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Articolo metodologico

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l'Air Interface Liquid

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⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

8 ottobre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

Cellule epiteliali nasali, ottenuti attraverso superficiale raschiare la biopsia di volontari umani, vengono ampliati e trasferite su inserti di coltura tissutale. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono coltivate a interfaccia liquido aria, ottenendo colture di cellule ciliate e non ciliate. Colture di cellule epiteliali nasali differenziate offrono modelli sperimentali validi per lo studio della mucosa respiratoria.

Abstract

Modelli in vitro utilizzando cellule epiteliali umane primarie sono essenziali per comprendere funzioni chiave epitelio respiratorio nel contesto di infezioni microbiche o agenti inalati. Il confronto diretto di cellule ottenute da popolazioni malate ci permettono di caratterizzare diversi fenotipi e sezionare i meccanismi di fondo che mediano i cambiamenti nella funzione delle cellule epiteliali. Coltura di cellule epiteliali della regione tracheobronchiale umana è stata ben documentata, ma è limitata dalla disponibilità di tessuto polmonare umano o invasività associata a ottenere i pennelli bronchiali biopsie. Cellule epiteliali nasali sono ottenuti attraverso molto meno invasivi superficiali biopsie raschiare nasale e soggetti possono essere sottoposte a biopsia più volte senza effetti collaterali significativi. Inoltre, il naso è il punto di ingresso per il sistema respiratorio e quindi uno dei primi siti ad essere esposti a qualsiasi tipo di stress per via aerea, quali agenti microbici, inquinanti o allergeni.

Brevemente, le cellule epiteliali nasali ottenuti da volontari umani sono espansi su piastre di coltura dei tessuti rivestiti, e poi trasferite su inserti di coltura cellulare. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule continuano ad essere coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI), per diverse settimane, il che crea più fisiologicamente condizioni pertinenti. La condizione di cultura ALI usa mezzi definiti che conducono ad un epitelio differenziato che presenta caratteristiche morfologiche e funzionali simili all'epitelio nasale umana, con le cellule ciliate sia e producono muco. Inserti di coltura tissutale con cellule epiteliali nasali differenziate possono essere manipolati in vari modi a seconda delle domande di ricerca (trattamento con agenti farmacologici, trasduzione con vettori lentivirali, esposizione a gas o infezione da agenti microbici) ed analizzati per numerosi endpoint differenti che vanno dalla vie cellulari e molecolari, ch funzionaleanges, morfologia, ecc

Nei modelli in vitro di cellule epiteliali nasali umane differenziati consentirà ai ricercatori di affrontare nuove e importanti domande di ricerca utilizzando modelli sperimentali organotipica che gran parte imitare l'epitelio nasale in vivo.

Introduzione

Obiettivo della tecnica

Le cellule epiteliali (ECS) nelle vie aeree sono tra i primi siti ad essere direttamente esposti ai fattori di stress ambientale per via inalatoria, come agenti patogeni, allergeni o inquinanti atmosferici. EC sono più di una barriera strutturale: Agiscono come un centralino per avviare e regolare la risposta immunitaria respiratorio 1-3 tramite il rilascio di mediatori solubili 4-6 e l'espressione dei ligandi / recettori sulla loro surfac 7-9. Mentre linee cellulari immortalizzate possono essere utilizzati come modelli per studiare i CE respiratorio in vitro, non riescono a differenziarsi in popolazioni cellulari eterogenee composte ciliated polarizzata e cellule che producono muco, simile a quello osservato in vivo. Ricapitolando caratteristiche importanti del epitelio respiratorio osservate in vivo, possono essere usate EC vie aeree primarie. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di ottimizzare il nostro metodo utilizza nasale EC (CNE) ha ottenuto da volontari umani. CNE sono espansi e coltivate in vitro, ottenendo un modello di coltura cellulare di CNE differenziate che imita molte delle caratteristiche dell'epitelio nasale visto in vivo.

