Il tracciamento transsinaptico è diventato un potente strumento per analizzare gli efferenti centrali che regolano i bersagli periferici attraverso circuiti multisinaptici. Qui presentiamo un protocollo che sfrutta il virus della pseudorabbia transsinaptica per identificare e localizzare un circuito cerebrale funzionale, seguito da tecniche classiche di tracciamento del tratto per convalidare connessioni specifiche nel circuito tra gruppi di neuroni identificati.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV) 1. PRV non infetta grandi scimmie, inclusi gli esseri umani, per cui è più comunemente usato negli studi di piccoli mammiferi, in particolare roditori. Il PRV152 pseudorabbia ceppo esprime la maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter e attraversa solo sinapsi funzionali retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 2,3. Altri ceppi PRV sono distinte proprietà microbiologiche e possono essere trasportati in entrambe le direzioni (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Questo protocollo si occuperà esclusivamente di PRV152. Fornendo il virus in un sito periferico, come i muscoli, è possibile limitare l'ingresso del virus in tha cervello attraverso un insieme specifico di neuroni. Il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello quindi risolve i neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Come la natura distribuita del tracciato transsynaptic con virus pseudorabbia fa interpretare i collegamenti specifici all'interno di una rete identificata difficile, vi presentiamo un metodo sensibile e affidabile utilizzando ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB) per confermare le connessioni tra le cellule identificate utilizzando PRV152. Rilevazione immunochimica di BDA e CTB con perossidasi e DAB (3, 3'-diaminobenzidina) è stato scelto perché sono efficaci a rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 6-11.
Introduzione
Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello dei roditori utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV), in particolare il ceppo attenuato PRV-Bartha descritta per la prima nel 1961 12. Qui, vi presentiamo un protocollo per l'identificazione della rappresentazione corticale motore dei muscoli specifici o gruppi muscolari con un ceppo virale pseudorabbia ricombinanti (PRV152) che esprime la proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter 2. Il metod....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale Cura e uso di animali Comitato Duke University.
1. Memorizzazione Pseudorabies Virus
- Otteniamo virus vivo (PRV152) dal laboratorio del Dr. Lynn Enquist alla Princeton University in un titolo di 1 x 10 9 pfu / m. Il protocollo per generare il virus è stato pubblicato 2.
- Aliquota il virus a 20 ml per tubo all'interno di un armadietto BSL-2 biosicurezza e conservare a -80 ° C in adeguate condizioni di biosicurezza.
- Scongelare una aliquota di PRV immediatamente prima di iniettare.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Colorazione per eGFP dovrebbe cominciare mostrando segnale debole in neuroni motori primari di circa 72 ore dopo l'iniezione PRV152 nel muscolo. La replica e il trasporto transsynaptic del virus sono titer- e dipendenti dal tempo 4. Circa 90 ore dopo l'iniezione, eGFP colorazione rivelerà segnale più forte nelle cellule infettate ordine 2 nd. Tempi di sopravvivenza più lunghi rivelerà 3 ° e cellule di ordine superiore, ma i tempi di sopravvivenza sono limitati dalla letalità di P.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Ci sono una serie di questioni che devono essere presi in considerazione al momento di pianificare un esperimento utilizzando PRV152 4,21. Ancora più importante, il virus della pseudorabbia è letale. Come accennato in precedenza, le grandi scimmie, inclusi gli esseri umani non sono suscettibili alle infezioni, ma cure appropriate devono essere esercitati per proteggere gli altri animali. Topi adulti in genere sopravvivono cinque a sette giorni dopo l'inoculazione con il ceppo PRV152 attenuato. Pertanto, P.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott Toshio Terashima di Università di Kobe, in Giappone, per l'insegnamento della tecnica di chirurgia laringea, e il dottor Lynn Enquist della Princeton University per la fornitura di PRV-Bartha. La ricerca è stata sostenuta da premio pioniere NIH DP1 OD000448 Erich D. Jarvis e un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Le cifre precedente lavoro opportunamente accreditati sono utilizzati sotto la PLoS ONE accesso aperto licenza Creative Commons (CC-BY) in accordo con le politiche editoriali della rivista.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente/materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Sistema di microiniezione NanoFil | World Precision Instruments | IO-Kit | 34 G |
| opzione Telaio stereotassico | David Kopf Instruments | Modello 900 | |
| Iniettore di nanolitri automatico Nanoject II | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | |
| Microtomo scorrevole | Leica | SM2010 R | |
| [header] | |||
| VetBond | 3M | 1469SB | |
| Isofluorane (Forane) | Baxter | ||
| Betadine Swab Stick Cardinal | Health | 2130-01 | 200 conteggi |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| SuperFrost Plus vetrini | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Destrano biotinilato ammine | Invitrogen | D-1956 | 10.000 MW |
| Virus della pseudorabbia | Laboratorio del Dr. Lynn Enquist (Università di Princeton) | PRV152 | Titolo >1 x 107 |
| Anti-subunità della tossina del colera B (capra) | Elenco dei laboratori biologici | 703 | |
| Elenco delle subunità della tossina del colera B | Laboratori biologici | 103B | |
| Anti-eGFP | Open Biosystems | ABS4528 | |
| 3, 3'-diaminobenzidina | Sigma-Aldrich | D5905 | Compresse da 10 mg |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | Diluire al 4% |
| Perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich | H3410 | 30% |
| Ketamina HCl & Xilazina HCl | Sigma-Aldrich | K4138 | 80 mg/ml e 6 mg/ml |
| Cloruro di nichel | Sigma-Aldrich | 339350 | |
| Tampone fosfato | Sigma-Aldrich | P3619 | 1.0 M; pH 7.4 |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | P5493 | 10x; pH 7.4 |
| Pentobarbital sodio | Sigma-Aldrich | P3761 | 50 mg/ml dose |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Xileni | Sigma-Aldrich | 534056 | Grado istologico |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6101 (coniglio); PK-6105 (capra) | |
| Unguento oftalmico Optixcare | Vet Depot | 1017992 |
Riferimenti
- Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
- Smith, B. N., Banfield, B. W., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
