Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.
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Articolo metodologico
Un metodo per la coltura embrionale
In questo articolo
Sommario
Abstract
C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all'interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi 1 sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d'uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.
Introduzione
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati ', la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore 2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (> 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazion....
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Protocollo
Asterischi (*) indicano passaggi nuovi o modificati rispetto alla Christensen et al. 1
1. Setup materiale
- La procedura di coltura cellulare richiede grandi quantità di uova isolato dagli adulti gravide. Crescere C. elegans su 8P piastre di agar seminato con NA22 (disponibile attraverso il C. elegans Consorzio genetica - CGC) batteri per isolare grandi quantità di uova. In queste tavole la quantità di peptone usata è 8 volte l'importo che viene normalmente utilizzato per piastre NGM. La concentrazione peptone superiore sostiene la crescita di batteri NA22 più efficiente, che contrariamen....
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Risultati
C. elegans cellule in coltura e differenziare cellule espresso marcatori specifici
Christensen e colleghi utilizzando trypan colorazione blu hanno dimostrato che il> 99% dei embrionale C. cellule elegans sopravvivono alla procedura di isolamento. Al giorno 9 e 22 dopo la placcatura, 85% e 65%, rispettivamente, sono ancora vivi 1. Isolato embrionale C. cellule elegans devono aderire ad un substrato al fine di differenziare. Le cellule ch.......
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Discussione
C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l'invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all'interno di una cuticola pressurizzata che limita l'applicazione di metodi che richiedono l'accesso d.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone VWR | International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar granulato | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Estratto di lievito Bacto | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillina-streptomicina | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinasi da Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Centro | ||
| Lectina di arachidi | Sigma | L0881-10MG | |
| Saccarosio | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucosio | Sigma | 67528-1KG | |
| Glicole etilenico-bis (2-amin– acido N,N,N',N'- tetraacido (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Colesterolo | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma S8045-500G | ||
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Etanolo | |||
| Autoclavato distillato H2O | |||
| Candeggina | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μ l Punte per pipette graduate blu | USA Scentific | 1111-2821 | |
| Pipetta sterilizzata da 10 ml confezionata singolarmente | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Volume variabile ergonomico (100-1000 μ l) Pipettatore con espulsore di puntale | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Apparecchio per pipette portatile, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Pipetta di trasferimento in plastica sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| Tubo conico da 15 ml | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Tubo conico da 50 ml | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Aghi sterili calibro 18 | Becton, Dickinson and Co. | ||
| Siringhe sterili da 10 ml | Becton, Dickinson and Co. | ||
| Filtri per siringhe in plastica Corning 0,20 μ m dimensione dei pori | Corning | 431224 | |
| Filtro per siringa acrodico da 25 mm con 5 μ m versapor Membrana | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| Piastra Petri 60x15 mm sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| Piastra Petri 100x15 mm sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| Vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm di diametro | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Piastre per colture cellulari trasparenti 24 pozzetti a fondo piatto con coperchio | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Pinze fini | Strumenti per la scienza | 11254-20 | |
| Centrifuga 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| a cappa | |||
| Eppendorf con obiettivo | |||
| umidificato ad aria ambiente |
Riferimenti
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.
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Ristampe e permessi
