Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Sommario

Un protocollo è descritto che utilizza saggi di Illumina Infinium effettuare genotipizzazione su larga scala. Questi test possono genotipo affidabile milioni di SNPs su centinaia di singoli campioni di DNA in tre giorni. Una volta generata, questi genotipi possono essere usate per controllare le associazioni con una varietà di malattie o fenotipi differenti.

Abstract

Varianti di genotipizzazione del genoma umano ha dimostrato di essere un metodo efficace per identificare associazioni genetiche con fenotipi. La distribuzione delle varianti all'interno delle famiglie o delle popolazioni può facilitare l'identificazione dei fattori genetici della malattia. Pannello di Illumina di BeadChips genotipizzazione consente agli investigatori di genotipo migliaia o milioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o per analizzare altre varianti genomiche, come numero di copie, attraverso un gran numero di campioni di DNA. Questi SNPs possono essere diffuse in tutto il genoma o mirati in regioni specifiche al fine di massimizzare il potenziale di scoperta. Il dosaggio Infinium è stato ottimizzato per produrre alta qualità, risultati precisi rapidamente. Con opportuna configurazione, un singolo tecnico può elaborare da poche centinaia a oltre mille campioni di DNA alla settimana, a seconda del tipo di matrice. Questo saggio guida gli utenti attraverso ogni passo, partendo con il DNA genomico e termina con la scansione della matrice. Utilizzo di correttezza Reagenti, i campioni sono amplificati, frammentato, precipitato, risospese, ibridata al chip, prorogato di un unico basamento, macchiato, e scansionata né su di un sistema di imaging ottico ad alta risoluzione iScan o Hi Scan. Un passo durante la notte è necessaria per amplificare il DNA. Il DNA è denaturato e isotermicamente amplificata da tutto il genoma di amplificazione, pertanto, non è richiesta alcuna PCR. I campioni sono ibridate agli array durante una seconda fase durante la notte. Entro il terzo giorno, i campioni sono pronti per essere analizzati e analizzati. DNA amplificato può essere stoccato in grandi quantità, consentendo matrici tallone da trasformare ogni giorno della settimana, in modo da massimizzare il throughput.

Introduzione

Digitando polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) è un metodo fondamentale per identificare varianti di rischio connessi con la malattia. Storicamente, l'ambito di esperimenti di genotipizzazione è stata limitata dalla tecnologia disponibile. Metodi di genotipizzazione basati su elettroforesi su gel sono limitati in-campione e SNP-capacità ^[1]. Lo sviluppo di questi saggi, spesso può essere alta intensità di lavoro, basandosi sulla composizione e la struttura della regione circostante la variante per l'ottimizzazione ^[1]. Saggi TaqMan genotipizzazione, sviluppati da Life Technologies, possono eseguire un gran numero di campioni in modo rapido e con minimo coinvolgimento tecnico [2], ma restrizioni SNP multiplexing continuano a limitare il numero totale di genotipi di ben inferiore a un milione al giorno ^{[3,4 ].} Piattaforma IPLEX di Sequenom può anche eseguire molti campioni in una sola volta, ma, come meno di un centinaio di SNPs possono essere multiplexati insieme, il throughput è relativamente basso nel complesso ^[5]. La tecnologia streaming SNP di Beckman Coulterpotrebbe teoricamente produrre oltre tre milioni di genotipi al giorno, ma questo intervallo progetto limiti tecnologici, fino ad un massimo di soli quarantotto SNPs per reazione ^[4,6]. Mentre il test GoldenGate in grado di elaborare quasi duecento campioni di DNA ogni giorno centinaia o migliaia di SNPs per campione, il prezzo per genotipo non è competitivo con tecniche ultra-high-throughput avanzate durante la digitazione di oltre tremila SNPs in una sola volta ^{[4,7 ].} Al fine di elaborare diversi milioni di genotipi al giorno, la scala necessaria per i grandi studi di associazione genome-wide, saggi di array-ibridazione sono diventati l'opzione più conveniente sul mercato.