Fondamento logico

L'utilizzo di modelli in vitro con cellule endoteliali umane primarie mimano situazione in vivo - come descritto in questo studio - dà possibilità uniche per studiare le malattie specifiche differenze di EC, parametri fisiologici associati con l'epitelio delle vie aeree, ovvero l'interazione tra cellule endoteliali e altri tipi di cellule, come cellule dendritiche 10, cellule natural killer 11 o macrofagi. Diversi metodi esistenti utilizzino EC bronchiali, che possono essere ottenute tramite biopsie invasivo spazzola durante broncoscopie, o altrimenti dismesse da tessuto polmonare 12-17. Inoltre, fonti commerciali per ottenere delle vie respiratorie umane colture di cellule epiteliali completamente differenziate esistono (modello EpiAirway da MatTek, Ashland, MA, Cloneticsda Lonza, Basilea, Svizzera, MucilAir da Epithelix Sars, Ginevra Svizzera), dove i ricercatori possono scegliere tra diversi donatori. Tuttavia, a causa del gruppo limitato di cellule epiteliali disponibili in commercio, delimitato o prescritta di parametri, il costo connesso con l'ottenimento commercialmente vie respiratorie umane primarie EC, e l'accesso limitato al tessuto polmonare scartata o tessuto biopsia bronchiale umano appena ottenuto, proibiscono molti ricercatori dalla realizzazione di studi in piena differenziati EC vie respiratorie umane. Pertanto, abbiamo deciso di sviluppare una tecnica che 1) utilizzare CNE umani non invasivo ottenuti, 2) fornire un protocollo di cedimento culture differenziata epitelio delle vie aeree umana, e 3) essere riproducibile nella maggior parte degli ambienti di laboratorio attraverso una infrastruttura esistente coltura di tessuti.

Vantaggi rispetto esistenti Techniques / Modelli

Ottenere CNE freschi, rispetto al bronchiale o piccole vie aeree EC, è molto meno invasiva, individuales possono essere sottoposte a biopsia più volte con effetti collaterali significativi e superficiali biopsie raschiare nasali possono essere condotti in popolazioni malate che non sarebbero altrimenti beneficiare di broncoscopie connesse alla ricerca. Non invasive biopsie raschiare superficiali per ottenere LNE consentono al ricercatore di impostare specifiche donatore a priori, tra cui l'età, il sesso, lo stato di malattia, ecc in linea con l'obiettivo della ricerca da compiere. Così, quando si progetta studi di ricerca gli investigatori non sono limitati dai tessuti clinicamente disponibili / campioni epiteliali, l'acquisto di costosi modelli di coltura cellulare differenziati da fornitori commerciali, o di progettazione studi broncoscopia invasive. Inoltre, la facilità di ottenere CNE aumenta la capacità di condurre esperimenti in cellule da donatori diversi, che migliora validazione statistica dei risultati osservati. Infine, il naso è uno dei primi siti ad essere esposti a qualsiasi tipo di stress aerodispersi. Così, generando in organotipicovitro sistemi di coltura che mimano all'epitelio nasale sono utili per studiare inalazione di particelle virali, inquinanti, allergeni o gas, che può essere facilmente ottenuto utilizzando questo sistema di coltura cellulare.

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Protocollo

1. Preparare Plastic Ware: Cappotto Piatto

  1. Aggiungere 500 microlitri PureCol (1:100 diluito con acqua sterile) a ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
  2. Incubare a 37 ° C in un incubatore per 30 minuti, rimuovere il PureCol e risciacquare con HBSS destra prima che le cellule vengono aggiunti alla piastra (vedere il punto 3.1).

