Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura

Sommario

Il tracciamento transsinaptico è diventato un potente strumento per analizzare gli efferenti centrali che regolano i bersagli periferici attraverso circuiti multisinaptici. Qui presentiamo un protocollo che sfrutta il virus della pseudorabbia transsinaptica per identificare e localizzare un circuito cerebrale funzionale, seguito da tecniche classiche di tracciamento del tratto per convalidare connessioni specifiche nel circuito tra gruppi di neuroni identificati.

Abstract

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV) ^1. PRV non infetta grandi scimmie, inclusi gli esseri umani, per cui è più comunemente usato negli studi di piccoli mammiferi, in particolare roditori. Il PRV152 pseudorabbia ceppo esprime la maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter e attraversa solo sinapsi funzionali retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione ^2,3. Altri ceppi PRV sono distinte proprietà microbiologiche e possono essere trasportati in entrambe le direzioni (PRV-Becker e PRV-Kaplan) ^4,5. Questo protocollo si occuperà esclusivamente di PRV152. Fornendo il virus in un sito periferico, come i muscoli, è possibile limitare l'ingresso del virus in tha cervello attraverso un insieme specifico di neuroni. Il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello quindi risolve i neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Come la natura distribuita del tracciato transsynaptic con virus pseudorabbia fa interpretare i collegamenti specifici all'interno di una rete identificata difficile, vi presentiamo un metodo sensibile e affidabile utilizzando ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB) per confermare le connessioni tra le cellule identificate utilizzando PRV152. Rilevazione immunochimica di BDA e CTB con perossidasi e DAB (3, 3'-diaminobenzidina) è stato scelto perché sono efficaci a rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali ^6-11.

Introduzione

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello dei roditori utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV), in particolare il ceppo attenuato PRV-Bartha descritta per la prima nel 1961 ^12. Qui, vi presentiamo un protocollo per l'identificazione della rappresentazione corticale motore dei muscoli specifici o gruppi muscolari con un ceppo virale pseudorabbia ricombinanti (PRV152) che esprime la proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter ^2. Il metodo descritto sfrutta il comportamento dei virus neurotropi, che producono progenie infettiva che sinapsi trasversali ad infettare altri neuroni all'interno di un circuito funzionale ^3,4,13. PRV152, che è isogenic con PRV-Bartha, attraversa solo sinapsi retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione ^{3,5 <}/ sup>. Controllando il proprio sito periferico di infezione è possibile limitare l'ingresso del virus nel cervello attraverso uno specifico sottoinsieme di neuroni motori. Come sequenzialmente virus infetta catene di neuroni collegati, il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello si risolverà la rete di neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente.

Un ulteriore vantaggio di utilizzare virus per tracciamento neurale è l'amplificazione della proteina reporter (eGFP in questo caso) all'interno delle cellule infette. Questa amplificazione del segnale fornisce un livello di sensibilità che consente di rilevare anche proiezioni sparse. Ad esempio, una proiezione sparse dalla corteccia motoria vibrissa ai motoneuroni facciali che controllano i baffi è stato trovato in ratti utilizzando viralmente espresso proteina fluorescente verde ^14; studi precedenti non sono riusciti a trovare questo proiezione utilizzando traccianti classici senza giornalista amplificazione del gene ^11,15. purtroppo, Molti vettori virali tracing, come quello usato nello studio citato, non attraversano sinapsi, limitando così il loro uso per tracciare i circuiti multi-sinaptici.

