Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l'Air Interface Liquid

Sommario

Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

Abstract

Modelli in vitro utilizzando cellule epiteliali umane primarie sono essenziali per comprendere funzioni chiave epitelio respiratorio nel contesto di infezioni microbiche o agenti inalati. Il confronto diretto di cellule ottenute da popolazioni malate ci permettono di caratterizzare diversi fenotipi e sezionare i meccanismi di fondo che mediano i cambiamenti nella funzione delle cellule epiteliali. Coltura di cellule epiteliali della regione tracheobronchiale umana è stata ben documentata, ma è limitata dalla disponibilità di tessuto polmonare umano o invasività associata a ottenere i pennelli bronchiali biopsie. Cellule epiteliali nasali sono ottenuti attraverso molto meno invasivi superficiali biopsie raschiare nasale e soggetti possono essere sottoposte a biopsia più volte senza effetti collaterali significativi. Inoltre, il naso è il punto di ingresso per il sistema respiratorio e quindi uno dei primi siti ad essere esposti a qualsiasi tipo di stress per via aerea, quali agenti microbici, inquinanti o allergeni.

Brevemente, le cellule epiteliali nasali ottenuti da volontari umani sono espansi su piastre di coltura dei tessuti rivestiti, e poi trasferite su inserti di coltura cellulare. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule continuano ad essere coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI), per diverse settimane, il che crea più fisiologicamente condizioni pertinenti. La condizione di cultura ALI usa mezzi definiti che conducono ad un epitelio differenziato che presenta caratteristiche morfologiche e funzionali simili all'epitelio nasale umana, con le cellule ciliate sia e producono muco. Inserti di coltura tissutale con cellule epiteliali nasali differenziate possono essere manipolati in vari modi a seconda delle domande di ricerca (trattamento con agenti farmacologici, trasduzione con vettori lentivirali, esposizione a gas o infezione da agenti microbici) ed analizzati per numerosi endpoint differenti che vanno dalla vie cellulari e molecolari, ch funzionaleanges, morfologia, ecc

Nei modelli in vitro di cellule epiteliali nasali umane differenziati consentirà ai ricercatori di affrontare nuove e importanti domande di ricerca utilizzando modelli sperimentali organotipica che gran parte imitare l'epitelio nasale in vivo.

Introduzione

Obiettivo della tecnica

Le cellule epiteliali (ECS) nelle vie aeree sono tra i primi siti ad essere direttamente esposti ai fattori di stress ambientale per via inalatoria, come agenti patogeni, allergeni o inquinanti atmosferici. EC sono più di una barriera strutturale: Agiscono come un centralino per avviare e regolare la risposta immunitaria respiratorio ^1-3 tramite il rilascio di mediatori solubili ^4-6 e l'espressione dei ligandi / recettori sulla loro surfac ^7-9. Mentre linee cellulari immortalizzate possono essere utilizzati come modelli per studiare i CE respiratorio in vitro, non riescono....

Protocollo

1. Preparare Plastic Ware: Cappotto Piatto

1. Aggiungere 500 microlitri PureCol (1:100 diluito con acqua sterile) a ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
2. Incubare a 37 ° C in un incubatore per 30 minuti, rimuovere il PureCol e risciacquare con HBSS destra prima che le cellule vengono aggiunti alla piastra (vedere il punto 3.1).

2. Ottenere e pretrattamento Biopsia del CNE umano

1. Nasale biopsia raschiare
   1. Ottenere EC superficiali che rivestono i turbinati nasali sotto visione diretta attraverso un speculum riutilizzabili in polipropilene nasale 9 mm (modello 22009) su un otoscopio operativo ....

Risultati

CNE coltura seguendo il protocollo qui descritto re-differenziarsi in uno strato eterogeneo di EC composto da cellule ciliate e non ciliate, che rappresentano la situazione in vivo (Figura 1). Alcuni dei CNE differenziati sono muco che producono cellule (colorazione in blu con AB / PAS, Figura 1B). Anche se il protocollo qui presentato è ottimizzato, differenziazione può variare in relazione alla distribuzione delle popolazioni cellulari totali (cioè differenti rapport.......