2. Ottenere e pretrattamento Biopsia del CNE umano

  1. Nasale biopsia raschiare
    1. Ottenere EC superficiali che rivestono i turbinati nasali sotto visione diretta attraverso un speculum riutilizzabili in polipropilene nasale 9 mm (modello 22009) su un otoscopio operativo con speculum (modello 21700). Questo dispositivo fornisce una visualizzazione ottimale dei turbinati nasali e la flessibilità di movimento.
    2. Eseguire le biopsie con il soggetto seduto in posizione verticale su una sedia a schienale diritto con la testa leggermente piegata all'indietro o sdraiati in posizione supina su un lettino.
    3. Inserire lo speculum otoscopio nella narice e Turbi inferiorenate visualizzato con illuminazione.
    4. Inserire una curetta termoplastico sterile attraverso lo speculum con la punta estesa distalmente alla parte posteriore del turbinato.
    5. Utilizzando una leggera pressione sulla superficie inferiore del turbinato, la curetta viene tracciata attraverso il 5x superficie mucosa e retratto. Un recupero di successo di cellule della mucosa detenute da un'azione capillare sarà evidente nella tazza del curetta.
  2. Posizionare campione in una provetta conica da 15 ml contenente 8 ml di RPMI 1640, trasporto su ghiaccio.
  3. Usare pinze per recuperare la sonda, rimuovere il tessuto da sonda rinoceronte con una pipetta P-1000, scartare sonda
  4. Centrifuga a pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirare il surnatante (attenzione: attenzione a non aspirare il pellet).
  5. Risospendere il pellet in 1 ml BEGM con 10 ml di 100x DNasi 1.
  6. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
  7. Centrifuga (4 ° C, 400 xg, 5 min), NON aspirare il surnatante!

3. SEED celle di plastica (giorno 0)

  1. Rimuovere il PureCol dalla piastra e risciacquare con HBSS (vedi anche passo 1.2).
  2. Aggiungere un volume minimo di BEGM supporti + + (80-100 microlitri, fino a visualizzare un menisco di supporto nel centro del pozzetto) in 1-4 pozzetti (a seconda delle dimensioni biopsia) della piastra rivestita.
  3. Utilizzare una pipetta P-1000 per rimuovere con attenzione il pellet del tessuto bioptico dal tubo, senza aspirazione troppo media.
  4. Trasferire il pellet in mezzo pozzi, tenere la biopsia insieme come un ammasso di cellule, e non rompere a fare una sospensione singola cella. Un buon rendimento biopsia fino a 4 pozzi che possono essere seminati. Mettere la piastra nel tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO 2,> 90% di umidità relativa).
  5. Controllare dopo due ore per assicurare che vi sia sufficiente supporti (senza disturbare il menisco).
  6. Day1, 24 ore di post-semina: raccogliere tutte le cellule non aderenti di tutti i pozzetti (piastre tilt e raccogliere mezzi di comunicazione con le cellule in un P-1000, collect tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga da 1,5 ml).
  7. Centrifugare (4 ° C, 400 xg, 5 min).
  8. Mentre centrifugazione sospensione cellulare: aggiungere circa 250 ml di BEGM + + e 250 microlitri della miscela Mezzi BEGM + alle cellule seminate al giorno 0.
  9. Ripetere i passaggi 3.1-3.5 per le cellule non aderenti.
  10. Giorno 2-5: variazione media dei cellule giornalieri, aggiungere 500 mezzi microlitri di ogni bene, ridurre la quantità di BEGM + + supporti graduale (giorno 2 dopo la semina: 125 ml BEGM + + oltre 375 microlitri BEGM +, day3 dopo la semina e nei seguenti giorni: 73 pl BEGM + + più 427 ml BEGM +).