Pur presentando notevoli vantaggi per identificare la rete di cellule che partecipano a un circuito del motore, la natura distribuita transsynaptic tracciare con PRV-152 rende interpretazione collegamenti specifici all'interno del circuito difficile. Pertanto, vi presentiamo un metodo semplice per la convalida collegamenti specifici all'interno dei circuiti identificate utilizzando PRV-152 per doppia etichettatura con ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB). L'uso combinato di BDA e CTB è un approccio consolidato per tracciare le connessioni tra specifici gruppi di neuroni ^6-8,11. Quando usati insieme, queste due rivelatori possono essere visualizzati nella stessa sezione con un DAB due colori (3, 3'-diaminobenzidina) Procedura ^16. Alto peso molecolare BDA (BDA10kDa) è stato scelto per questo protocollo perché yields etichettatura dettagliata dei processi neuronali ^6,7,9. Ulteriori vantaggi BDA10kDa includono quanto segue: è preferenzialmente trasportato nella direzione anterograda ^6-8; può essere trasportato da iontoforetica o pressione di iniezione ^6-8; può essere visualizzato da un semplice avidina-HRP biotinilato (ABC) Procedura ^17; e può essere ripreso dalla luce o microscopia elettronica ^6,7,18. Rilevazione immunochimica di CTB con perossidasi e DAB è stato scelto per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni, perché è efficace nel rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali ^10,19. Recentemente abbiamo usato questo approccio per identificare il percorso del motore vocale nei topi e per rivelare un collegamento sparse da corteccia motoria primaria per i motoneuroni laringei, che in precedenza era assume siano assenti ^20.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale Cura e uso di animali Comitato Duke University.

1. Memorizzazione Pseudorabies Virus

1. Otteniamo virus vivo (PRV152) dal laboratorio del Dr. Lynn Enquist alla Princeton University in un titolo di 1 x 10 ⁹ pfu / m. Il protocollo per generare il virus è stato pubblicato ^2.
2. Aliquota il virus a 20 ml per tubo all'interno di un armadietto BSL-2 biosicurezza e conservare a -80 ° C in adeguate condizioni di biosicurezza.
3. Scongelare una aliquota di PRV immediatamente prima di iniettare.

2. Preparazione chirurgica per iniezioni nel muscolo

1. Un'anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano.
2. Proteggere le cornee con un unguento oftalmico.
3. Preparare tegli sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito chirurgico con alternanza di macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli). Assicurarsi di utilizzare teli sterili per coprire aree chirurgiche. Assicurati di rispettare tecniche sterili durante tutta la procedura.
4. Fare un incisione cutanea e rivelare il muscolo di interesse. Ad esempio, per accedere al muscolo laringea cricotiroidea è necessario prima rimuovere la parte sovrastante del muscolo sternoioideo.
5. Sigillare eventuali muscoli sezionati con adesivo tessuto Vetbond.

3. Iniezione di PRV in muscolare

1. Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con una soluzione PRV appena scongelato, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e montare con cautela sul dispositivo stereotassico.
2. Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione esce dalla punta microsiringa. Smaltire come rifiuto liquido bioharzard.
3. Utilizzando un microP stereotassicadispositivo ositioning posizionare con cura la punta microsiringa nel muscolo di interesse e lentamente riempire il muscolo fino a leggero gonfiore è visibile. La velocità di iniezione varierà a seconda della dimensione del muscolo e del volume da iniettare. Ad esempio, cinque iniezioni di 200 nl (1 ml totale) ad una velocità di 4 nl / sec devono essere effettuate 1 min a parte nello stesso sito per riempire il muscolo cricotiroideo. Spostare la siringa al prossimo muscolo di interesse (il cricoarytenoid laterale in questo caso) e ripetere la procedura di iniezione. Solo puntura ogni muscolo una volta.
4. Ritrarre la microsiringa dopo cinque minuti.
5. Sigillare la pausa nella fascia con adesivo tessuto Vetbond.
6. Dopo che tutte le iniezioni sono state completate, chiudere la ferita con adesivo tessuto Vetbond. A seconda delle linee guida locali institional uso animale, suture o clip ferita può essere utilizzato.
7. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e la cura come richiesto da yle nostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.
8. Dopo il tempo di sopravvivenza determinato sperimentalmente (in questo caso, 90 hr etichettare ² ° ordine dei neuroni corticali), sacrificare l'animale da sovradosaggio pentobarbital e nei profumi transcardially con soluzione fisiologica 0,9% seguita da 4% di formaldeide in PBS 0,1 M.
9. Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore.
10. Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore.

