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Articolo metodologico

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l'uso di un solvente organico

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⸱

DOI:

10.3791/50671

⸱

1 novembre 2013

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l'allergia, l'asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche 1 per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan 2.

Abstract

I mastociti svolgono un ruolo importante nella malattia allergica e la difesa immunitaria contro i parassiti. Una volta attivato (ad esempio da un allergene), essi degranulano, un processo che comporta la esocitosi di mediatori allergici. Modulazione di degranulazione dei mastociti da farmaci e sostanze tossiche può avere effetti positivi o negativi sulla salute umana. Funzione mastociti è stato sezionato in dettaglio con l'uso di ratto basofile mastociti leucemiche (RBL-2H3), un modello largamente accettato di mastociti mucosali umane 3-5. Mast componente cellulare dei granuli e il mediatore allergica β-hexosaminidase, che viene rilasciato linearmente in tandem con istamina dai mastociti 6, possono essere facilmente ed attendibilmente misurati tramite reazione con un substrato fluorogenico, cedendo misurabile intensità di fluorescenza in un saggio di micropiastra che è suscettibile di studi di high-throughput 1. Originariamente pubblicato da Naal et al. 1, abbiamo adattato questo dosaggio degranulazione per lo screening of farmaci e sostanze tossiche e dimostrare il suo uso qui.

Triclosan è un agente ad ampio spettro antibatterico che è presente in molti prodotti di consumo ed è stato trovato per essere un aiuto terapeutico in malattie allergiche della pelle umana 7-11, anche se il meccanismo di questo effetto è sconosciuta. Qui mostriamo un saggio per l'effetto del triclosan sulla degranulazione mastocitaria. Abbiamo recentemente dimostrato che il triclosan influenza fortemente la funzione delle cellule mast 2. Nel tentativo di evitare l'impiego di un solvente organico, triclosan è disciolto direttamente in tampone acquoso con il calore e agitazione, e la concentrazione risultante viene confermata mediante spettrofotometria UV-Vis (usando 280 ε = 4,200 L / M / cm) 12. Questo protocollo ha il potenziale per essere usato con una varietà di prodotti chimici per determinare i loro effetti sulla degranulazione dei mastociti, e più in generale, il loro potenziale allergico.

Introduzione

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi 13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato 15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l'esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni 15. Questo processo determina l'avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni 15.

Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) 17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI 17, ed è questa so-chiamato "reticolazione" di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l'attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule 18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi 15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare 19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio 20, consentendo l'identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio 20.

Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina 6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. 1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un'alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base 21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest'ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio "Test di tossicità nel 21 ° secolo: una visione e di una Strattegia "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l'uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. 1 e modificato da noi 2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili 3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. 22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata.

Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo 23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l'inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi 25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm 24. L'impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell'uomo 27-29 e nei corsi d'acqua 30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che 27 TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle 31-37. Queckenberg et al. Trovato 37 ~ 10% l'assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono.

TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana 7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta 38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici 2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. 2 suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell'importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un'ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che 39 TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata.

Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino 40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l'ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio 2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l'interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati 51. In effetti, secondo Rufli et al. 52 e altri 53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria 2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation 54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità.

Non solo è importante considerare l'azione di solventi sull'organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l'effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. 51 hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti 50,51.

Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS 2 eliminando l'uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm 58 con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm 12.

Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l'ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.

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Protocollo

Notare che tutte le ricette di buffer sono incluse in una tabella alla fine del testo protocollo.

1 ° GIORNO:

1. Preparazione di cellule

  1. Pianificare 96 pozzetti schema di configurazione di piastra, centratura campioni di prova sul layout in modo da evitare effetti di bordo. Allocare tre repliche per ogni concentrazione TCS testata (± degranulazione stimolante di antigene o ionoforo), nonché per triplica rilascio spontaneo (senza stimolante degranulazione), massimo rilascio (0,2% Triton X-100 [TX] detersivo lisi), nonché pozzi riservato per campioni di sfondo (che non contengono cellule). Per ogni giorno di sperimentazione replica, scegliere un nuovo layout randomizzato delle concentrazioni del campione TCS.
  2. Warm RBL multimediale (ricetta fornita in tabella) e tripsina a 37 ° C bagnomaria.
  3. Controllare le cellule RBL in-25 T pallone (2-4 giorni senza passaggio e meno di 3-4 mesi da quando sono stati scongelati) per i segni generali di buona guarigioneth: corretto pH indicato dal colore dei media, e la mancanza di nuvolosità. Porre il pallone con un microscopio ottico per confermare che il pallone è libero di contaminazione e che le cellule appaiono sani, correttamente confluenti, e principalmente allegata. Si noti che le celle devono essere controllati per la contaminazione da micoplasma circa ogni sei settimane 22.
Trattamento Triplicati
Stimolato, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimolato, 0.001 micron TCS F6, G6, H6
Stimolato, 0.1 mM TCS A4, B4, C4
Stimolato, 1 mM TCS A6, B6, C6
Stimolato, 5 mM TCS F5, G5, H5
Stimolato, 10 mM TCS A3, B3, C3
Stimolato, 15 mM TCS A5, B5, C5
Stimolato, 20 mM TCS F7, G7, H7
Stimolato, più alto [TCS] F3, G3, H3
Spontanea, No TCS (include deride) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, No TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
Nessun Cells, sfondo, più alto [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