4. Ampliare le cellule nelle Boccette

  1. Monitorare le cellule quotidiana; una volta che hanno raggiunto il 80-90% di confluenza (solitamente 5-7 giorni dopo la biopsia, se prendono più essi non crescere con successo) le cellule di sollevamento come segue: i media accuratamente aspirato, aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina per pozzetto, tenerli a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (richiede solitamente 2-3 min).
  2. Preparare la necessitàEd volume di soia inibitore della tripsina (SBTI) (750 pl per 1 ml di tripsina) in una provetta da 15 ml.
  3. Staccare le cellule da pipettare ripetutamente su e giù per la soluzione di tripsina; trasferimento di cellule staccate nel tubo da 15 ml con SBTI.
  4. Lavare tutti i pozzetti con un totale di 1 ml HBSS, aggiungere HBSS al tubo con le cellule.
  5. Centrifuga a pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirare i media, risospendere in 1 ml BEGM + supporti e agitare la provetta.
  6. Espandere le cellule in un pallone T25 o T75 a seconda delle dimensioni del pellet (questo è p1; circa due pozzetti confluenti andare in un pallone T75, uno confluenti bene è abbastanza per un T25, di solito due pozzetti confluenti producono un T75).
    1. Aggiungi BEGM + ai palloni (5 ml ciascuno per un T75, 3 ml ciascuno per un T25).
    2. Aggiungere la sospensione cellulare nei flaconi. Trasferire i flaconi in un tessuto culturale incubatore.
  7. 24 ore post-pallone-semina: aggiungere ulteriori supporti BEGM + al pallone (3 ml ad un T25, 10 ml ad un T75).
  8. mantenere le cellule nelle boccette: Rimuovere i supporti (aspirato da un angolo) e aggiungere BEGM + supporto (5 ml/T25, 20 ml/T75). Il supporto deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Mantenere le cellule nel pallone fino a circa 80% confluenti (confluenza può non essere ancora tutta la beuta; normalmente questo avviene tra 7-10 giorni, se non sono confluenti dopo 10 giorni non cresceranno correttamente).

5. Seed Celle sul tessuto Cultura Inserti

  1. Rimuovere il supporto dal pallone e aggiungere tripsina (3 ml per T25, 4 ml per pallone T75).
  2. Incubare a 37 ° C finché le cellule vengono staccate (circa 2-3 min).
  3. Preparare SBTI (750 pl per 1 ml di tripsina> 2,25 ml per T25, T75 per 3 ml) in una provetta da 15 ml.
  4. Staccare le cellule con nastro adesivo il pallone e pipettando su e giù e trasferimento a tubo conico con il SBTI.
  5. Lavare il pallone con HBSS (1 ml per T25, 2 ml per T75), aggiungere la HBSS al tubo 15 ml.
  6. Centrifugaa pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), rimuovere con attenzione il surnatante.
  7. Preparare i piatti: decidere quanti piatti stanno per essere testa di serie, etichettare i piatti con il codice di esempio e il numero, il numero di passaggio (cioè p2) e la data. Aggiungere 700 microlitri BEGM + supporto alla camera basale.
  8. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di mezzi BEGM ALI vortex la provetta.
  9. Contare le cellule con un emocitometro (un T25 solito produce circa 4 milioni di cellule, un T75 può avere fino a 20 milioni di cellule a seconda delle isolotto; utilizzare 1-2 milioni di cellule per una piastra 12 pozzetti) e diluire la sospensione cellulare con supporti BEGM ALI al volume totale necessario per la quantità di piatti che dovrebbe essere testa di serie (1,2 x 10 6 cellule in 2,5 ml di supporti per piastra). (Nota: Se parte delle cellule vogliono essere congelati, etichettare il tubo e rimuovere le cellule qui: di solito congelare 2 x 10 6 cellule in 2 ml di congelamento media)
  10. Aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare lato apicale di ciascuna cella Corning 12well patinatainserire (> questo sarà di circa 80,000-150,000 cellule / inserto; 12 millimetri transwells con 0,4 micron pori poliestere (polietilene tereftalato (PET)) inserto a membrana); trasferire nella coltura tissutale incubatore.
  11. Dopo 24 ore, cambiare il supporto apicale (200 microlitri media espansione).
  12. Il mantenimento delle colture cellulari: Cambiare il supporto (BEGM ALI media; 700 microlitri basolaterale e 200 apicale pl) ogni altro giorno. Inserti devono essere mantenuti sommerso fino celle sono completamente confluenti (senza fori in monostrato sono visibili). A seconda del numero di cellule questo avviene di solito tra 2-6 giorni, se ci vuole più tempo le cellule saranno molto probabilmente non essere praticabile.

