Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.
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Articolo metodologico
Promozione della sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali con fibrina e fattore di crescita Cocktails dopo gravi lesioni del midollo spinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in neuroni e glia. NSC trapiantate possono sostituire i neuroni persi e glia dopo la lesione del midollo spinale (SCI), e possono formare relè funzionali di ri-collegare segmenti del midollo spinale sopra e sotto una lesione. Precedenti studi innesto cellule staminali neurali sono stati limitati dalla sopravvivenza dell'innesto incomplete all'interno del midollo spinale cavità lesione. Inoltre, il monitoraggio della sopravvivenza cellulare dell'innesto, differenziazione, e l'estensione processo non era stata ottimizzata. Infine, in studi precedenti, NSC ratto coltivate erano tipicamente riferite a differenziarsi in cellule gliali quando innestato al midollo spinale danneggiato, piuttosto che neuroni, salvo destino è stato guidato per un tipo cellulare specifico. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato nuovi metodi per migliorare la sopravvivenza, l'integrazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali ai siti di ancora grave SCI. NSC sono stati appena isolati da embrionale giorno 14 del midollo spinale (E14) da un transgenico Fischer 344 linea di ratto stabile esprimere fl verdeuorescente proteina (GFP) e sono stati incorporati in una matrice di fibrina contenente fattori di crescita; questa formulazione mirava a conservare cellule innestate nella cavità lesione e supportare la sopravvivenza cellulare. NSC in fibrina / fattore di crescita cocktail sono stati impiantati due settimane dopo toracico livello 3 (T3) completi transections midollo spinale, evitando periodi di picco di infiammazione. Innesti risultanti completamente riempito la cavità della lesione e differenziate in entrambi i neuroni, che si estendevano assoni nell'ospite midollo spinale sopra straordinariamente lunghe distanze, e glia. Innesti di cellule staminali neurali umane in coltura che esprimono GFP portato a risultati simili. Così, i metodi sono definiti per migliorare neurale innesto di cellule staminali, la sopravvivenza e l'analisi dei risultati in vivo.
Introduzione
Lesioni del midollo spinale (SCI), spesso danni non solo tratti di sostanza bianca che trasportano i segnali da e verso il cervello, ma anche la materia grigia centrale, causando la perdita segmentale degli interneuroni e motoneuroni. La conseguenza di SCI è perdita sia funzioni motorie e sensoriali sotto della lesione. Purtroppo, il sistema nervoso centrale adulto (CNS) non rigenera spontaneamente, con conseguente deficit funzionali permanenti 1. Pertanto, la ricostruzione dei feriti midollo spinale adulto e il miglioramento in motoria, sensoriale e della funzione autonomica è un obiettivo importante della ricerca SCI. Cellule staminali neurali (NSC), sia direttamente isolata da embrionale o adulto CNS, sono cellule candidati validi per sostituire i neuroni perduti e glia. Inoltre, queste cellule hanno il potenziale di formare nuovi relè funzionali per ripristinare conduzione assonale attraverso un 2,3 sito della lesione.