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  1. Prendere il pallone cellula RBL nella coltura del tessuto sterile (TC) cappuccio. Le cellule sono attaccate al bottom del pallone. Lavora sotto il cofano TC e con tecnica sterile standard Rimuovere qualsiasi supporto dalle pallone con pipetta sterile, le cellule rimangono attaccate al fondo del pallone. Successivamente, sciacquare pallone con 2 ml di tripsina, poi scarta questo lavaggio.
  2. Aggiungere esattamente 2 ml di tripsina per coprire fondo del pallone. Messo in 37 ° C incubatore per 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal fondo del pallone.
  3. Dopo 5 min, ha colpito il lato del pallone con una palma aperta per allentare cellule. Immediatamente, aggiungere 18 ml supporto RBL per lavare le cellule fuori il pallone e per placare la tripsina. Prendere subito la miscela di cellule-media-tripsina fuori del pallone e il trasferimento ad un nuovo, sterile tubo da 50 ml (il volume totale di questo tubo è ora 20 ml).
  4. Dopo aver mescolato delicatamente, ma accuratamente, togliere 50 microlitri di sospensione cellulare da questo tubo, e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml sterile, che è un campione da contare. Prendere questo campione, così come il 50 ml0; provetta contenente la miscela di cellule-media-tripsina fuori della cappa TC al banco.
  5. Gira il tubo da 50 ml in centrifuga (con il giusto equilibrio) per 8 minuti a 500 xg; questa forza cellule pellet in modo efficace.
  6. Durante il tempo di rotazione, contare le cellule nel campione che sono stati isolati prima della filatura. Per fare questo, in primo luogo aggiungere 50 ml di colorante blu tripano a 50 ml di cellule in 1,5 ml di tubo, e delicatamente ma accuratamente pipetta su e giù per 5 volte per mescolare. Immediatamente, trasferire 10 ml di questa miscela al hematocytometer vetro, e contare le cellule nella zona griglia seguendo le istruzioni del produttore. Contare almeno 100 cellule per risultati statistici ragionevoli.
  7. Indietro nel cofano TC, rimuovere il surnatante dalle cellule che sono stati centrifugati.
  8. Chiudere la provetta cella, e flick pellet sul fondo della provetta per allentare cellule.
  9. Aggiungere supporti trypsinized cellule per produrre una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml, in base al numero di celle.
  10. Mescolate bene, ma delicatamente per mantenere le cellule in sospensione nel corso del processo di rivestimento. Utilizzando una Pipetman, mettere 100 cellule microlitri / pozzetto in una piastra da 96 pozzetti (fondo piatto nero), seguendo il foglio di modello piatto. Randomize come le cellule vengono distribuiti nei pozzetti per evitare errori sistematici, e mescolare dopo ogni serie di tre pozzi viene aggiunto. Essere sicuri di non mettere le cellule nei pozzetti etichettati per i campioni di sfondo.
  11. Una volta che tutte le cellule sono state trasferite, mettere il coperchio piastra sulla piastra, e trasferimento in incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) durante la notte. Pulire seguendo una tecnica sterile standard.

GIORNO 2:

2. Preparazione di Triclosan

  1. Usando un cilindro graduato, misura 250 ml Tyrodes Buffer (ricetta fornita in tabella) in una beuta da 500 ml con l'etichetta "TCS-buffer." Aggiungi mescolare bar. Usare vetreria, mescolare bar, termometro designato per l'uso con TCS solo.
  2. Anche in questo momento, misura 250Tyrodes ml in un pallone da 500 ml a parte Erlenmeyer, con l'etichetta "tampone di controllo." Usare vetreria, mescolare bar, termometro che non sono designati per TCS. Aggiungi mescolare bar.
  3. Pesare 0,0022 g di TCS granuli e trasferimento a pallone "TCS-buffer" (che contiene 250 ml Tyrodes Buffer). Per trasferire in modo efficiente granuli alla beuta, utilizzare 10 ml dalle misurate 250 ml Tyrodes per lavare via pesare imbarcazione, assicurandosi che tutti TCS è stato trasferito.
  4. Boccetta Place "TCS-buffer" su una combinazione di piastra riscaldante / piastra di agitazione magnetica, e la mise a mescolare in un gestibili alta velocità. Una volta ben amalgamato, questo stock TCS sarà nominalmente di 30 micron (concentrazione effettiva sarà calcolato dopo il riscaldamento). (Fate tutto miscelazione sotto cappa chimica.)
    1. Anche in questo momento, posizionare il pallone "controllo del buffer" (non contenente TCS) su una combinazione seconda piastra / piastra di agitazione magnetica, e impostarlo a mescolare ad una velocità simile.
  5. Accendere lampada UV / Vis a riscaldare la lampada per un uso successivo.
  6. Riscaldare la soluzione "TCS-tampone" a 50 ° C mescolando continuamente. Una volta in temperatura, il tempo di 90 min. Durante la 90 min, continuerà a monitorare 50 ° C di temperatura e velocità adeguata mescolando spesso.
    1. Contemporaneamente, riscaldare la soluzione "controllo del buffer" (che è solo 250 ml di tampone Tyrodes plain) a 50 ° C con agitazione continua. Dopo aver raggiunto 50 ° C, il tempo per 90 min, durante i quali la temperatura tempo (mantenendo a 50 ° C) e agitazione sono entrambi controllati.
  7. Alla fine del 90 min, prendere entrambe beute fuori le piastre e il trasferimento al banco.
  8. Utilizzando la funzione di scansione lunghezza d'onda su uno spettrofotometro UV / Vis, vuoto la macchina su 1 ml della soluzione riscaldata "controllo del buffer" prima della scansione 1 ml di soluzione riscaldata "TCS-buffer". Controllare la forma dello spettro, und Valore di assorbanza record a 280 nm. Per determinare la concentrazione, utilizzare l'equazione di Beer-Lambert (A 280 = 280 ε ℓ c) utilizzando un ε 280 di 4200 L / mol / cm 12 e ℓ di 1 cm.
  9. Dopo la determinazione della concentrazione TCS, aggiungere 0,249 g di albumina di siero bovino (BSA) al residuo 249 ml della soluzione di "TCS-buffer", e mescolare bene.
    1. Allo stesso tempo, aggiungere 0,249 g di BSA per il restante 249 ml di soluzione "tampone di controllo", e mescolare bene.