4. immunochimica Rilevamento di eGFP

1. Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo a slitta e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS. Sezioni più sottili, ad esempio 30 micron, possono essere utilizzate quando colorazione sezioni montate.
2. Placare le sezioni per 30 min a 0,3% _H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce.
3. Bloccare antigeni non specifici nelle sezioni per 30 min in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di capra dal Kit Vectastain Elite (VE kit).
4. Incubare bloccato sezioni per 3,5 ore in coniglio anti-eGFP (1: 1.000) a temperatura ambiente.
5. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di capra anti-coniglio dalla VE kit a RT.
6. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
7. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC dal VE kit a RT.
8. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidina) e 0,015% H ₂ O _2.
9. Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno).
10. Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount.
11. Immagine sezioni montati su un microscopio. Il prodotto di reazione DAB inside le cellule dovrebbero apparire marrone. Immagini digitalizzate possono essere colore invertito per evidenziare i processi sottili.

5. Preparazione chirurgica per iniezione di traccianti in regioni cerebrali Scoperto da PRV Tracing

1. Un'anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano.
2. Proteggere le cornee con un unguento oftalmico.
3. Fissare la testa in un telaio stereotassico appropriata.
4. Preparare il sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito con alternanza macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli).
5. Effettuare una incisione del cuoio capelluto e ritrarre la pelle sopra la regione del cervello di interesse.
6. Eseguire una piccola craniotomia alle opportune coordinate stereotassica. Ad esempio, le coordinate per corteccia motoria laryngeally collegato individuato da PRV tracciando in unn topo adulto sono 1,2 millimetri laterale e 0,2 mm rostrale a Bregma.

6. L'iniezione di Biotinylated Destrano ammine in Cervello

1. Preparare 7,5% ammine destrano biotinilati (BDA) sciogliendo 25 mg di BDA (10.000 MW) in 333 ml di soluzione fisiologica sterile.
2. Caricare il sistema micropipetta Nanoject II con la soluzione BDA sufficiente per le iniezioni pianificate.
3. Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione sta per uscire dal punta micropipetta.
4. Utilizzando un dispositivo microposizionamento stereotassico abbassare con attenzione la punta micropipetta nella regione del cervello di interesse e iniettare lentamente BDA. Regolare la velocità di iniezione in funzione della dimensione della regione da etichettare. Ad esempio, 12 iniezioni di 4,6 nl dovrebbero essere fatto in quattro sedi diverse 0,2 millimetri a parte (rostro-caudale direzione) per coprire la corteccia motoria laryngeally collegato in topi adulti. Il volume di iniezione finale dovrebbe essere regolata in base alle dimensioni della regione del cervello di interesse, Tenendo presente che l'etichetta può diffondersi dal nucleo di iniezione per diffusione attraverso i tessuti cerebrali e lungo i processi di neuroni marcati.
5. Sigillare la craniotomia con cemento dentale, e chiudere la ferita del cuoio capelluto con adesivo tessuto Vetbond.
6. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.

7. L'iniezione di tossina colerica subunità b in muscolare

1. Preparare 1% tossina colerica subunità b (CTB) sciogliendo 1 mg di CTB in 100 ml di soluzione fisiologica sterile.
2. Sei giorni dopo l'iniezione BDA nel cervello, eseguire la preparazione chirurgica come descritto sopra per iniezioni PRV nel muscolo.
3. Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con la soluzione CTB, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e con attenzione montare sul dispositivo stereotassico.
4. Eseguire le microiniezioni nel muscolo (s) di interesse come precedentemente dedescritto per PRV.
5. Monitorare l'animale fino decubito sternale e fornire l'analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull'uso degli animali istituzionali.
6. Tre giorni dopo l'iniezione CTB, sacrifica l'animale per overdose pentobarbital e profumato transcardiaca con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% di formaldeide in 0,1 M PBS.
7. Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore.
8. Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore.

