Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Sommario

Creazione di distacchi di retina sperimentali con un'altezza riproducibile e sostenuto di distacco, e senza emorragia subretinica, è importante per lo studio della fisiopatologia della perdita di cellule fotorecettori della retina nella malattia e valutare possibili interventi terapeutici. Qui riportiamo tale metodo in dettaglio.

Abstract

Iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio è un metodo ampiamente accettato di indurre distacco di retina (RD). Tuttavia, l'altezza e la durata della RD o il verificarsi di emorragia sottoretinico possono influenzare la morte delle cellule fotorecettrici nella retina distaccata. Quindi, è vantaggioso creare RDs riproducibili senza emorragia sottoretinico per valutare la morte cellulare dei fotorecettori. Abbiamo modificato un metodo riportato in precedenza per creare bollosa e RDs persistenti in una posizione riproducibile con rara presenza di emorragia sottoretinico. La fase critica di questo metodo modificato è la creazione di una incisione sclerale autosigillante, che può impedire la perdita di ialuronato di sodio dopo l'iniezione nello spazio sottoretinico. Per effettuare l'incisione sclerale autosigillante, un tunnel sclerale viene creato, seguita dalla penetrazione sclerale nella coroide con un ago G 30. Anche se l'emorragia della coroide può verificarsi durante questa fase, astriction con una lancia chirurgico riduce il tasso di orlo della coroideorrhage. Questo metodo permette un modello più riproducibile e affidabile della morte dei fotorecettori in malattie che coinvolgono RD come rhegmatogenous RD, retinopatia della prematurità, retinopatia diabetica, corioretinopatia sierosa centrale, e la degenerazione maculare legata all'età (AMD).

Introduzione

Morte cellulare dei fotorecettori e conseguente diminuzione visiva si verifica quando i fotorecettori sono separati dal sottostante epitelio pigmentato retinico. Separazione fisica dei fotorecettori è visto in vari disturbi della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età (AMD), corioretinopatia sierosa centrale, retinopatia diabetica e retinopatia della prematurità, nonché rhegmatogenous (cioè causata da una rottura della retina) distacco della retina ( RD). Iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio è un modello ampiamente accettato di creare un RD che porta alla morte cellulare dei fotorecettori, permettono di approfondire la fisiopatologia della degenerazione dei fotorecettori ^1-15.

Degenerazione dei fotorecettori indotta da sottoretinico iniezione ialuronato di sodio, introdotto nel 2001 ^7, ha il vantaggio di un corso di tempo ragionevole (giorni o settimane). Tuttavia, può avere un notevole variabilità della perdita dei fotorecettori da animale ad animal a causa di due fattori principali che influenzano la morte cellulare dei fotorecettori dopo RD: 1) l'altezza e la durata della RD, e 2) l'insorgenza di emorragia sottoretinico. C'è una ripida curva di apprendimento tecnico per il metodo che contribuisce ad entrambi i fattori. Aumenti di degenerazione delle cellule fotorecettore con l'altezza del RD, come la distanza tra la epiteliale del pigmento retinico (RPE) livello e fotorecettori aumenta ^16-17. Coerentemente con questi rapporti, i nostri esperimenti precedenti hanno mostrato più la morte dei fotorecettori in RDs bollose che RDs poco profonde. E 'stato anche riportato che emorragia sottoretinico è tossico per le cellule fotorecettrici e colpisce morte cellulare dei fotorecettori ^18-21. Allo stesso modo, abbiamo osservato più fotorecettori morte RDS con emorragia sottoretinico di RDs senza emorragia sottoretinico. Quindi, le tecniche per ridurre al minimo la variabilità devono concentrarsi sul raggiungimento di altezze consistenti di RD evitando emorragia sottoretinico.