GIORNO 2:

3. Antigene-stimolata Assay Degranulazione utilizzando cellule RBL-2H3

  1. Prima di iniziare, controllare il pH di tutti i buffer in uso, e di garantire che essi siano chiari e non nuvoloso: questo include tampone Tyrodes, tampone di acetato di sodio e glicina tampone carbonato (ricette forniti in tabella).
  2. Caldi i media RBL e della tripsina in 37 ° C bagnomaria.
  3. Fai BT (1 mg / ml0; BSA in Tyrodes tampone): 0,05 g BSA + 50 ml Tyrodes Buffer (X2). Messo in 37 ° C bagnomaria.
  4. Rendere 0,2% Triton X-100: 3.136 ml di BT + 64 ml di 10% Triton X-100 (concentrazione finale di Triton X-100 è 0,2%). Mescolare bene per inversione, ma non fare vortice. Messo in 37 ° C bagnomaria.
  5. Inizio preparazione del TCS e tampone Tyrodes riscaldata (passi "2," di cui sopra). Nota: Non avviare la fase successiva (esposizione IgE) fino a quando il "TCS-buffer" e soluzioni "tampone di controllo" raggiungono 50 ° C e mescolare per il primo 70 min del tempo 90 min calore / agitazione.
  6. Una volta che entrambe le soluzioni sono stati agitati a 50 ° C per 70 min, compongono 0,1 mcg / ml anti-DNP IgE di topo (Sigma) in mezzi RBL per pozzetti del campione ad essere sensibilizzati (100 pl / pozzetto). IgE magazzino non deve essere più vecchio di 30 giorni se conservati a 4 ° C; registrare quanti anni lo stock è. Flick per mescolare, ma non vortice IgE.
  7. Sotto una cappa di TC,aggiungere 0,6 ml di IgE (stock è di 1 mg / ml) a 6 ml supporto RBL in un tubo da 50 ml. In un secondo tubo da 50 ml, aggiungere 6 ml di supporti di sola RBL pianura (che è destinato per i campioni nonsensitized).
  8. Dump tutti i supporti da piastra a 96 pozzetti (che è stato preparato il giorno 1) nel lavandino, e portare il piatto sotto il cofano TC.
  9. Casualmente aggiungere 100 mezzi pl / IgE miscela di pozzi che dovrebbe essere promossa (48 pozzi totale). Questa miscela non è inteso per "spontaneo", "TX" e campioni "Background".
  10. Casualmente Aggiungere 100 ml supporto RBL pianura solo a "TX", "spontaneo" e "pozzi di sfondo".
  11. Mettete il coperchio piastra sulla piastra, e poi passare piastra in 5% di CO 2/37 ° C incubatore per 1 ora.
  12. Durante 1 ora di incubazione, seguire i passaggi da 3,13-3,24.
  13. Sul banco, preparare le diluizioni antigene. Aggiungere 0,53 ml di 1,6 mg / ml di brodo di DNP-BSA + 850 ml & #160; BT per ottenere una concentrazione di antigene di 1 mg / ml. Vortex e invertire questo stock di mescolare.
  14. Una volta "TCS-buffer" e "buffer di controllo" sono stati riscaldati e quindi agitata per 90 min a 50 ° C, proseguire con il resto della preparazione per il protocollo TCS (andare ai punti 2.6 - 2.8.1). Dopo la BSA è disciolto in entrambe le soluzioni, continuare sotto.
  15. Iniziare a preparare i buffer di esposizione, con ± Ag, ± TCS. Prima, dal campione 249 ml di soluzione di "TCS-buffer" (che è già stata riscaldata e agitata per 90 min), 50 ml di trasferimento ad una nuova provetta da 50 ml. Rimuovere 20 pl di questa 50 ml aliquota e sostituirlo con 20 microlitri della 1 ug / ml antigene preparato in precedenza per una concentrazione finale di antigene di 0,0004 mg / ml BSA-DNP. Vortex e capovolgere.
    1. Etichetta di questo "tubo 1, alta TCS / Ag + / + BT." E 'utilizzato per diluizioni e più alta concentrazione di esposizione TCS.
  16. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta 50 ml. Rimuovere 20 pl di questa nuova aliquota da 50 ml e sostituire con 20 microlitri di 1 mg / ml di antigene preparato in precedenza per una concentrazione finale di antigene di 0,0004 mg / ml BSA-DNP. Vortex e capovolgere.
    1. Etichetta di questo "tubo 2, No TCS / Ag + / + BT". Usato per TCS diluizioni e 0 mM di esposizione concentrazione TCS.
  17. Ora estrarre 50 ml di soluzione di "TCS-buffer" e messo in un'altra provetta da 50 ml. Rimuovere 20 microlitri da questa nuova aliquota da 50 ml e sostituirlo con 20 pl di pianura BT. Vortex e capovolgere. Viene aggiunto alcun antigene.
    1. Etichettare questo "tubo 3, alta TCS / No Ag / + BT." Questo è utilizzato per lo sfondo.
  18. Trasferire 50 ml di soluzione di "controllo del buffer" in un'altra provetta da 50 ml. Estrarre 20 ml da questo ne w-50 ml aliquota e sostituirlo con 20 l di pianura BT. Vortex e capovolgere. (Si aggiunge n Ag.)
    1. Etichettare questo "tubo 4, No TCS / No Ag / + BT." Questo è usato per lo sfondo e campioni spontanei.
BSA TCS Antigen
Tubo 1 figure-protocol-2 Elevata [] figure-protocol-3
Tubo 2 figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