La linea di Affymetrix di array di ibridazione e la linea di Illumina di array-based Infinium consentono potenzialmente centinaia di campioni da digitate su centinaia di migliaia o milioni di SNPs in parallelo ^[4,8]. Questi SNPs possono essere sparsi su tutto il genoma, localizzata nelle regioni di interesse, come la exOMES, o personalizzato per preferenze dell'utente. Queste matrici hanno il vantaggio non solo di essere in grado di genotipo con precisione un milione di SNPs per ogni campione in una volta, ma anche per misurare il numero di copie di variazione, anomalie cromosomiche potenzialmente svelare. Infinium-allineati array OMNI BeadChip attualmente hanno la capacità di genotipo fino a quasi cinque milioni di marcatori per campione, tra cui mezzo milione loci personalizzato, su un massimo di quasi un centinaio di campioni di ogni giorno.

Poiché la maggior parte delle malattie hanno una componente genetica, questi esperimenti su larga scala possono essere cruciali nella ricerca di geni associati con la malattia. High-throughput genotipizzazione consente per la generazione di genotipo efficiente esempio imposta abbastanza grande per rilevare in maniera convincente associazione genetica a basse frequenze alleliche minori. Progetti di genotipizzazione intero genoma possono essere utilizzati per individuare le regioni con statisticamente significativa frequenza dell'allele caso-controllo o le differenze del numero di copie ^[9,10,11]. Secondo il National Ge umanoNome Research Institute, studi di associazione genome-wide che hanno portato a 1.490 pubblicazioni separate tra 25 novembre 2008 e 25 gennaio 2013, derivanti dalla scoperta di 8.283 SNP con un p-value inferiore a 1 x 10 ^-5 (vedi http:// www.genome.gov/gwastudies/). Questi studi, che le condizioni che vanno da un'altezza di cancro ai testicoli, ha beneficiato l'approccio generale offerta da una analisi genome-wide ricercato. In casi come questi, intere regioni di interesse potrebbero essere sfuggito aveva lo scopo di battitura stato troppo restrittiva. Così, per le analisi di associazione su larga scala, una tecnica di genotipizzazione genoma di ampiezza è la tecnica di scelta.

Esistono diverse versioni del saggio Infinium, ciascuno destinato all'uso con specifici tipi di matrici. Il saggio InfiniumUltra, discusso in profondità sotto, è appropriato per molti 12 - o 24-chip matrice del campione. Questi spesso genotipo oltre un centinaio di migliaia di SNPs per ogni campione di DNA e concentrarsi su tregioni argeted, come ad esempio su pannelli exome o personalizzati. Altre versioni di saggio possono essere richieste per altri tipi di chip, come le matrici di genotipizzazione intero genoma. Tuttavia, come tutti i saggi Infinium condividono una base comune e differiscono principalmente solo dai nomi dei reagenti, i volumi di reagente, o l'esatta procedura di reagente di colorazione, tecniche perfezionate su una versione test possono spesso essere universalmente applicata. Altri array, come array di metilazione, potrebbe utilizzare un protocollo pressoché identiche, pure. Bisogna fare attenzione a utilizzare solo la versione di dosaggio richiesto per il tipo di chip in uso. Alcuni tipi, come ad esempio quelli che misurano il livello di espressione genica, potrebbero richiedere l'uso di un protocollo nonInfinium.

I campioni devono essere elaborati in batch. Ad esempio, con il dosaggio InfiniumUltra, tubi dei reagenti prehybridization contengono un volume sufficiente per eseguire 96 campioni, ed i tubi non possono essere ricongelati. Pertanto, i campioni devono essere eseguiti in lotti di 96 campioni alla volta. I campioni saranno amplificati sui abetit giorno. Dopo circa 1 ora di benchwork, i campioni devono essere riscaldati in forno ventilato per 20-24 ore. Il giorno seguente, quasi 4 ore sarà speso la frammentazione, la precipitazione, e risospendere i campioni, al punto che i campioni possono sia essere congelati per un uso futuro o ibridati al chip. Caricamento chip prende quasi 2 ore, dopo di che i campioni saranno ibridati notte per 16-24 ore. Il terzo giorno, la fase di colorazione e l'estensione prende ~ 4 ore. Un ulteriore ora saranno spesi lavaggio, verniciatura e l'essiccazione le patatine. Infine, le matrici vengono analizzati, che può richiedere 15-60 min / chiave, a seconda del tipo utilizzato.