Il nostro metodo modificato di indurre RD può fare bollosa riproducibile e RD persistente nella stessa posizione dell'occhio con rara presenza di emorragia sottoretinico. Abbiamo eseguito un intervento chirurgico utilizzando un approccio temporale perché è più facile ottenere un campo operatorio più ampio rispetto ad altri siti. Dopo l'incisione congiuntivale, un'incisione sclerale autosigillante è realizzato con un ago G 30. Un tunnel sclerale viene creato, seguita dalla penetrazione sclerale nella coroide. Se l'emorragia della coroide si verifica in questa fase, l'emorragia uscirà l'occhio attraverso la ferita sclerale, e il sanguinamento può essere fermato da astriction con una lancia chirurgico. Una puntura camera anteriore viene quindi eseguita dalla cornea per ridurre la pressione intraoculare. Questo è un passo importante perché l'iniezione sottoretinico da sola porterà ad un aumento della pressione intraoculare con conseguente occlusione dell'arteria retinica e ischemia della retina interna. A 33 G ago collegato ad una siringa Hamilton 10 microlitri viene quindi inserito nello spazio sottoretinico, e 3,5 μ; L ialuronato di sodio è leggermente iniettato per staccare la retina neurosensoriale dal RPE sottostante. A differenza di altri metodi per indurre RD che vengono eseguite sotto osservazione fundus, questa tecnica viene eseguita sotto osservazione diretta. Dal momento che la ferita sclerale è autosigillante, ialuronato di sodio non fuoriesca dopo l'iniezione. Infine, la colla viene messo sulla ferita sclerale, e la congiuntiva viene ricollegato alla sua posizione originale. Questi dura passi riducono anche il rischio di perdite di ialuronato di sodio. L'iniezione di 3,5 ialuronato di sodio microlitri crea RDs riproducibili (il 50% della retina), agli occhi di 8 settimane di età topi. Creazione del autosigillante ferita è il passo più importante nella nostra procedura modificata perché impedisce la ialuronato di sodio iniettato di fuoriuscire dell'occhio, permettendo così bollosa riproducibile e RDs persistenti.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Associazione per la Ricerca in Oftalmologia e Vision Statement per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dal Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitato Animal Care.

1. Pretrattamento

1. Anestetizzare un 8 settimane di età mouse con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di 60 mg / kg di ketamina e 6 mg / kg xilazina.
2. Tagliare i baffi. Ciò avviene perché interferiscono con la visualizzazione e il posizionamento dello strumento.
3. Dilatare la pupilla con il 5% fenilefrina e dello 0,5% tropicamide.
4. Tagliare le ciglia. Questo è anche fatto perché interferiscono con la visualizzazione e il posizionamento dello strumento.
5. Applica anestesia topica (0,5% proparacaina cloridrato soluzione oftalmica).

2. Chirurgia sotto il microscopio

1. Impostare il mouse in un pos lateraleition con il naso verso il chirurgo. Un pizzico punta viene eseguito per confermare l'anestesia chirurgica e guanti sterili sono indossato prima di iniziare l'intervento chirurgico.
2. Incidere la congiuntiva temporale al limbus posteriore e separare la congiuntiva della sclera. Evitare di penetrare la sclera. Dopo questo passo, afferrare la congiuntiva al limbus con una pinza per controllare l'occhio.
3. Effettuare un'incisione sclerale autosigillante con la punta di un ago G 30 con la smussatura rivolta verso l'alto. Fare un tunnel sclerale attraverso la sclera e penetrare la sclera nella coroide (Figura 1). Evitare di penetrare la retina. Se l'emorragia si verifica coroide ed esce attraverso la ferita sclerale, eseguire un astriction con una lancia chirurgica fino a quando le fermate sanguinamento. Questa ferita sclerale sarà auto-sigillato con pressione intraoculare.
4. Pungere la cornea con un ago 30 G per ridurre la pressione intraoculare. Utilizzare l'ago parallelo alle diaframma per evitare di ferire l'iride e lente durante entry nella camera anteriore. La pressione intraoculare causerà la ferita di auto-guarnizione.
5. Inserire un ago G 33 collegato ad una siringa Hamilton 10 microlitri nello spazio sottoretinico con lo smusso rivolto verso il basso (verso l'occhio interiore), e iniettare 3,5 ml di sodio ialuronato delicatamente per staccare la retina neurosensoriale dal RPE sottostante. Evitare di penetrare la retina con l'ago 33 G perché ialuronato di sodio andrà nello spazio vitreo ma non lo spazio sottoretinico se la retina è penetrato. Inoltre, evitare iniezione rapida perché creerà una lacrima orale, e ialuronato di sodio colerà nella camera anteriore.
6. Lasciate che l'umore acqueo fuoriuscire dalla puntura della cornea spingendo la cornea intorno alla puntura corneale con una pinza per regolare la pressione intraoculare.
7. Confermare l'assenza di perdite dalla ferita sclerale con una sonda chirurgica.
8. Per ridurre il rischio di perdite di ialuronato di sodio, collocare cianoacrilato colla chirurgica sula ferita sclerale.
9. Riattaccare la congiuntiva nella posizione originale usando cianoacrilato colla chirurgica. Ciò consentirà di ridurre ulteriormente il rischio di perdite ialuronato di sodio.
10. Controllare il fondo con un vetro di copertura e confermare la creazione di un RD bollosa, senza emorragia sottoretinico.