Discussione

EC respiratorie non solo forniscono una barriera fisica per proteggere il corpo umano da stimoli esogeni ^20, ma anche agire come un centralino per avviare e regolare le risposte di difesa immunitario respiratorie ^1-3 tramite la secrezione di mediatori solubili o interazioni dirette cellula-cellula recettore-ligando. Per studiare ulteriormente il ruolo di EC nella risposta immunitaria, per esaminare differenza di potenziale tra i CE da popolazioni malate, o per studiare gli effetti dei fattori di st.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Speculum nasale	Welch Allyn	Modello 22009	9 mm, polipropilene riutilizzabile
Otoscopio operativo	Welch Allyn	Modello 21700
Cuvetta per cellule con sonda Rhino	Arlington Scientific	SY-96-092	piega un po' di più la testa della cuvetta Piastre di
coltura a 12 pozzetti		3512
Transwell	Fiaschetta	3460
	Corning	430639 e 430641	Pallone ventilato T25 e T75
Terreni RPMI 1640 (con L-glutammina)	Gibco	11875
Crescita delle cellule epiteliali bronchiali/tracheali	delle cellule	511-500
BEGM	Lonza	CC-3170	Questo viene fornito come un kit di un flacone di terreno e fiale con integratori.
Bicarbonato di sodio soluzione 7,5%	Gibco	25080	Utilizzare tal quale.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Utilizzare così com'è.
BAMBANKER mezzi di congelamento	BAMBANKER	302-14681	Utilizzare così com'è.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(contenitore per il congelamento delle cellule senza alcool CryoPrep)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	diluire 1:100 con acqua sterile (dovrebbe essere circa 0,03 mg/ml)utilizzare 500 μ l/pozzetto di una piastra HBSS a 12 pozzetti
con Ca2 e Mg2+	Gibco	14025
DNAsi 1	Sigma	DN25	Sciogliere a 1,5 mg/ml, che è una soluzione 100x, aggiungere 10 μ l a ogni ml di terreno
Tripsina, 0,25%, 1x, con rosso fenolo	Gibco	25200-056	Utilizzare ad esso è
Inibitore della tripsina di soia (SBTI)	Sigma	T6522	Utilizzare disciolto in HBSS a una concentrazione di 1 mg/ml
Acido retinoico	Sigma	R7632	Prepararlo 100 μ Soluzione madre M (vedi sotto), diluito a 10 μ M con alcol assoluto, prendere 5 μ l di questo e aggiungerlo a 1 ml di terreno BEGM (la nostra soluzione di lavoro). Il retinolo all-trans ha un coefficiente di estinzione di 52.480 in etanolo a 325 nm. Sciogliere 25 mg in 50 ml di etanolo assoluto. È necessario effettuare diluizioni seriali, diluire 50 ml di brodo in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto e di nuovo prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 100 ml di questo e diluire in 900 ml di etanolo assoluto e leggere nello spettrofotometro a 325 nm, Questo numero viene poi moltiplicato per il suo' fattore di diluizione, quindi diviso per il coefficiente di estinzione di 52.480, questo darà un numero in mM. Produci una scorta da 100 mM (conservare a -20 ° C) e da questo stock si ricava un'aliquota di 10 mM, l'acido retinoico giornaliero necessario sarebbe di 5 ml di questa aliquota di 10 mM in 995 ml di terreno di ALI. Esempio: la lettura di 325 nm è 1,15. 1,15 x 10.000 (fattore di diluizione) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, ricavare un stock di 100 mM da questo, in etanolo assoluto.
DMEM alto glucosio (1x), liquido, con L-glutammina e piruvato di sodio	Gibco	11995
Estratto ipofisario bovino	Gibco	13028-014	Utilizzato per BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Preparare una soluzione di 3,3 mg/ml.
Albumina sierica bovina	Fisher Scientific	BP1600-100	Preparare una soluzione di 10 mg/ml di soluzione in milliQ di acqua.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	Viene fornito come un kit composto da un flacone di terreno e fiale con integratori. Per i dettagli, vedere di seguito.
Idrocortisone	StemCell	7904	Sciogliere 2,4 mg di idrocortisone in 1 ml ddH2O (utilizzato per fare la soluzione madre 200x Idrocortisone)
Eparina Sale sodico in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Utilizzare a questo è.
Palloni filtranti (500 ml)	Corning	431097	0,22 μ m dimensione dei pori
Provette filtranti (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0,22 μ m pore size
Puntali per pipette - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Provette coniche, sterili, 15 ml e 50 ml
ddH2O, etanolo assoluto, ghiaccio
CO2 incubatore
centrifuga
Pipette per armadietti
(p2, p200, p1000), 9 in pipette di vetro
camice da laboratorio con polsini
< td>(questo è stabile per 2 settimane a 2-8 gradi C o per un massimo di 6 mesi a -20 gradi C) Media e soluzioni utilizzate: Recipe Usato per Osservazione generale: scaldare sempre il supporto a temperatura ambiente BEGM media 500 ml di terreno di applicazione BEGM Cell con un'aliquota di acido retinoico (mescolarli metà-metà e filtrare) 500 ml di terreno BEGM Lonza con un'aliquota di supplementi a quot singola < ul> digestione della biopsia BEGM+ media 50 ml di terreno BEGM mantenimento delle cellule su plastica nelle lastre (passaggio0) 10 μ L Acido retinoico (soluzione di lavoro) Cellule di semina nel pallone (Passaggio 1; Parzialmente) mantenere le cellule nel pallone BEGM++ media 50 ml Lonza' s Terreni BEGM con supplementi semina di cellule fresche in piastra a 12 pozzetti su plastica 1 ml di BiCarb di sodio mantenimento delle cellule nelle piastre su plastica (passaggio0; solo parzialmente) 2,5 ml NuSerum semina delle cellule nel pallone (passaggio 1; parzialmente) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Mantenimento delle cellule sul pozzetto prima che passino ALI 250 ml BEGM inclusi integratori 2 ml di estratto ipofisario bovino (soluzione 12,5 mg/ml) 1 ml di nistatina (3,3 mg/ml di soluzione) 75 μ l BSA (soluzione 10 mg/ml) 200X Soluzione madre di idrocortisone (96 μ l/ml soluzione) 200 μ l idrocortisone disciolto Come supplemento al terreno base completo PneumaCult-ALI per l'ultimo giorno nel pallone e quando le cellule sono sugli inserti 4250 μ l. cloruro di sodio disciolto 540 μ l ddH2O 10 μ l. etanolo assoluto Soluzione filtrante fino a 0,22 μ m filtro, aliquotare la soluzione e conservare a -20 ° C, evitare ulteriori cicli di congelamento/disgelo PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base per tutti e tre i terreni PneumaCult-ALI 50 ml PneumaCult 10x Integratore Il supporto PneumaCult è sensibile alla luce, quindi tienilo sempre al buio PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml di PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI coltura su inserti 10 μ l PneumaCult 100x Manutenzione Supplemento 2 μ l. Eparina (di una soluzione madre di 2 mg/ml) 5 μ l. Idrocortisone (di un 96 μ l/ml soluzione madre)

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