Ad oggi, non c'è stata una spiegazione dettagliata del anatomica, electrophysiological ed effetti comportamentali della formazione relè neuronale da cellule staminali neurali trapiantate dopo il grave SCI. Ci sono diverse ragioni per questo: primo, NSC trapiantati o fetale del tessuto del sistema nervoso centrale sopravvivere male quando innestati in grandi cavità della lesione. Precedenti studi mostrano sostanziale perdita di cellule presto, lasciando grandi cavità lesione cistica vuoti 4,5. In alcuni studi le cellule innestate dovessero successivamente dividono e riempire la cavità lesione 4,5, ma questo potrebbe verificarsi dopo un ritardo di giorni o settimane, e successivo riempimento sito della lesione non sia completa o coerente. In secondo luogo, un sistema di monitoraggio efficiente che fornisce dati attendibili sulla sopravvivenza cellulare, differenziamento / maturazione, e di conseguenza trapiantato cellule staminali neurali era carente. La maggior parte dei primi studi utilizzati anterograda e retrograda etichettatura per tracciare le proiezioni assonali di trapianti di 2,3. Tuttavia, queste tecniche solo parzialmente e spesso proiezioni assonale poco chiaro etichettati derivanti da cellule innestate e metodi traccianti sono soggettivit di artefatti di perdite di colorante oltre le cellule impiantate. Altri gruppi utilizzati marcatori neuronali specifici umane per etichettare proiezioni assonale dopo il trapianto di cellule staminali neurali fetali umani in roditori feriti midollo spinale 5,6. Tuttavia, in questi studi, gli xenotrapianti non hanno sempre sopravvivono bene. Recentemente, la consegna virale del gene reporter GFP è stato usato per etichettare le cellule staminali neurali in coltura 7,8. Tuttavia, l'espressione della GFP era spesso incoerente e può essere down-regolato 7. Recentemente, l'uso di topi o ratti donatori transgenici che esprimono stabilmente il gene reporter GFP, o la fosfatasi alcalina placentare umano, ha notevolmente migliorato l'inseguimento di trapiantate neurali cellule staminali / progenitori in vivo 9,11. In terzo luogo, diversi studi indicano che le cellule staminali neurali di ratto coltivate in vitro derivate da embrioni o adulto CNS differenziano esclusivamente in linee gliali quando trapiantati in ambienti della cor midollo intatto o feriti adultid 7,12,13, nonostante il fatto che queste cellule staminali neurali sono capaci di differenziarsi in neuroni e glia sia in vitro, indicando che ambienti locali possono dettare il destino delle cellule staminali. In alternativa, le cellule staminali neurali in coltura, in particolare quelli derivati da SNC adulto, possono avere intrinseche proprietà defaulty di differenziarsi in linee gliali in vivo 13.
A causa delle limitazioni di cui sopra, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo protocollo per migliorare embrionale inseguimento NSC, la sopravvivenza e la differenziazione / maturazione nel midollo spinale adulto gravemente ferito. In breve, abbiamo iniziato con una linea transgenica Fischer 344 ratti Inbreed stabile che esprime un gene reporter GFP che sostiene espressione GFP dopo il trapianto in vivo 14. Successivamente, abbiamo utilizzato NSC appena isolati dal giorno embrionale 14 Fischer 344 midollo spinale, una fase di sviluppo che mantiene il potenziale per generare sia i neuroni e glia. Infine, si conficcaronoNSC appena dissociate in una matrice di fibrina che contiene fattori di crescita 15-17 per mantenere le cellule in modo uniforme e distribuirli all'interno di una grande cavità della lesione, con l'obiettivo di sostenere la sopravvivenza delle cellule del trapianto, differenziazione e integrazione. Gli innesti sono stati collocati in luoghi di T3 resezione completa, due settimane dopo la lesione del midollo spinale. Queste cellule innestate costantemente riempite siti transezione complete e differenziate in neuroni abbondanti che si estendevano gran numero di assoni in molte midollo spinale su lunghe distanze 18. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando colture di innesti di cellule staminali neurali umane immunodeficienza ratti 18.
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Protocollo
Tutti i protocolli animali sono approvati da VA-San Diego Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC). Linee guida NIH da laboratorio la cura e la sicurezza degli animali sono rigorosamente seguite. Gli animali hanno libero accesso a cibo e acqua durante lo studio e sono adeguatamente trattati per ridurre al minimo il dolore e il disagio.
1. Preparazione di fibrina componenti contenenti fattore di crescita Cocktails
- Sciogliere 25 mg di ratto fibrinogeno in 0,5 ml di PBS per ottenere 50 mg / ml 2x soluzione stock (vedi tabella Materials). Il fibrinogeno è difficile da sciogliere e deve essere collocato in un incubatore a 37 ° C o bagnomaria e agitato ogni 5-10 minuti per 1-2 ore.
- Sciogliere 100 ratto trombina delle Nazioni Unite in 2 ml di 10 mM sterile CaCl 2 per ottenere 50 U / ml 2x soluzione stock.
