器Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USAAL-50HF-A
高频高压输出变压器AL-T50-V25/300-F100K-600K
高压放大器TrekModel 2205
USB模块化示波器，100 MHzAgilentTechnologiesU2701A
扩展型等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001/002 (115/230V)空气等离子
Scotch Magic透明胶带3M任意可用宽度均可
1.5 mm打孔器Harris Uni-CoreZ708836-25EA
0.25%胰蛋白酶-EDTAInvitrogen25200-056
FluoSpheres硫酸酯微球InvitrogenF88584.0 μm，红色荧光（激发波长580 nm / 发射波长605 nm）
AZ 9260光刻胶AZ Electronic Materials
AZ 400 K显影液AZ Electronic Materials
25%四甲基氢氧化铵（TMAH）由弗吉尼亚理工大学洁净室提供
聚四氟乙烯（Teflon）涂层使用深反应离子刻蚀（DRIE）设备涂覆
硅晶圆University Wafer452直径100 mm，厚度500 μm，单面抛光（SSP）
深反应离子刻蚀（DRIE）AlcatrelAMS SDE 100

参考文献

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