Tubo 3 / Files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Elevata [] NO
Tubo 4 figure-protocol-6 NO NO
  1. Calcolare e registrare volumi per la diluizione dopo la determinazione della concentrazione dello stock "TCS-buffer". Il volume totale di ogni concentrazione di diluizione deve essere di 1 ml e deve essere preparato in una provetta sterile. Utilizzare P2 calibrata e P1000 Pipetman.
Concentrazione Alta Triclosan + Tyrodes + BSA 0,0004 mg / ml Ag
(Tubo 1 da sopra) 		Riscaldata BT 0,0004 mg / ml Ag
(Tubo 2 dall'alto)
20 micron
15 micron
10 micron
5 pM
1 pM
0,1 micron
0.001 mM
0 mM (in alto della piastra) ----------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
0 micron (fondo piatto) ----------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
  1. Dopo 1 ora di incubazione IgE, prendere piastra di incubatore e lanciare tutti i media nel lavandino. (Nota: se le sostanze chimiche di prova sono noti per essere più tossico del prodotto TCS consumatore, smaltimento dei rifiuti pericolosi può essere necessario.)
  2. Utilizzando un Combitip, casualmente lavare le cellule nella piastra a 96 pozzetti con BSA-Tyrodes Buffer (200pl / pozzetto). Rilasciare il tampone di lavaggio sui lati dei pozzetti, anziché direttamente sulle cellule attaccate, per evitare di disturbare le cellule attaccate. Ripetere la procedura una seconda volta.
  3. Per preparare trattamenti per l'applicazione, vortex e invertire diluizioni destra prima aggiunta alla piastra.
  4. Partendo con la sezione superiore della piastra: Casualmente metti triplicato di 200 microlitri ciascuna delle soluzioni di antigene (con corrette concentrazioni di TCS) ai pozzetti corrispondenti. Continuare a fondo piatto. Aggiungere la soluzione di "controllo del buffer" plus Ag (da "Tubo 2" di cui sopra) per tutte le "prende in giro" sul piatto.
  5. Aggiungere 200 ml di soluzioni adeguate ai pozzetti:
    1. Aggiungere 200 microlitri di 0.2% Triton X-100 pozzi a "TX"-designati.
    2. Successivamente, aggiungere 200 ml di tubo 3 per i 3 pozzetti "Background (bkgd)-Massima TCS" sul piatto.
    3. Infine, aggiungere 200 microlitridi tubo da 4 a 6 pozzetti "spontanea".
  6. Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C / 5% di CO 2.
  7. Durante 1 ora di incubazione: Prendi due secchi di ghiaccio (uno per piatto "vecchio" in incubatrice e una per nuova piastra). Disgelo 4-metilumbelliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU) a temperatura ambiente fino a 40 min, mantenendo in stagnola perché è sensibile alla luce.
    1. Dopo 4-MU magazzino è scongelato, costituiscono la soluzione 4-MU di lavoro: 150 magazzino ml + 14,85 ml di soluzione tampone a freddo (ricetta data in tabella); vortice e capovolgere. Tenete a 50 ml tubo da centrifuga, avvolto in carta stagnola, e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    2. Utilizzando Combitip, aggiungere in modo casuale 100 microlitri soluzione di lavoro 4-MU fredda nella parte inferiore di ciascun pozzetto di una nuova Grenier nero piastra a 96 pozzetti (il secchiello per il ghiaccio # 2). Iniziare prima aggiungendo la soluzione di lavoro in modo casuale all'interno della parte superiore della piastra, in modo casuale all'interno del fondo della piastra, in modo casuale all'interno di Triton X-100 pozzi,e, infine, in modo casuale all'interno di pozzi di sfondo.
    3. Uscire nuova scatola di P200 consigli per passo successivo.
  8. A fine incubazione di 1 ora, mettere piastra di cella da incubatore sul secchiello # 1, pipetta surnatante su e giù 4-5x (dolcemente, non introducendo bolle), aggirando il bene per buona miscelazione ma non toccare le cellule, mentre la miscelazione . Sistematicamente, estrarre un campione di 25 microlitri di ogni bene e di luogo nella nuova piastra con substrato (stesso ordinamento di campioni, come originariamente pianificato). Pipettare su e giù per mescolare campione accuratamente quando in nuovo pozzo, senza introdurre bolle.
  9. Incubare per 30 min a 37 ° C / 5% di CO 2.
  10. Dopo 30 minuti di incubazione, in modo casuale aggiungere 200 ml di tampone glicina-carbonato di freddo per pozzetto (usando Combitips) per riempire i pozzi fino a 325 microlitri totale. (Fare questo oltre ai Triton X-100 campioni scorso, al fine di evitare Triton X-100 spillover). Verificare la presenza di bolle prima piastra di lettura (colpire con clean P10 pipettate punta al pop tutte le bolle).
  11. Eseguire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza (vai alla sezione 4).