8. Individuazione di BDA e CTB nelle stesse sezioni

1. Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS.
2. Placare le sezioni per 30 min a 0,3% _H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce.
3. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
4. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC a RT.
5. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidina), 0,015% H ₂ O _2, e 0,05% di cloruro di nichel. Il prodotto di reazione DAB all'interno delle cellule dovrebbe apparire nero.
6. Sezioni di blocco per 30 minuti in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di coniglio dal Kit Vectastain Elite.
7. Incubare bloccato sezioni per 2 ore in capra anti-CTB (1: 10.000) a temperatura ambiente.
8. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di coniglio anti-capra dalla VE kit a RT.
9. Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore.
10. Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 30 min in soluzione ABC a RT.
11. Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare fino a 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3'-diaminobenzidine) e 0,015% H ₂ O _2. Il prodotto di reazione DAB all'interno delle cellule dovrebbe apparire marrone.
12. Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno).
13. Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount.
14. Immagine sezioni montati su un microscopio.

Risultati

Colorazione per eGFP dovrebbe cominciare mostrando segnale debole in neuroni motori primari di circa 72 ore dopo l'iniezione PRV152 nel muscolo. La replica e il trasporto transsynaptic del virus sono titer- e dipendenti dal tempo ^4. Circa 90 ore dopo l'iniezione, eGFP colorazione rivelerà segnale più forte nelle cellule infettate ordine 2 ^nd. Tempi di sopravvivenza più lunghi rivelerà ³ ° e cellule di ordine superiore, ma i tempi di sopravvivenza sono limitati dalla letalità di PRV a cir...

Discussione

Ci sono una serie di questioni che devono essere presi in considerazione al momento di pianificare un esperimento utilizzando PRV152 ^4,21. Ancora più importante, il virus della pseudorabbia è letale. Come accennato in precedenza, le grandi scimmie, inclusi gli esseri umani non sono suscettibili alle infezioni, ma cure appropriate devono essere esercitati per proteggere gli altri animali. Topi adulti in genere sopravvivono cinque a sette giorni dopo l'inoculazione con il ceppo PRV152 attenuato. Pertanto, P...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente/materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di microiniezione NanoFil	World Precision Instruments	IO-Kit	34 G
opzione Telaio stereotassico	David Kopf Instruments	Modello 900
Iniettore di nanolitri automatico Nanoject II	Drummond Scientific Company	3-000-204
Microtomo scorrevole	Leica	SM2010 R
[header]
VetBond	3M	1469SB
Isofluorane (Forane)	Baxter
Betadine Swab Stick Cardinal	Health	2130-01	200 conteggi
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
SuperFrost Plus vetrini	Fisher Scientific	12-550-15
Destrano biotinilato ammine	Invitrogen	D-1956	10.000 MW
Virus della pseudorabbia	Laboratorio del Dr. Lynn Enquist (Università di Princeton)	PRV152	Titolo >1 x 107
Anti-subunità della tossina del colera B (capra)	Elenco dei laboratori biologici	703
Elenco delle subunità della tossina del colera B	Laboratori biologici	103B
Anti-eGFP	Open Biosystems	ABS4528
3, 3'-diaminobenzidina	Sigma-Aldrich	D5905	Compresse da 10 mg
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof
Formaldeide	Sigma-Aldrich	F8775	Diluire al 4%
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H3410	30%
Ketamina HCl & Xilazina HCl	Sigma-Aldrich	K4138	80 mg/ml e 6 mg/ml
Cloruro di nichel	Sigma-Aldrich	339350
Tampone fosfato	Sigma-Aldrich	P3619	1.0 M; pH 7.4
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P5493	10x; pH 7.4
Pentobarbital sodio	Sigma-Aldrich	P3761	50 mg/ml dose
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Xileni	Sigma-Aldrich	534056	Grado istologico
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6101 (coniglio); PK-6105 (capra)
Unguento oftalmico Optixcare	Vet Depot	1017992