Si applicano le misure di sicurezza di laboratorio e di pulizia standard. Sebbene non si basa PCR-amplificazione, sono necessarie postazioni separate per la pre-e postamplification procedure per ridurre al minimo la probabilità di contaminazione. Il numero di identificazione di ogni reagente kit fornito in uso deve essere registrato su un foglio di tracking. Reagenti Scongelare immediatamente prima dell'uso e invertiti diverse volte prima erogazione. Il DNA deve essere digitato deve essere DNA genomico di alta qualità (260/280 Rapporto di assorbanza di 1,6-2,0, 260/230 il rapporto di assorbanza di sotto di 3,0), isolati con metodi standard e quantificati con un fluorimetro. Degradazione del DNA è spesso un fattore che contribuisce a risultati del saggio di bassa qualità. Tipicamente, è richiesta 200 ng di DNA, se questa quantità può variare per alcuni tipi di chip. A Tecan-liquido gestione robot è in grado di automatizzare molte fasi del protocollo e ridurre al minimo l'errore umano come fattore.

Protocollo

Day One

1. Preparazione

1. Dispensare 200 ng di DNA in una piastra da 96 campioni profondo-bene. Almeno 96 campioni (piastre complete) devono essere placcato per garantire che non reagente sarà sprecato. Etichettare la piastra con un codice a barre adesivo fornito dal kit e centrifugare.
2. Al fine di normalizzare i volumi, lasciano i campioni in un cassetto o cappa aspirante durante la notte per far evaporare il liquido. Coprire la piastra liberamente con un tovagliolo di coperchio o di carta per tenere fuori la polvere.

2. Amplificazione

ATTENZIONE: i campioni non devono subiscono amplificazione a meno di 4 ore sarà disponibile il giorno successivo per le fasi di frammentazione, di precipitazione, e risospensione.

1. Rimuovere la scatola fornita società o pacco di tubi etichettati "Pre" dal -20 ° C congelatore (un tubo di MA1, MA2, e MSM è sufficiente per ciascun set di 96 campioni). Set tubi di MA2 e MSM in panchina per scongelare. Accendere correttamente calibratoforno e impostato a 37 ° C.
2. Utilizzando un bacino reagente e 10 microlitri, pipetta a 8 canali, dispensare 4 ml di DNA Resuspension tampone in ciascun pozzetto per reidratare i campioni. Non è necessario scartare le punte delle pipette tra ogni colonna se si fa attenzione a non toccare liquido.
3. Con una pipetta a 8 canali, dispensare 20 l di MA1 in ogni pozzetto della piastra. Per ogni nuovo reagente, utilizzare un bacino reagente fresco. Coprire la piastra con un sigillo riutilizzabile, pulse-centrifuga, e vortex per 1 min a 1.600 giri al minuto, un vortex.
4. 2.4) Incubare a temperatura ambiente per almeno 30 min.
5. Pipettare 4 ml di 0,1 N NaOH in ogni pozzetto della piastra. Coprire la piastra con il sigillo riutilizzabile, pulse-centrifuga, e vortex per 1 min a 1.600 giri al minuto.
6. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
7. Pipettare 34 ml di MA2 in ogni pozzetto della piastra.
8. Pipettare 38 ml di MSM in ogni pozzetto della piastra. Coprire la piastra con ilsigillo riutilizzabile, pulse-centrifuga, e vortex per 1 min a 1.600 giri al minuto.
9. Mettere in forno per 20-24 ore.