- Sciogliere fattori di crescita in PBS alle seguenti concentrazioni di ottenere 100 microlitri soluzione stock: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (alta concentrazione magazzino in infusione intratecale in vivo 19); 200 mg / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (circa 1.000 x superiore a quello utilizzato per la coltura cellulare).
- Sciogliere 25 mg MDL28170 (inibitore della calpaina) in 1.3 ml di DMSO avere 50 soluzione stock DMSO mM, e poi diluire 50x in PBS per ottenere 1 mM soluzione stock.
- Mescolare 100 ml di ciascun fattore componente di crescita e 100 ml di MDL28170 (soluzione 1 mM) per produrre 1.000 ml soluzione fattore di crescita cocktail (Figura 1).
- Mescolare 500 ml di fibrinogeno 2x soluzione stock con 500 microlitri di crescita fattore di cocktail per ottenere una soluzione 25 mg / ml di fibrinogeno di lavoro contenente i fattori di crescita e le aliquote in 10 o 20 microlitri per la conservazione a -70 ° C. La soluzione è stabile fino a 12 mesi a -70 ° C.
- Allo stesso modo, mescolare 500 ml di trombina 2x soluzione stock con 500 microlitri fattore di crescita cocktail avere 25 soluzione di lavoro U / ml contenente trombina fattori di crescita e aliquota in simili volumi di 10 o 20 microlitri per la conservazione di unt -70 ° C fino a 12 mesi.
- Il giorno di innesto, collocare cocktail-fibrinogeno e fattore di crescita-trombina contenente in ghiaccio fino mescolato con le cellule.
2. T3 Spinal Cord transezione
- Anestetizzare femmina adulta Fischer 344 ratti o topi nudi atimici con metodi accettabili. I soggetti sono profondamente anestetizzati, quando la risposta alla coda e zampa pizzico sono completamente assenti. Nota: Usiamo tipicamente 150-200 g ratti Fischer o 180-220 g topi atimici, e un cocktail anestesia (2 ml / kg) di ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml) e acepromazina (0,25 mg / ml).
- Applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza o lesioni degli occhi, mentre gli animali sono sotto anestesia.
- Radere la zona toracica superiore e pulire la pelle con Betadine.
- Tagliare la pelle e muscolo utilizzando # 15 Lama, esporre T3 vertebra con un divaricatore chirurgico, ed eseguire una laminectomia a T3 vertebra per esporre T3 / 4 midollo spinale tramite un rongeur.
- Fare un longitudinale incisione mediana nella durata di circa 2 mm di lunghezza con una lama # 11.
- Posizionare iridectomia forbici sotto la dura tagliare il laterale destro intera midollo spinale. Fare un altro taglio sullo stesso lato 1,5 millimetri più cadually.
- Aspirare il tessuto del midollo spinale tra i due segmenti di taglio con un ottuso 23 G ago collegato al vuoto intensità moderata. Utilizzare verifica visiva per garantire la completa resezione ventralmente e lateralmente. Questo completerà un emisezione laterale.
- Per estendere la lesione ad una resezione del midollo spinale a tutta larghezza, posizionare incisioni specchio nel hemicord sinistra. Tentativo di lasciare la dura intatta, diverso dal primo taglio, per mantenere l'impresa matrice innesto / fibrina nel sito della lesione quando innestato due settimane più tardi.
- Suturare il muscolo, applicare la polvere antibiotica e fiocco la pelle.
- Iniettare lattato (3 ml) di Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) e ampicillina (80-100 mg / kg) (vedi tabella Materials) immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mairatti ntain in un incubatore caldo fino a quando viene ristabilita termoregolazione.
- Svuotare la vescica e iniettare la soluzione di Ringer e ampicillina due volte al giorno per circa due settimane fino all'istituzione della vescica reflex svuotamento (Figura 1B).
3. Preparazione di recente dissociata embrionali Giorno 14 Spinal Cord Neural Stem Cells
- Ottenere Inbreed transgenici GFP ratti F344 (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) dal Ratto delle risorse e Research Center, Università del Missouri.
