Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.
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Articolo metodologico
Approcci genetici in avanti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Chlamydia trachomatis, l'agente eziologico di malattie sessualmente trasmissibili e infezioni oculari, rimane poco caratterizzato per la sua intrattabilità di trasformazione sperimentale con il DNA ricombinante. Abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica in C. trachomatis, nonostante la mancanza di strumenti di genetica molecolare. Il nostro metodo prevede: i) la mutagenesi chimica per generare rapidamente ampie librerie di mutanti geneticamente definiti con fenotipi distinti; ii) il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) per mappare le lesioni genetiche sottostanti e di trovare associazioni tra gene mutato (s) e.. un fenotipo comune,. iii) generazione di ceppi ricombinanti attraverso la co-infezione di cellule di mammifero con batteri tipo mutante e selvaggio. Di conseguenza, siamo stati in grado di stabilire relazioni causali tra genotipi e fenotipi. L'accoppiamento di variazione del gene indotto chimicamente e WGS per stabilire associazioni genotipo-fenotipo correlativi should essere ampiamente applicabile alla lunga lista di medico ed ecologicamente importanti microrganismi attualmente intrattabili per l'analisi genetica.
Introduzione
Le intracellulare obbligato batterio Chlamydia trachomatis conti per una stima di 2,8 milioni di infezioni del tratto genitale ogni anno negli Stati Uniti (Center for Disease Control) con associata sequele come la malattia infiammatoria pelvica, gravidanze ectopiche e sterilità (1). Chlamydia spp hanno un unico fisiologia con un ciclo di sviluppo bifasico costituito da due forme: il corpo elementare infettiva ma non replicante (EB) e il corpo reticolato non infettiva ma replicativa (RB). Infezione inizia con l'attaccamento di EBS per cellule epiteliali seguite da endoctyotosis (2). All'interno di un vacuolo di membrana chiamato un'inclus....
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Protocollo
1. Mutagenesi chimica
Nota: Abbiamo trovato che la forma replicativa RB è più suscettibile di mutagenesi chimica rispetto alla forma EB. A metà ciclo (tra i 18 a 20 HPI), RBS sono a maggior numeri precedenti RB-EB transizione. Poiché Chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligato, gli effetti del mutageno sulla salute dell'ospite può limitare recupero batterica. Cellule Vero sono stati trovati per essere più resistenti agli effetti negativi di livelli elevati di SME che altre linee cellulari testate.
Separazione delle mutazioni di ricombinazione richiede la selezione di progenie ricomb....
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Risultati
L'esposizione a mutageno porta a inclusioni che appaiono privi di batteri, presumibilmente a causa di morte delle cellule batteriche. Tipicamente, sierotipo LGV-L2 sarà completamente lisare le cellule infette entro 48 ore dopo l'infezione, ma il trattamento con agenti mutageni può estendere questo ciclo di> 90 h. Circa il 10% delle inclusioni sono tenuti a recuperare. Nei nostri esperimenti, cellule Vero infettate trattati con 20 mg / ml di EMS portato ad una diminuzione del 99% nel recupero della progenie in.......
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Discussione
Questa metodologia soddisfa i requisiti di base per l'analisi genetica in quanto stabilisce il collegamento tra genotipi e fenotipi. È importante sottolineare che questo è realizzato senza l'ausilio di strumenti molecolari convenzionali per la trasformazione del DNA ricombinante e inattivazione inserzionale di geni nei batteri, che è spesso una tappa limitante nell'analisi della funzione del gene in microbi non-modello.
Un passo fondamentale è quello di garantire clonalità di mut.......
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Dichiarazioni
Non c'è nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Etilmetansolfonato (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cicloesamemide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con 0,493 mM di MgCl2 e 0,901 mM di CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| M NaOH | |||
| 5x SPG tampone (1,25 M saccarosio, 50 mM di fosfato di sodio, 25 mM di acido glutammico) | |||
| Tampone SPG (0,25 M di saccarosio, 10 mM di fosfato di sodio, 5 mM di acido glutammico) | |||
| Acqua (sterile, grado di coltura tissutale) | |||
| 2x DMEM (preparato da polvere, tamponato con 7,4 g/L di bicarbonato di sodio | Sigma | D7777 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1,2% GTG Agarosio, autoclavato | Lonzo | 50070 | |
| Kit di purificazione del DNA genomico | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Etanolo (grado di biologia molecolare) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0,1 M HEPES ( 4-(2-idrossietil)-1- piperazinaetansolfonico) tampone | |||
| 25 cm2 fiasche per coltura tissutale (matracci T25) | |||
| piastre | |||
| coltura tissutale a 96 pozzetti | |||
| cappa | |||
| cappa | |||
| >Centrifuga e adattatori per la filatura di piastre | |||
| >Microscopio | |||
| Fluorimetro (Qubit) | Strumento Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 | Covaris |
Riferimenti
- Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).
- Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. ....
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Ristampe e permessi