Day Two

3. Frammentazione

1. Rimuovere tubi FMS dal "Post-1" -20 ° casella C (una provetta è sufficiente per ciascun set di 96 campioni). Scongelare sul banco o in un bagno d'acqua a temperatura ambiente. Dopo aver inserito l'inserto MIDI-piastra in un sistema da tavolo microcampione incubazione, accendere il blocco termico e impostare a 37 ° C.
2. Una volta che i tubi sono scongelati, rimuovere la piastra campione dal forno e impulsi centrifuga. Pipettare 25 ml di FMS in ogni pozzetto della piastra di DNA. Sostituire il coperchio, impulsi centrifuga, e vortice a 1.600 rpm per 1 min.
3. Incubare la piastra nel blocco di calore per 1 ora.

4. Precipitazione

1. Rimuovere il tubo PM1 da "Post-3" area 4 ° C o imballare e caldo a temperatura ambiente (una provetta è sufficiente per ciascun set di 96 campioni). Togliere la piastra dal blocco di calorek e impulsi centrifuga.
2. Pipettare 50 ml di PM1 in ogni pozzetto della piastra. Sostituire il coperchio, impulsi centrifuga, e vortice a 1.600 rpm per 1 min.
3. Incubare la piastra nel blocco termico per 5 min.
4. Togliere la piastra dal blocco termico, spegnerlo, e gettare il coperchio piatto. Pipettare 155 ml di isopropanolo 100% in ogni pozzetto della piastra. Coprire bene con un nuovo coperchio e invertire manualmente la piastra più volte per mescolare.
5. Posizionare la piastra in 4 ° C per un minimo di 30 min. Accendere centrifuga refrigerata e impostato a 4 ° C per raffreddare.
6. Bilanciare la piastra e centrifugare a 4 ° C per 20 min a 3000 x g.
7. Ispezionare il fondo della piastra senza invertire e confermare i campioni vengono precipitati in un pellet blu. Se nessuna palline possono essere considerati di nuovo, centrifuga. Prendi tovaglioli di carta.
8. Eliminare il coperchio e rimuovere rapidamente il liquido invertendo la piastra e toccando con forza sul banco coperto di carta assorbente. Una volta che il piatto è inverted, fare attenzione a non tornare mentre il liquido rimane. Ripetutamente toccare la piastra contro il banco fino a quando viene rimosso tutto il liquido.
9. Impostare la piastra su un portaprovette, invertito, ad asciugare. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.

5. Resuspension

1. Rimuovere RA1 da "Post-2" -20 ° C box e disgelo in temperatura ambiente bagnomaria. Accendere il forno e impostarlo a 48 ° C.
2. Una volta scongelato, dispensare 23 ml di RA1 a ciascun pozzetto della piastra campione. Non versare l'intera bottiglia di RA1 nel bacino; risparmiare 30 ml per più tardi. Se i campioni saranno ibridati sulle matrici più tardi quel giorno, posizionare il RA1 in una C più fredda 4 °. Se verranno eseguiti i campioni in un secondo momento, etichettare la bottiglia e ricongelare il RA1.
3. Termosaldabile un nuovo coperchio sulla piastra. Pulse-centrifuga la piastra e metterla in forno per 1 ora.
4. Rimuovere la piastra dal forno e vortice a 1.800 rpm per 1 min.
   I campioni possono essere tranquillamente hELD in questa fase, per un massimo di una settimana. Piastre possono essere stoccati e campioni possono essere riorganizzati per preparare l'applicazione di chip tallone, se necessario. Se procedere con la procedura, lasciare la piastra a temperatura ambiente e attivare il blocco di calore. Altrimenti, conservare la piastra a -20 ° C.

6. Ibridazione

AVVERTENZA: I campioni non devono essere sottoposte ibridazione meno 5,5 hr sono disponibili il giorno successivo per la colorazione e lavare passi.