GIORNO 2:

4. Piastra fluorescente Istruzioni Reader e analisi dei dati

  1. Aprire Gen5 programma, e la sezione esperimento aperto.
  2. Accendere il lettore di piastre e inserto piatto (in alto a sinistra è A1).
  3. Protocollo figure-protocol-7 Procedura figure-protocol-8 Leggi per impostare letture personalizzate. Non aggiungere nulla campioni replicati, ecc, al fine di raccogliere dati grezzi fluorescenza da ciascun pozzetto.
  4. Sotto "Leggi" scegliere "fluorescenza", "Punto finale", "Velocità Normale", "Guadagno 40", "eccitazione 360/40", "Emissione 460/40," posizione di Ottica: Top 50%. Top ottica offset: 7mm. Nessuna scossa, nessun ritardo, nessun cinetica, nessun monitor bene, la temperatura: incubatrice off.
  5. Scegli fondo piatto nero, piastra a 96 pozzetti (Grenier 96 pozzetti, fondo piatto).
  6. Accordo con il layout di piastra: Protocollo figure-protocol-9 layout della piastra. Impostare campioni senza indicare ripetizioni, diluizioni, ecc
  7. Piastra figure-protocol-10 leggere.
  8. Salva file: Fare clic sul pulsante "Excel", che esporterà file di dati in Excel. Fate questo per il layout di piastra e di matrice. Salvare il file sul computer e su un drive USB.
  9. In Excel, sottrarre il valore di fondo media da ogni campione, tra cui Triton X-100 pozzi.
  10. Calcolare relativa% degranulazione dividendo ciascun valore (già in possesso sfondo sottratto) per il valore medio di Triton X-100, e quindi moltiplicare per 100 per renderlo una percentuale.
  11. Media tutto triplicato, e calcolare la deviazione standard. I dati dei grafici in Excel come valori medi ± deviazione standard. Per il test statistico, spostare ora al software Prism da GraphPad.

GIORNO 2:

5. Ionophore Stimolato Assay Degranulazione utilizzando cellule RBL-2H3

  1. Seguire il protocollo per "Preparazione delle cellule" (Sezione 1, 1 ª giornata) e "Preparazione del triclosan" (Sezione 2, Day 2), come indicato sopra. L'esempio di layout di piastra per la stimolazione ionophore è mostrato sotto.
Trattamento Triplicati
Stimolato, 0 mM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
Stimolato, 0.001 micron TCS F6, G6, H6
Stimolato, 0.01 mM TCS F3, G3, H3
Stimolato, 0.1 mM TCS A4, B4, C4
Stimolato, 1 mM TCS A6, B6, C6
Stimolato, 5 micron [TCS F5, G5, H5
Stimolato, 10 mM TCS A3, B3, C3
Stimolato, 15 mM TCS A5, B5, C5
Stimolato, 20 mM TCS F7, G7, H7
Spontanea, con DMSO, senza TCS (include deride) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, con DMSO, senza TCS D10, D11, D12, E10, E11, E12
No cellule sfondo, con DMSO, più alto [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-11
Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