- Iniettare 40 mcg des-Gly 10, [D-Ala 6]-luteinizante ormone rilasciante ormone Ethylamide (LHRH) diluito in PBS ad una concentrazione di 200 ug / ml per via intraperitoneale (IP) per maturo ratto femmina (8 settimane o più) dopo 2 induzione luce -3 ore per la sincronizzazione di raccolta degli embrioni.
- Accoppiarsi con un maturo GFP omozigote o eterozigote notte ratto maschio 4 giorni dopo l'iniezione.
- Raccogliere embrioni a giorni 13,5-14,5 postcoitusIn tampone HBSS freddo (pc), esaminare l'espressione GFP sotto un "Nightsea" torcia elettrica e filtri bicchieri (BLS1 - BlueStar torcia elettrica e filtro barriera modello VG1) o di un microscopio a fluorescenza.
- Sezionare midollo spinale in condizioni asettiche da ciascun feto GFP-positive e rimuovere le meningi sovrastanti e gangli spinali attaccato con le forbici iridectomia e gioiellieri pinza sottile.
- Raccogliere le midollo spinale sezionato in 2 ml di freddo tampone HBSS in un tubo cornical 15 ml e tenere in ghiaccio.
- Seguire riferimento # 20 di dissociare il midollo spinale sezionato:
- Brevemente, aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla provetta contenente midolli spinali sezionati (vari cordoni possono essere digeriti insieme, 1 cavo può generare cellule sufficiente per innesto di un soggetto) e digerire a 37 ° C per 10-12 min.
- Arrestare la reazione tripsina aggiungendo 10 ml di DMEM contenente 10% FBS al tubo e centrifugare il tessuto a 2.500 rpm per 2 min.
- Risospendere tessuto in 2 ml Neurobasal medio containing 2% B27, e triturare il tessuto del midollo spinale utilizzando sempre più piccoli fuoco lucido Pasteur pipette.
- Centrifugare le cellule a 2.500 rpm per 2 min, risospendere in 2 ml di terreno contenente Neurobasal B27, e celle filtranti con filtro cella filtro 40 micron.
- Contare le cellule con un emocitometro e dividere le celle equamente in due provette Eppendorf.
- Centrifugare le cellule e rimuovere completamente il surnatante (1-2 min sono tenuti a ritirare tutto il surnatante con una punta di vuoto basso) in modo che il cocktail di fattori di crescita non saranno diluiti rimanendo surnatante dopo cellula ri-sospensione.
- Risospendere ogni metà delle cellule del fibrinogeno o soluzione di lavoro trombina contenente fattori di crescita, rispettivamente, ad una concentrazione di 250.000 cellule / ml (conteggi pellet cellulare per circa ⅓ volume finale) e disporli sul ghiaccio prima trapianto (Figura 1A). Si noti che il fibrinogeno può spontaneamente gel quando miscelato con la cellulas prima di combinare con trombina presso il sito di lesione / innesto; per evitare gelificazione precoce, mescolare celle fibrinogeno immediatamente prima dell'innesto cellule in vivo.
4. Trapianto
- Reexpose la lesione T3 / 4 midollo spinale due settimane dopo resezione del midollo spinale.
- 5 microlitri fibrinogeno-cellule e 5 trombina-cellule microlitri potrebbero essere iniettate direttamente in nove punti del sito della lesione attraverso il tessuto cicatriziale sigillato e dura intatto senza riaprire il sito di lesione.
- Utilizzare un ago G 27 per creare 9 fori sulla superficie del tessuto cicatriziale e dura intatta 1-2 settimane dopo la lesione: 3 in centro (una nel punto centrale e due laterali in, e distanziati 0,5 millimetri a parte) e 3 in entrambi rostrale e 3 interfaccia caudale (circa 0,5 millimetri rostrale o caudale al centro della lesione).
- Poi iniettare metà volume di soluzione di cellule fibrinogeno in tre punti centrali del sito della lesione e un volume quarto in 3 punti dell'interfaccia rostrale e aqVolume uarter in 3 punti dell'interfaccia caudale.