6. Stabilire Air Interface Liquid Una volta che le cellule sono completamente confluenti (Quando le cellule sulle Transwells sono completamente confluenti)

  1. Una volta che le cellule sono completamente confluenti sostituire entrambi i media apicale e basolaterale con i media BEGM ALI integrato con 500nm acido retinoico per 48 ore.
  2. 48 ore dopo aver aggiunto l'acido retinoico completato BEGM ALI supporti: Preparare PneumaCult-ALI Maintenance Medium (le istruzioni del seguente produttore): Calcolare il volume di terreno necessari (per un piatto di solito 8,5 ml per i vani basali); aggiungere per 1 ml PneumaCult Complete Piano Base :

    10 microlitri PneumaCult 100x Manutenzione Supplemento
    2 ml eparina (di una soluzione madre 2 mg / ml)
    5 ml idrocortisone (di una soluzione madre 96 microlitri / ml).

  3. Rimuovere tutti i supporti e aggiungere 700 microlitri PneumaCult-ALI manutenzione dei media al lato basolaterale soltanto (nessun mezzo sul lato apicale).
  4. Mantenere le colture cellulari per 4 settimane al ALI:
    1. Modificare i mezzi di ogni altro giorno (Lunedi, Mercoledì e Venerdì orario funziona bene per noi).
    2. Dopo una settimana a ALI, una volta a settimana (mercoledì) la superficie apicale viene risciacquato: aggiungere 200 microlitri HBSS al lato apicale, tenerli per 10 minuti in incubatrice, con attenzione aspirare ilHBSS (usare una pipetta di vetro 9 in allegato alla trappola vuoto nella cabina di sicurezza biologica, utilizzare punte 200 microlitri sulla punta della pipetta di aspirazione fuori HBSS).

Nota: Cambiare punte tra piastre, così come cambiare le punte quando si passa dalla superficie apicale rispetto basolaterale. Dopo circa 2 settimane al ALI, le cellule iniziano a differenziarsi e appaiono ciglia. Le colture cellulari raggiungono la piena differenziazione dopo circa 4 settimane al ALI.

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Risultati

CNE coltura seguendo il protocollo qui descritto re-differenziarsi in uno strato eterogeneo di EC composto da cellule ciliate e non ciliate, che rappresentano la situazione in vivo (Figura 1). Alcuni dei CNE differenziati sono muco che producono cellule (colorazione in blu con AB / PAS, Figura 1B). Anche se il protocollo qui presentato è ottimizzato, differenziazione può variare in relazione alla distribuzione delle popolazioni cellulari totali (cioè differenti rapport...