1. Accendere il blocco termico e impostarlo a 95 ° C. Accendere il forno e impostarlo a 48 ° C.
2. Una volta che la temperatura si è stabilizzata, incubare la piastra sul blocco calore per 20 min.
3. Mentre la piastra è denaturazione, rimuovere la scatola di patatine tallone da 4 ° C e metterlo in panchina. Prendete una bottiglia di XC4 (da kit a temperatura ambiente) e aggiungere 330 ml di etanolo al 100%. Agitare bene e incubare a temperatura ambiente per una notte. Preparare mix formammide / EDTA (95% formammide, 0,2%EDTA (0.5 M), 4,8% H ₂ O in volume) e congelare in incrementi separati 15 ml. Formammide in eccesso può essere accumulato.
4. Rimuovere la piastra di esempio dal blocco di calore. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
5. Mentre la piastra si raffredda, preparare la camera hyb. Sarà necessaria una camera per ogni quattro chip tallone trasformati.
   Collocare un tappetino di gomma sulla parte superiore della base della camera hyb, allineando il foro più spessa con la parte anteriore della base. Il simbolo del codice a barre inciso nella base dovrebbe essere ancora visibile (vedi figura 2).
6. Usando una pipetta 1.000 ml, 400 ml di dispensare PB2 in ciascuna delle otto serbatoi umidificazione scavato nella base. PB2 può essere trovato in box "Post-3" o pack. Mettere il coperchio della camera hyb sulla base e stringere le due estremità chiudendo due fibbie sui lati diagonalmente opposti prima.
7. Rimuovere le singole confezioni d'argento di chip tallone dalle loro rispettive caselle, ma, al fine di minimizzare expo chip "Assicurati di aria e luce, ancora non aprirli. Scansione accurata i codici a barre dei chip e registrare l'ordine in cui vengono caricati su un foglio di inseguimento, insieme con gli ID scatola di provenienza. Una conoscenza approfondita del luogo in cui verrà erogata ogni campione di DNA individuale sui chip tallone è necessario.
8. Rimuovere le singole confezioni d'argento di chip tallone dalle loro rispettive caselle, ma, al fine di minimizzare l'esposizione dei chip 'all'aria e alla luce, ancora non aprirli. Scansione accurata i codici a barre dei chip e registrare l'ordine in cui vengono caricati su un foglio di inseguimento, insieme con gli ID scatola di provenienza. Una conoscenza approfondita del luogo in cui verrà erogata ogni campione di DNA individuale sui chip tallone è necessario.
9. Poco prima delle 30 min raffreddano ha completato, aprire le confezioni di chip tallone d'argento. Rimuovere i chip dalle loro buste di plastica trasparenti. Senza toccare le perline, posizionare tutti i chip tallone su un inserto della camera hyb, orientando il chipcodice a barre con il simbolo del codice a barre incisi nella superficie superiore dell'inserto.
10. Staccare e gettare il coperchio del piatto del campione. Prendere 15 ml di campione dalla piastra campione e lentamente dispensare in ingresso alla matrice (vedi Figura 3). Straordinaria cura deve essere presa per posizionare il campione corretto sul chip tallone corretta nella posizione corretta, corrispondente all'ordine di chip branello registrato in precedenza. Una pipetta multicanale può essere usato per erogare liquido sul chip, ma accortezza deve essere presa per aspirare solo il numero di campioni che può essere collocato in modo sicuro sul chip tallone, come il numero di righe su un piatto non corrisponde sempre il numero di righe su un chip.
11. Una volta ogni campione è stata posta sulla sua matrice corrispondente, ispezionare visivamente il chip per le bolle o le regioni non ricoperte di liquido. Se esistono questi problemi, oscillare delicatamente l'inserto. Se necessario, altro liquido può essere aggiunto a matrice. Abbiate cura di aggiungere il campione di DNA corretto.
12. Aprire l'una camera hybd posizionare gli inserti sui serbatoi di umidificazione. Il codice a barre del chip deve essere collocato sopra il codice a barre inciso nella base della camera hyb. Riposizionare il coperchio della camera hyb e chiudere tutte le quattro chiusure chiudendo le fibbie sui lati diagonalmente opposti prima.
13. Incubare la camera hyb in forno per 16-24 ore. Fare attenzione a non inclinare le camere quando li spostano.
14. Se più di una piastra deve essere elaborato, tornare al punto 6.2. Elaborazione più di 24 chip di perline in un giorno non è raccomandato per entrambi minimizzare la probabilità di errore umano quando si maneggia una grande quantità di materiali di consumo o di chip e ridurre al minimo la quantità di tempo necessario per elaborare le chips in passi successivi, come la cura deve fine di limitare la loro esposizione all'aria il più possibile. Una bottiglia di XC4 è sufficiente per un massimo di 24 gettoni tallone.