3. Dopo il trattamento

1. Applicare bacitracina pomata antibiotica all'occhio per ridurre il rischio di infezione.
2. Tenere il mouse su una piastra elettrica per impedire l'anestesia (miscela di ketamina e xilazina) di causare bassa temperatura corporea successiva alla bassa pressione sanguigna.
3. Mettere i topi in gabbia animale dopo si risvegliano dall'anestesia. Monitorare i topi al giorno per complicazioni. Se sorgono complicazioni, eutanasia il mouse come descritto di seguito.

4. Sacrificio

1. Euthanize il topo per dislocazione cervicale dopo iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di sodio pentobarbital e enucleaTe gli occhi appropriati intervalli di tempo per ogni esperimento (non mostrato). Evitare di applicare pressione sugli occhi durante enucleazione perché ialuronato di sodio potrebbe fuoriuscire. RDs bollose dovrebbero essere persistente per almeno 14 giorni.

Risultati

Per valutare la persistenza del RD fatta da questo protocollo, criosezioni sono stati effettuati nei giorni 3, 7, e 14 dopo l'induzione di RD. Sei occhi sono stati usati per ogni punto temporale. Ematossilina ed eosina (HE) colorazione è stato usato per visualizzare le sezioni. Tutte le sezioni mostrato un RD bollosa avvicinando la lente (Figura 2). Un occhio mostrato emorragia sottoretinico il giorno 7. Nessun occhi mostravano segni di infezioni o lesioni lente.

Figura 1. Creazione un'incisione sclerale autosigillante. Questo schema mostra un'immagine in sezione trasversale di un occhio normale mouse. La linea rossa indica l'autosigillante incisione sclerale. Un tunnel sclerale seguita dalla penetrazione sclerale nella coroide con un ago G 30 crea un'incisione sclerale autosigillante. Questa ferita scleralesarà auto-sigillato con pressione intraoculare, che può impedire la perdita di ialuronato di sodio dopo l'iniezione nello spazio sottoretinico e raggiungere persistenti distacchi retinici bollose.

Figura 2. Naturalmente il tempo di distacco di retina. Questa foto fundus mostra un distacco di retina bolloso senza emorragia sottoretinico subito dopo l'intervento chirurgico. Criosezioni con ematossilina ed eosina (HE) colorazione spettacolo persistente distacco di retina bolloso senza emorragia sottoretinico attraverso almeno 14 giorni.

Discussione

Diversi metodi per la creazione di un modello di RD negli occhi di roditori sono stati segnalati ^{3-15, 22.} La maggior parte di loro utilizzano iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio perché è un materiale viscoso comunemente usato durante la chirurgia intraoculare nell'uomo, e non è associata ad alcuna nota tossicità oculare ^1-15. Ialuronato di sodio, piuttosto che normale soluzione salina o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), aumenta la durata del RD.

I metodi per l'iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio utilizzare uno dei due approcci: un approccio transvitreal ^3-6 o di un approccio transscleral ^7-15. Entrambi i metodi vengono eseguite con l'osservazione del fondo. Nell'approccio transvitreal, un iniettore sottoretinico viene introdotto nella cavità vitreale, un retinotomia viene creato nella retina periferica, e il sodio ialuronato viene iniettato nello spazio sottoretinico. In questo metodo, due rotture retiniche sono fatti, che aumenta il rischio di retinal emorragia che potrebbe andare nello spazio sottoretinico. Inoltre, vi è il rischio di lesioni dell'obiettivo quando viene creato il retinotomia. Ci sono diversi metodi modificati per l'approccio transscleral. Nella maggior parte di questi metodi ^7-12, dopo riduzione della pressione intraoculare con una puntura camera anteriore, un ago G 30 collegato ad una siringa riempita di ialuronato di sodio è direttamente inserita nello spazio sottoretinico attraverso la congiuntiva, sclera, coroide, e RPE. Il ialuronato di sodio viene quindi iniettato nello spazio sottoretinico. Il rischio di strappo e lente lesioni retiniche con questo metodo transscleral è inferiore che utilizzando l'approccio transvitreal. Tuttavia, il foro praticato nella sclera da un ago 30 G è grande, soprattutto per gli occhi del mouse, e il sodio ialuronato iniettato nello spazio sottoretinico fuoriesce facilmente fuori dall'occhio attraverso la ferita sclerale. Questo porta ad un più basso, RD meno persistente e più morte cellulare dei fotorecettori variabile. Inoltre, se l'emorragia coroideale si verifica inil passo perforazione sclerale, l'emorragia si diffonderà nello spazio sottoretinico perché la pressione intraoculare è stata ridotta prima della iniezione ialuronato sottoretinico.