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Discussione

EC respiratorie non solo forniscono una barriera fisica per proteggere il corpo umano da stimoli esogeni 20, ma anche agire come un centralino per avviare e regolare le risposte di difesa immunitario respiratorie 1-3 tramite la secrezione di mediatori solubili o interazioni dirette cellula-cellula recettore-ligando. Per studiare ulteriormente il ruolo di EC nella risposta immunitaria, per esaminare differenza di potenziale tra i CE da popolazioni malate, o per studiare gli effetti dei fattori di st...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Lisa Dailey per gli ingressi voti.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (ES013611 e HL095163), l'assistente di volo Medical Research Institute (FAMRI), e l'Environmental Protection Agency (CR83346301) e dichiara alcun conflitto di interessi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Anche se la ricerca descritta in questo articolo è stato finanziato in parte dalla US Environmental Protection Agency attraverso accordo di cooperazione CR83346301 con il Centro di Medicina Ambientale, Asma e Polmone di Biologia presso la University of North Carolina-Chapel Hill, non è stato sottoposto alla L'agenzia del peer richiesto e revisione della politica e quindi non riflettono necessariamente il punto di vista dell'agenzia, e nessuna approvazione ufficiale dovrebbe essere dedotto. Menzione of nomi commerciali o di prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso. Loretta Müller è sostenuta dalla National Science Foundation svizzera con un contributo personale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Speculum nasaleWelch AllynModello 220099 mm, polipropilene riutilizzabile
Otoscopio operativoWelch AllynModello 21700
Cuvetta per cellule con sonda RhinoArlington ScientificSY-96-092piega un po' di più la testa della cuvetta Piastre di
coltura a 12 pozzetti3512
TranswellFiaschetta3460
Corning430639 e 430641Pallone ventilato T25 e T75
Terreni RPMI 1640 (con L-glutammina)Gibco11875
Crescita delle cellule epiteliali bronchiali/trachealidelle cellule511-500
BEGMLonzaCC-3170Questo viene fornito come un kit di un flacone di terreno e fiale con integratori.
Bicarbonato di sodio soluzione 7,5%Gibco25080Utilizzare tal quale.
NuSerumBD Biosciences355104Utilizzare così com'è.
BAMBANKER mezzi di congelamentoBAMBANKER302-14681Utilizzare così com'è.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(contenitore per il congelamento delle cellule senza alcool CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bdiluire 1:100 con acqua sterile (dovrebbe essere circa 0,03 mg/ml)utilizzare 500 μ l/pozzetto di una piastra HBSS a 12 pozzetti
con Ca2 e Mg2+Gibco14025
DNAsi 1SigmaDN25Sciogliere a 1,5 mg/ml, che è una soluzione 100x, aggiungere 10 μ l a ogni ml di terreno
Tripsina, 0,25%, 1x, con rosso fenoloGibco25200-056Utilizzare ad esso è
Inibitore della tripsina di soia (SBTI)SigmaT6522Utilizzare disciolto in HBSS a una concentrazione di 1 mg/ml
Acido retinoicoSigmaR7632Prepararlo 100 μ Soluzione madre M (vedi sotto), diluito a 10 μ M con alcol assoluto, prendere 5 μ l di questo e aggiungerlo a 1 ml di terreno BEGM (la nostra soluzione di lavoro).