  1. Prima di iniziare, controllare il pH di tutti i buffer in uso, e di garantire che essi siano chiari e non nuvoloso. Tyrodes, tampone acetato di sodio e carbonato di tampone glicina (ricette fornite in tabella).
  2. Preparare un tubo da 50 ml conica di BT con l'aggiunta di 0,05 g di BSA per 50 ml di tampone Tyrodes e nel vortex per miscelare bene. Incubare a 37 ° C bagnomaria.
  3. Rendere 0,2% Triton X-100 con 0,0032% DMSO (concentrazione veicolo calcio ionoforo finale) aggiungendo 96 ml di 10% Triton X-100-4,704 ml BT. Mescolare bene. Successivamente, estrarre 0.155 ml di questa soluzione e scartare. Ora aggiungere nuovamente a 0,155 ml di 100% DMSO.
  4. Preparare un 5 millimetri Stock (2,5 mg / ml) di A23187 ionophore da polvere con l'aggiunta di 400 ml di fresco 100% di DMSO nel flaconcino ionophore e vortex per miscelare. Una volta in soluzione,trasferire in una provetta da 1,5 ml, il contenuto del record e la data odierna e scadenza (3 mesi di preparazione se conservati correttamente a -20 ° C).
    1. In alternativa, se si utilizza un magazzino congelato oggi, disgelo sul ghiaccio, e verificare che il 5 mM A23187 ionophore è ben amalgamato e chiaro. Vortex, flick, e invertire questa azione prima di utilizzare. Riportare la data di preparazione e di Lot # di questa A23187.
  5. Una volta "TCS-buffer" e "buffer di controllo" sono stati riscaldati e agitata per 90 min, continuare il resto della preparazione per il protocollo TCS (passare a gradini 2.6-2.8.1). Dopo la BSA è ben miscelato in entrambe le soluzioni, continuare con i restanti gradini del protocollo.
  6. Dal campione 249 ml di soluzione di "TCS-buffer", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Rimuovere 1,8 l di ml aliquota 50 e aggiungere 1,8 ml di 5 mM ionophore magazzino. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Concentrazione ionophore finale è 180 nm. Si noti che questa concentrazione di A23187 varierà secondo magazzino potenza, e una A23187 ionoforo risposta dose è raccomandata per identificare una concentrazione di A23187 che provoca una degranulazione livello di circa il 20% di rilascio massimo, che è stato identificato come un noncytotoxic di RBL-2H3 celle di test di citotossicità (vedi punto 2).
    1. Etichetta di questo "tubo 1, alta TCS / ionoforo + / + BT." Utilizzato per diluizioni e più alta concentrazione di esposizione TCS.
  7. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 l di ml aliquota 50 e aggiungere di nuovo in 1,8 ml di 5 mM ionophore magazzino. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Concentrazione ionophore finale è 180 nm.
    1. Etichetta di questo "tubo 2, No TCS / ionoforo + / + BT." Questo è usato per le diluizioni e 0 concentrazioni TCS micron.
  8. Dal campione 249 ml di R 20; soluzione TCS-tampone ", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 microlitri della nuova aliquota 50 ml e aggiungere 1,8 ml di 100% DMSO. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x; non ionophore viene aggiunto.
    1. Etichetta di questo "tubo 3, alta TCS / No ionoforo / BT + / + DMSO", utilizzato per lo sfondo.
  9. Dal campione 249 ml di soluzione di "buffer di controllo", trasferire 50 ml in una nuova provetta da 50 ml. Estrarre 1,8 microlitri dalla nuova aliquota 50 ml e aggiungere 1,8 ml di 100% DMSO. Vortex 3x per 8 secondi e capovolgere 3x. Viene aggiunto alcun ionofori.
    1. Etichetta di questo "tubo 4, No TCS / No ionoforo / BT + / + DMSO"; utilizzato per i campioni rilascio spontaneo.
BSA TCS Ionophore Aggiunge il 100% di DMSO
Tubo 1 "Src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/> Elevata [] figure-protocol-12 NO
Tubo 2 figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
Tubo 3 figure-protocol-15 Elevata [] NO figure-protocol-16
Tubo 4 figure-protocol-17 NO NO eck marchio "fo: contenuti-width =" .1 in "src =" / files/ftp_upload/50671/check.jpg "width =" 15px "/>
  1. Calcolare e registrare volumi per la diluizione dopo la determinazione della concentrazione dello stock "TCS-buffer". Utilizzare P2 calibrata e P1000 Pipetman. Il volume totale di ogni concentrazione di diluizione deve essere di 1 ml, e dovrebbe essere preparato in una provetta sterile:
Concentrazione Alta Triclosan + Tyrodes + BSA 180 nM A23187 (metropolitana 1 da sopra) Riscaldata BT 180 nM A23187 (Tubo 2 dall'alto)
20 micron
15 mM
10 micron
5 pM
1 pM
0,1 micron
0.001 micron
0 mM (in alto della piastra) ---------------------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
0 micron (fondo piatto) ---------------------------------- 500 microlitri più un altro 500 microlitri
  1. Prendete le cellule placcato ieri fuori dell'incubatore e vuoti i media nel lavandino. Utilizzando un Combitip, casualmente lavare le cellule nella piastra a 96 pozzetti con BT (200 pl / pozzetto). Ripetere il lavaggio una seconda volta.
  2. Per preparare trattamenti per l'applicazione, vortex e invertire diluizioni destra prima aggiunta alla piastra. Partendo con la sezione superiore della piastra: Casualmente aggiungere triplicato da 200 ml ciascuno della corretta concentrazione del TCS al corresponding bene. Continuare a fondo piatto. Aggiungere la soluzione di "controllo del buffer" più A23187 (da "Tubo 2" di cui sopra) per tutte le "prende in giro" sul piatto.
  3. Aggiungere 200 ml di soluzioni adeguate ai pozzetti:
    1. Aggiungere 200 microlitri di 0.2% Triton X-100 pozzi a "TX"-designati.
    2. Successivamente, aggiungere 200 ml di tubo 3 per i 3 pozzetti "Background (bkgd)-Massima TCS" sul piatto.
    3. Infine, aggiungere 200 ml di tubo da 4 a sei pozzetti "spontanea".
  4. Incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C / 5% di CO 2.
  5. Durante il 1 ora di incubazione: Prendi due secchi di ghiaccio (uno per piatto "vecchio" in incubatrice e una per nuova piastra). Disgelo 4-metilumbelliferil-N-acetil-beta-D-glucosaminide (4-MU) a temperatura ambiente fino a 40 min, mantenendo in stagnola perché è sensibile alla luce.
    1. Dopo 4-MU magazzino è scongelato, make up 4-MU lavoro solutisu: 150 magazzino ml + 14,85 ml di soluzione tampone a freddo (ricetta data in tabella); vortice e capovolgere. Tenete a 50 ml tubo da centrifuga, avvolto in carta stagnola, e in ghiaccio fino al momento dell'uso.
    2. Utilizzando Combitip, aggiungere 100 microlitri casualmente soluzione di lavoro 4-MU fredda nella parte inferiore di ciascun pozzetto di una NUOVA Grenier nero piastra da 96 pozzetti (on ice bucket # 2): iniziare prima aggiungendo la soluzione di lavoro in modo casuale all'interno della parte superiore del piastra, in modo casuale all'interno del fondo della piastra, in modo casuale all'interno di Triton X-100 pozzi, e infine casualmente entro pozzetti di sfondo.
    3. Uscire nuova scatola di P200 consigli per passo successivo.
  6. A fine incubazione di 1 ora, mettere piastra di cella da incubatore a secchiello # 1, pipetta surnatante su e giù 4-5x (dolcemente, non introducendo bolle), aggirando il bene per buona miscelazione ma non toccare le cellule, mentre la miscelazione . Sistematicamente, estrarre un campione di 25 microlitri di ogni bene e di luogo nella nuova piastra con substrato (stesso ordinamento di SAmples, come originariamente pianificato). Pipettare su e giù per mescolare campione accuratamente quando in nuovo pozzo, senza introdurre bolle.
  7. Incubare per 30 min a 37 ° C / 5% di CO 2.
  8. Dopo 30 minuti di incubazione, in modo casuale aggiungere 200 microlitri tampone glicina-carbonato di freddo per pozzetto (usando Combitips) per riempire i pozzi fino a 325 microlitri totale (fare questa aggiunta ai Triton X-100 campioni ultimi, per evitare di Triton X-100 spillover). Verificare la presenza di bolle prima piastra di lettura (colpire con pulito P10 pipetta punta al pop tutte le bolle).
  9. Eseguire la piastra nel lettore di piastre a fluorescenza (Seguire tutte le operazioni descritte nella sezione 4).