Diversi fattori possono influenzare l'effetto del RD sulla retina distaccata, che comprende sia l'emorragia sottoretinico e l'altezza e la persistenza di RD ^16-21. Cellule fotorecettore morte aumenta con l'aumentare dell'altezza del RD ^{16, 17,} e danni alle cellule fotorecettori possono essere più ampia a causa della ridotta diffusione di ossigeno e di nutrienti essenziali dalle coriocapillare con una maggiore RD rispetto a poco RD. Emorragia sottoretinico è anche tossico per le cellule fotorecettrici ^18-21; possibili meccanismi di questa tossicità nella retina distaccata comprendono l'ipossia e la distruzione metabolica da emorragia sottoretinico come barriera di diffusione, e neurotossicità diretta indotta da componenti del sangue (come il ferro). Lesioni Lens, che è stato segnalato per avere un effetto protettivo sulla retinacellule gangliari nali ^23, possono anche influenzare la morte delle cellule fotorecettori dopo l'induzione di RD. Inoltre, se il sito di entrata ferita non è sigillato, ialuronato di sodio potrebbe fuoriuscire con la manipolazione occhi durante l'enucleazione. Questo può portare alla classificazione errata di un RD come superficiale, che può a sua volta influenzare l'interpretazione dei risultati.

Abbiamo modificato il metodo transscleral per l'iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio per aumentare la riproducibilità di RDS e ridurre il tasso di emorragia sottoretinico. La fase critica di questo protocollo è la creazione di un'incisione sclerale autosigillante utilizzando un ago G 30, che impedisce la fuoriuscita di ialuronato di sodio dopo l'iniezione. A differenza dei metodi precedenti, questo protocollo viene eseguita senza l'osservazione del fondo oculare in modo maggiore attenzione è rivolta alla ferita sclerale. Applicazione di colla impedisce anche il sodio ialuronato di fuoriuscire dell'occhio. Nella nostra esperienza, il tasso di emorragia sottoretinico con questo protocollo wsignificativamente inferiore a quella di altri protocolli. Se l'emorragia coroideale si verifica durante la fase di incisione sclerale, uscirà l'occhio attraverso la ferita sclerale perché questo passo è eseguito prima di ridurre la pressione intraoculare. Se l'emorragia coroideale si verifica dopo la riduzione della pressione intraoculare e distacco della retina neurosensoriale, sangue sezionare nello spazio sottoretinico. Abbiamo trovato che questo accada in circa il 5% dei casi in contrasto con circa il 10-20% con le altre tecniche. Questi animali dovrebbero essere esclusi dall'analisi.

Questa tecnica può essere utilizzata anche per l'iniezione sottoretinico mediata da vettori di trasferimento genico per colpire le cellule fotorecettrici o RPE ^{24, 25.} Poiché il veicolo tipico (PBS, soluzione salina) per queste iniezioni è significativamente meno viscoso di ialuronato di sodio, tecniche standard sono afflitti da più perdite. La tecnica qui descritta, riducendo tale rischio, rende esperimenti di trasferimento vettore più riproducibile eaffidabile.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% fenilefrina / 0,5% tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0,5% proparacaina cloridrato soluzione oftalmica	AKORN	17478-263-12
Provics	Alcon	8065183085
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscopio	Leica	MG90
30G1/2 Precision Glide Ago	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 microlitri Siringa	Hamilton	7635-01
33 gauge, ago da 0,5 pollici	Hamilton	7803-05
Vetro di copertura 18x18mm	Fisher Scientific	18-548A