- Poi, iniettare immediatamente le cellule throbmbin negli stessi punti. La miscela di cellule fibrinogeno e trombina cellule all'interno del sito della lesione formerà fibrina gel per contenere celle nel sito di lesione e cocktail fattore di crescita sosterrà la sopravvivenza delle cellule. Le cellule vengono iniettate con pipette di vetro tirati collegati ad una PicoSpritzer (General Valve, Inc.).
- Trapianto di cellule staminali neurali umane in coltura 21 nella stessa procedura sopra descritta, e utilizzare fibrina e fattori di crescita cocktail a base di reagenti umani.
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Risultati
GFP etichettatura immunoistologico dimostra che le cellule staminali neurali ratto innestato risospese in tampone fosfato (PBS) (manca una matrice di fibrina e fattori di crescita) sono sopravvissuti male nel sito resezione T3, solo attaccarsi al margine della lesione / host e lasciando la maggior parte del sito della lesione vuota senza cellule innestate (Figura 2A). La sopravvivenza di NSC migliorata quando co-innestato con matrici di fibrina solo, ma l'innesto non completamente compili una grande...
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Discussione
Uno dei principali ostacoli per NSC trapianto nel midollo spinale danneggiato è scarsa sopravvivenza al centro della lesione. Eventuali lacune o cavità nel sito della lesione potrebbe potenzialmente ridurre o indebolire la formazione di relè neuronali funzionali tra assoni sovraspinali e separati segmenti del midollo spinale al di sotto della lesione. Inoltre, la scarsa sopravvivenza delle cellule staminali neurali trapiantate può influenzare la loro integrazione con il tessuto ospite, e quindi ridurre la connettività d...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Resource Rat e Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, per fornire topi GFP; Neuralstem Inc. per la fornitura di cellule staminali neurali umane. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondazione Craig H. Neilsen, e Bernard e Anne Spitzer Charitable Trust.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibrinogeno (ratto) | Sigma | F6755-25MG | 2 ore a 37 gradi Concentrazione di di base: 50 mg/ml Concentrazione finale: 25 mg/ml |
| di trombina (ratto) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM di CaCl2 Concentrazione di base: 50 U/ml Concentrazione finale: 25 mg/ml |
| di bFGF (umano) | Sigma | F0291 (25 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| EGF (murino) | Sigma | E1257 (0,1 mg) | Concentrazione di base: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| BDNF (umano) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Concentrazione di base: 1.000 ng/μ l Concentrazione finale: 50 ng/μ l |
| NT-3 (umano) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Concentrazione di base: 1.000 ng/μ l Concentrazione finale: 50 ng/μ l |
| GDNF (ratto) | Sigma | G1401 (10 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| IGF-1 (mouse) | Sigma | I8779 (50 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| aFGF (umano) | Sigma | F5542 (25 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| PDGF-AA (umano) | Sigma | P3076 (10 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| HGF (umano) | Sigma | H9661 (5 μ g) | Concentrazione di riserva: 200 ng/μ l Concentrazione finale: 10 ng/μ l |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Concentrazione stock: 1 mM Concentrazione finale: 50 μ M |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Concentrazione di base: 1x Concentrazione finale: 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Concentrazione di base: 100 mg/ml Concentrazione finale: 25 mg/ml |
| di xilazina | Lloyd | 0410, | 2,5-8 mg/ml Concentrazione di riserva: 100 mg/ml Concentrazione finale: 5,8 mg/ml |
| di acepromazina | Butler | 003845 | 0,5-4 mg/ml Concentrazione di base: 10 mg/ml Concentrazione finale: 0,25 mg/ml |
| di Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2,5-5 mg/kg Concentrazione di riserva: 50 mg/ml Concentrazione finale: 0,5 mg/ml |
| Ampicillina | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Concentrazione finale: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma L4513 | 200 μ g/kg Concentrazione finale: 200 μ g/ml | |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Tripsina | Gibco | 25200056 | Concentrazione di base: 0,25 % Concentrazione finale: 0,125 % |
| DMEM | Gibco 11995073 | ||
| FBS | Gibco | 16000044 | Concentrazione di base: 100 % Concentrazione finale: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Concentrazione di riserva: 100x Concentrazione finale: 1x |
| Nota, utilizzare reagenti umani per innesti di NSC umane |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