Il retinolo all-trans ha un coefficiente di estinzione di 52.480 in etanolo a 325 nm. Sciogliere 25 mg in 50 ml di etanolo assoluto. È necessario effettuare diluizioni seriali, diluire 50 ml di brodo in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto e di nuovo prendere 50 ml di questo, diluire in 450 ml di etanolo assoluto, prendere 100 ml di questo e diluire in 900 ml di etanolo assoluto e leggere nello spettrofotometro a 325 nm, Questo numero viene poi moltiplicato per il suo' fattore di diluizione, quindi diviso per il coefficiente di estinzione di 52.480, questo darà un numero in mM. Produci una scorta da 100 mM (conservare a -20 ° C) e da questo stock si ricava un'aliquota di 10 mM, l'acido retinoico giornaliero necessario sarebbe di 5 ml di questa aliquota di 10 mM in 995 ml di terreno di ALI. Esempio: la lettura di 325 nm è 1,15. 1,15 x 10.000 (fattore di diluizione) / 52.480 = 0,219 = 219 mM, ricavare un stock di 100 mM da questo, in etanolo assoluto.
DMEM alto glucosio (1x), liquido, con L-glutammina e piruvato di sodioGibco11995
Estratto ipofisario bovinoGibco13028-014Utilizzato per BEGM ALI media.
NystatinSigmaN4014-50 mgPreparare una soluzione di 3,3 mg/ml.
Albumina sierica bovinaFisher ScientificBP1600-100Preparare una soluzione di 10 mg/ml di soluzione in milliQ di acqua.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Viene fornito come un kit composto da un flacone di terreno e fiale con integratori. Per i dettagli, vedere di seguito.
Idrocortisone StemCell7904Sciogliere 2,4 mg di idrocortisone in 1 ml ddH2O (utilizzato per fare la soluzione madre 200x Idrocortisone)
Eparina Sale sodico in PBS (2 mg/ml)StemCell7980Utilizzare a questo è.
Palloni filtranti (500 ml)Corning4310970,22 μ m dimensione dei pori
Provette filtranti (50 ml)MilliporeSCGP00525Steriflip, 0,22 μ m pore size
Puntali per pipette - ART Barrier TipsMolecular Bioproducts2139RI, 2069RI, 2179RI
Provette coniche, sterili, 15 ml e 50 ml
ddH2O, etanolo assoluto, ghiaccio
CO2 incubatore
centrifuga
Pipette per armadietti
(p2, p200, p1000), 9 in pipette di vetro
camice da laboratorio con polsini
< td>(questo è stabile per 2 settimane a 2-8 gradi C o per un massimo di 6 mesi a -20 gradi C)
Media e soluzioni utilizzate: RecipeUsato per
Osservazione generale: scaldare sempre il supporto a temperatura ambiente
BEGM media
  • 500 ml di terreno di applicazione BEGM Cell con un'aliquota di acido retinoico
(mescolarli metà-metà e filtrare)
  • 500 ml di terreno BEGM Lonza con un'aliquota di supplementi a quot singola
< ul>
  • digestione della biopsia
    • BEGM+ media
    • 50 ml di terreno BEGM
    • mantenimento delle cellule su plastica nelle lastre (passaggio0)
    • 10 μ L Acido retinoico (soluzione di lavoro)
    • Cellule di semina nel pallone (Passaggio 1; Parzialmente)
    • mantenere le cellule nel pallone
    BEGM++ media
    • 50 ml Lonza' s Terreni BEGM con supplementi
    • semina di cellule fresche in piastra a 12 pozzetti su plastica
    • 1 ml di BiCarb di sodio
    • mantenimento delle cellule nelle piastre su plastica (passaggio0; solo parzialmente)
    • 2,5 ml NuSerum
    • semina delle cellule nel pallone (passaggio 1; parzialmente)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Mantenimento delle cellule sul pozzetto prima che passino ALI
    • 250 ml BEGM inclusi integratori
    • 2 ml di estratto ipofisario bovino (soluzione 12,5 mg/ml)
    • 1 ml di nistatina (3,3 mg/ml di soluzione)
    • 75 μ l BSA (soluzione 10 mg/ml)
    200X Soluzione madre di idrocortisone (96 μ l/ml soluzione)
    • 200 μ l idrocortisone disciolto
    • Come supplemento al terreno base completo PneumaCult-ALI per l'ultimo giorno nel pallone e quando le cellule sono sugli inserti
    • 4250 μ l. cloruro di sodio disciolto
    • 540 μ l ddH2O
    • 10 μ l. etanolo assoluto
    Soluzione filtrante fino a 0,22 μ m filtro, aliquotare la soluzione e conservare a -20 ° C, evitare ulteriori cicli di congelamento/disgelo
    PneumaCult-ALI Complete Base Media
    • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
    • Base per tutti e tre i terreni PneumaCult-ALI
    • 50 ml PneumaCult 10x Integratore
    • Il supporto PneumaCult è sensibile alla luce, quindi tienilo sempre al buio
    PneumaCult-ALI Maintenance MediumPer 1 ml di PneumaCult-ALI Complete Base Medium add:ALI coltura su inserti
    • 10 μ l PneumaCult 100x Manutenzione Supplemento
    • 2 μ l. Eparina (di una soluzione madre di 2 mg/ml)
    • 5 μ l. Idrocortisone (di un 96 μ l/ml soluzione madre)
    Inserti per colture cellulari a membrana Corning per colture tissutali Corning Applicazioni medie refrigeratadi sicurezza biologica guanti stretti

    Riferimenti

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

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