"Freeze-cracking," un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Per macchiare C. elegans con anticorpi, la cuticola relativamente impermeabile devono essere aggirati con metodi chimici o meccanici. "Freeze-cracking" è un metodo utilizzato per estrarre fisicamente la cuticola da nematodi comprimendo nematodi tra due diapositive aderenti, il congelamento, e tirando le diapositive a parte. Freeze-fessurazione fornisce un modo semplice e rapido per ottenere l'accesso ai tessuti senza trattamenti chimici e può essere utilizzato con una varietà di fissativi. Tuttavia, porta alla perdita di molti dei campioni e la compressione richiesta distorce meccanicamente il campione. La pratica è necessaria per massimizzare il recupero di campioni con buona morfologia. Freeze-fessurazione può essere ottimizzato per le condizioni specifiche di fissazione, recupero di campioni, o bassa colorazione non specifica, ma non per tutti i parametri contemporaneamente. Per gli anticorpi che richiedono condizioni di fissazione molto duri e tollerano i trattamenti chimici necessari per permeabilize chimicamente la cuticola, treatment di nematodi intatte in soluzione può essere preferito. Se l'anticorpo richiede una correzione chiara o se le condizioni ottimali di fissaggio sono sconosciute, liofilizzazione di cracking fornisce un modo molto utile per saggiare rapidamente l'anticorpo e può produrre specifiche informazioni di localizzazione subcellulare e cellulare per l'antigene di interesse.
Introduzione
Per determinare la localizzazione cellulare e subcellulare di proteine, gli scienziati hanno tradizionalmente etichettati tessuti con anticorpi selezionati per riconoscere specificamente particolari proteine 1. In alcuni organismi modello come C. elegans, colorazione anticorpale è stato spesso sostituito da tecniche genetiche molecolari, che danno risultati più rapidamente. Questi includono organismi trasformante con costrutti costituiti da fusioni geniche tra il promotore e regioni codificanti del gene di interesse e proteina fluorescente verde. Tuttavia, le tecniche molecolari sono soggette a una serie di manufatti, compresi i problemi conness....
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Protocollo
NOTA: Più passaggi di protocollo vengono presentati con opzioni per set-up e la preparazione a seconda delle specifiche condizioni dell'esperimento. Per questi casi, passaggi alternativi vengono presentati come A, B, C, ecc Il protocollo con la procedura alternativa è illustrato in Figura 1.
1. Preparazione di diapositive Polilisina rivestite
Tre diversi tipi di diapositive possono essere utilizzati a seconda del compromesso desiderato tra facilità di preparazione, relativa adesione, e il legame non specifico dell'anticorpo. Dettagli di alternative preparazione dei vetrini sono ....
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Risultati
Quando i vermi sono adeguatamente compressi, incrinato, e leggermente fissi, praticamente l'intero worm può essere accessibile a colorazione anticorpale (vedi figura 2). La posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DAPI indica quali parti del verme sono intatti Quando i vermi sono sottoposti ad un fissativo più duro, come la formaldeide, la morfologia della vite senza fine può essere distorta (come si vede dalla comparsa innaturale ondulata del muscoli nelle figure 3a-D)........
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Discussione
Il protocollo di congelamento di cracking è uno dei diversi metodi per la colorazione degli anticorpi in C. elegans. Esso fornisce un modo relativamente semplice per colorare i vermi, ma richiede reagenti specifici e pratica per ottenere risultati ottimali. Passaggi critici (descritti nella Figura 1) includono: 1) preparazione del vetrino (vedi punti 1 e 2) la compressione manuale dei nematodi (vedere i passi 2 e 3) di fissaggio rapido (vedi punto 3). In primo luogo, per massimizzare l'ades.......
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Dichiarazioni
L'autore dichiara che lei non ha interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito da NSF CCLI # 0633618 e Ohio University. Alcuni ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center. Studente laureato Reetobrata Basu appare nel video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| vetrino in poli-L-lisina (marca ESCO) | Fisher | 12-545-78 | vetrini di marca Sigma adatti anche |
| poli-L-lisina bromidrato | Sigma | P1524 | IMPORTANTE: Marca e alto peso molecolare dei |
| vetrini con bordo smerigliato singolo | Fisher | 48312-002 | Altre marche sono adatte |
| azoturo di sodio | Sigma | S2002-25G | TOSSICO, indossare guanti e maschera mentre si pesa la polvere per fare il 10% di scorta. Indossare i guanti durante il pipettaggio della soluzione madre |
| vaso di colorazione coplin | VWR | 47751-792 | Altre marche sono adatte |
| Mailer a 5 vetrini | Microscopia elettronica Scienza | 71549-01 | Una delle tante marche diverse di piccoli portavetrini, adatto per la colorazione |
| Paraformaldeide | VWR | MK262159 | IMPORTANTE: Le normali soluzioni di formalina (37% di formaldeide) NON sono adatte. 1) Sciogliere la paraformaldeide crisatlalina in tampone fosfato e conservarla in piccole aliquote congelate. O 2) acquistare paraformaldeide di grado microscopico elettronico in aliquote. TOSSICO - indossare guanti; Smaltire il lavello in eccesso con acqua. |
| Soluzione di glutaraldeide, 25% in acqua | Sigma | G 5882 | IMPORTANTE: acquistare glutaraldeide di grado per microscopia elettronica in fiale; TOSSICO - indossare guanti; Smaltire il lavello in eccesso con acqua. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Altre marche sono adatte |
| Siero bovino Albumina Fisher | ICN820451 | Altre marche sono adatte | |
| Siero d'asino, liofilizzato | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Altre marche sono adatte |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | Questa azienda è consigliata per anticorpi multi-label di alta qualità (con affinità depleta). Selezionare il colorante e l'antigene appropriati (animale utilizzato per allevare l'anticorpo primario). |
| n-propil gallato | Fisher | ICN10274750 | Altre marche sono adatte |
| DAPI, 4',6'-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato | Sigma | D 9542 | TOSSICO. Indossare i guanti ed erogare in piccole aliquote e tassare per ridurre al minimo l'esposizione |
| Whatman #1 Filtri da 15 cm di diametro | Fisher | 09805G | |
| Vetrino coprioggetti #1 1/2 rettangolo 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 lo spessore è otticamente migliore |
| Cartella per vetrini per microscopio | VWR | 48429-092 | Altre marche sono adatte |
Riferimenti
- Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.
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Ristampe e permessi