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Risultati

Quando riscaldato a 50 ° C per 90 min, lo spettro di assorbanza UV-Vis per TCS produce un forte curva regolare tra ~ 260 e 300 nm, con un picco a 280 nm, come mostrato in Figura 1. Spettrofotometria UV-Vis è, quindi, un importante strumento che può essere utilizzata per calcolare la concentrazione, poiché il coefficiente di assorbimento molare pubblicato a 280 nm è 4,200 L / mol / cm 12. Abbiamo scoperto che TCS non cada dalla soluzione durante l'arco di tempo l'intero esperimento degranulazione, seguendo...

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Discussione

Nel 2004, Naal et al. 1 ha sviluppato un biosensore mastociti per la prova high-throughput di degranulazione. Si tratta di un test affidabile che abbiamo adattato per i nostri studi TCS e dettagliato in questo video. Prima della Naal et al. 1 assay, degranulazione mastocitaria era stata regolarmente valutata mediante β-hexosaminidase 59-61, ma questi primi metodi utilizzati fluorimetri in cui un campione è stata letta a volta. È importante sottolineare che, Naal et al. stabilito co...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

LMW e RHK sono supportati dalla Scuola di Dottorato di Scienze Biomediche e Ingegneria (GSBSE) di UMaine; RHK è stato supportato anche dal Maine Agricultural Experiment Station & Forest. Ulteriori finanziamenti è stato fornito dal National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), il Maine Agricultural Experiment Station & Foresta (Grant Numero ME08004-10, JAG), l'Università del Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF concedere # 1.008.498) , e una ricerca Starter di Grant in Farmacologia / Tossicologia dalla fondazione PhRMA (JAG). Ringraziamo Drs. David Holowka e Barbara Baird per l'antigene e cellule. Siamo grati a Hina Hashmi, Alejandro Velez, e Andrew Abovian aiuto con attrezzature e gli ordini. Questo è il Maine Agricultural Experiment Station & Forest numero di pubblicazione 3311.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti

Celle RBL-2H3

ATCCp align="center">CRL-2256

Le celle che abbiamo usato sono state un regalo, ma sono disponibili anche da ATCC

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

Dovrebbe essere conservato in un ambiente a bassa umidità

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

Siero fetale bovino

Atlanta Biologicals

S11150

Gentamycin Sulfate

Lonza Biological Sciences

17-518

Albumina, siero bovino

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; soluzione al 10%)

Pierce

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T Baker

4153-01

CAS# 75277-39-3

Cloruro di magnesio

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-Glucosio

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

Cristallo di cloruro di potassio

J.T Baker

3046-01

CAS# 7447-40-7

Cloruro di calcio diirdato

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

Glycine

Sigma

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

<		p align="center">Wrap in foil – è sensibile alla luce

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

Il reagente ha una concentrazione di 1 mg/ml. Aliquot 25 µ l  del reagente in provette per microcentrifuga separate e Parafilm. Conservare le aliquote a -20 ° C che non vengono utilizzati e conservare l'aliquota utilizzata a 2-8 gradi C per non più di 1 mese.

DNP-BSA

Dono del Dr. David Holowka e della Dr. Barbara Baird, Cornell University

Suggerisci: life technologies DNP-BSA catalog# A23018

Calcium Ionophore A23187

Sigma

C75-22-1mg

Lo ionoforo è stato ricavato da una polvere aggiungendo 400 µ l  di DMSO fresco al 100% nella fiala ionoforo e viene mantenuto a -20 ° C

Nota: abbiamo utilizzato con successo lo ionoforo oltre la data di scadenza di 3 mesi

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

Acido acetico

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

<		p align="center">

Carbonato di sodio anidro

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

Cloruro di sodio

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

Acido cloridrico

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

Tampone di riferimento, pH 7

VWR

BDH5046

Tampone di riferimento, pH 10

VWR

BDH5072

Tampone di riferimento, pH 4

VWR

BDH5018

Elettrodo pH soluzione di stoccaggio

VWR

14002-828

Equipment:

Spettrofotometro DU 7500

Beckmann

Non più venduto

Lettore di piastre Synergy 2

Utilizza il software di raccolta e analisi dei dati delle micropiastre Gen5

BioTek

Modulo S

Ematocitometro

Hausser Scientific

3110

7 x  7 CER CALDO/AGITAZIONE 120 V

Piastra riscaldante combinata/piastra di agitazione magnetica

VWR

97042-634

Centrifuga

Eppendorf

5430

Bagno d'acqua per coltura tissutale

VWR

Modello# 89032-206

Cabina di sicurezza biologica per colture tissutali

SafeGARD (cappa TC)

The Baker Company

Modello# SG403A-HE

Incubatore per colture tissutali

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

Intervallo: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Modello# AG204

Misuratore di pH

Symphony/VWR

Modello# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

Dispenser Combitip

Eppendorf

4981 000.019

Ricette:

Tampone in acetato, pH 4.4

Produci acido acetico 0.12 M e titola a pH 4.4 con 10 N NaOH. Si tratta di 5,3 ml di acido acetico glaciale in 1 L di acqua MilliQ: (1 L)*(0,12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1,37 g) = 5,3 ml perché la densità del glaciale è 1,37 g/ml

Sterile Filtra in bottiglia di vetro autoclavata

Substrato (4-MU)

Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Conservare a -20° C Stock: 0,12 M in DMSO (46 mg in 1 ml di DMSO), caldo a 37 gradi C, vortice, sonicare 10 minuti in bagnomaria con acqua calda, vorticare di nuovo

Per ogni esperimento, preparare una soluzione fresca di substrato in tampone di acetato (diluizione 100x), per una concentrazione finale di 1,2 mM in tampone di acetato

Tampone di carbonato di glicina, pH 10

26,7 g di glicina 47,1 g di carbonato di sodio anidro Aggiungere acqua deionizzata per 1 L, e regolare il pH a 10

Filtro sterile in flacone di vetro sterilizzato in autoclave

Tyrodes (2 L), pH 7.4

135 mM NaCl: 15.78 g (o 270 ml di 1 M) 5 mM KCl: 10 ml di 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7,20 ml di stock 0,5 M 1 mM MgCl2: 4,00 ml di stock 0,5 M 5,6 mM di glucosio: 2,02 g (11,2 ml di 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml di stock 1 M Utilizzando HCl pH concentrato da ~9,7-7,4

Filtro sterile in flacone di vetro autoclavato

RBL Cell Media

Scongelare il siero fetale bovino (FBS, conservato a -20 ° C) per circa 4 ore in 37 gradi C bagnomaria Seguire la tecnica sterile standard Estrarre 1 L di terreno essenziale minimo (MEM) con L-glutammina (con Earle' Versare un po' di MEM per ottenere 800 ml di MEM, aggiungere 200 ml di FBS caldo Aggiungere 1 ml di antibiotico gentamicina solfato a 1 litro di terreno con pipetta sterile Utilizzare solo flaconi di terreno sterilizzati in autoclave e contrassegnati solo per l'uso in coltura cellulare.

Filtro sterile (0.2 mm) in bottiglia di vetro autoclavata

Materiale plastico utilizzato:

200 µ l  Puntali per pipette sterili monouso con graduazioni in 96 rack

VWR

53509-009

polipropilene

1,000 µ l  Puntali per pipette aerosol sterili con HighRecovery

VWR

89003-420

<		p align="center">polietilene

10 µ l 

VWR

14217-704

polipropilene

Provette per microcentrifuga coniche monouso per forza G

VWR

20170-038

polipropilene

Monouso/graduato/conico/sterile 50 ml  provette da centrifuga con tappo a vite

VWR

21008-178

polipropilene

Monouso/graduato/conico/sterile 15 ml  provette da centrifuga con tappo a vite

VWR

21008-103

polipropilene

CELLSTAR Flask T-25 trattato per colture tissutali con tappo filtro

Greiner Bio One

690175

polistirene

Pallone T-75 trattato per colture tissutali CELLSTAR con tappo filtro

Greiner Bio One

658175

polistirene

CELLSTAR 10 ml  Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica

Greiner Bio One

607180

polistirene

CELLSTAR 2 ml  Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica

Greiner Bio One

710180

polistirene

CELLSTAR 5 ml  Pipetta sierologica avvolta in carta/plastica

Greiner Bio One

606180

polistirene

CELLSTAR 25 ml  Pipetta sierologica in carta/plastica avvolta

Greiner Bio One

760180

polistirene

1 cuvette da 1 cm

N/A

N/A

polistirene

CELLSTAR, Micropiastra 96W, Trattata per Coltura Tissutale, Nera, con Coperchio

Piastra a 96 pozzetti

Greiner Bio One

655086

polistirene

Combitips

Eppendorf

022266501

Polipropilene/

polietilene

<

Riferimenti

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861(1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937(2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

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