Terzo giorno

7. Colorazione Preparazione

1. Togliere le camere Hyb dal forno e incubare a pranzo temperature per 25 min. Se il trattamento più di due camere Hyb, scaglionare la loro duplice allontanamento ogni 10 min. Al fine di mantenere i chip di essiccazione, ancora non aprire le camere Hyb.
2. Mentre le camere Hyb sono di raffreddamento, rimuovere tubi di XC1, XC2, TEM, STM, e ATM dal "Post-1" -20 ° C box e impostare in panchina per scongelare. Prendere una bottiglia di RA1 dalla casella "Post-2" a -20 ° C (o 4 ° C se riutilizzando il reagente dal giorno precedente) e disgelo in un bagno di acqua a temperatura ambiente. Scongelare un tubo di 95% formammide pure. Per 8 chip tallone trasformati, due tubi di ogni reagente, 10 ml, 15 ml RA1 formammide, e 150 XC3 ml (che si trova in una stanza a temperatura, box fornito da società) sarà richiesto.
3. Per ogni circuito integrato trasformati, slide un bicchiere, una coppia flow-through di plastica, due fermagli metallici, e un distanziale di plastica saranno necessari. Per il distanziatore in plastica, usare solo il chiaro uno, separare e gettare il distanziale opaco. Inoltre, due perline lavare i piatti di chip esarà necessaria una chip cassetto tallone, con una stazione di assemblaggio liquido e una barra di montaggio in plastica.
4. Pulire i vetrini da loro spruzzo con etanolo e asciugandosi asciugare.
5. Accendere il bagno di acqua calda che è attaccato al rack camera di flow-through e impostarlo a 44 ° C. Agitare delicatamente il rack da camera per rimuovere eventuali bolle.
6. Quando la camera hyb è raffreddato per 25 minuti, riempire un piatto di lavaggio con PB1 (circa 200 ml). PB1 possono essere trovate nella casella temperatura "Post-4" camera.
7. Aprire una camera hyb. Rimuovere la guarnizione del coperchio da un chip tallone afferrando il sigillo da un angolo e delicatamente peeling diagonale (vedere Figura 4). Una volta che il sigillo è stato rimosso, collocare immediatamente il chip in un vassoio di chip di perline e immergerlo in PB1 senza toccare le perline. Ripetere fino a quando il cassetto è pieno di patatine tallone, facendo attenzione a non lasciare alcun chip di asciugare.
8. Agitare delicatamente il vassoio per rimuovere eventuali bolle e lasciare i chip sommerse per 1 min.Riempire un secondo piatto di lavaggio con PB1. Agitare nuovamente il vassoio.
9. Spostare il vassoio di patatine tallone nel secondo piatto di lavaggio. Agitare delicatamente e lasciare macerare per 1 minuto, poi agitare nuovamente.
10. Nella stazione di assemblaggio a flusso continuo di liquido, posizionare quattro plastica nere bretelle flusso continuo nelle scanalature. Riempire la stazione con PB1 finché il liquido raggiunge quasi l'altezza degli otto staffe di montaggio (circa 150 ml).
11. Rimuovere un chip tallone dal vassoio e inserirlo nella stazione di assemblaggio su una flow-through brace plastica. Il codice a barre circuito integrato deve essere allineato sopra il simbolo del codice a barre inciso nella stazione di montaggio. Ripetere l'operazione per gli altri tre chip che può andare bene all'interno della stazione di assemblaggio.
12. Posizionare un distanziatore in plastica trasparente sulla cima di un chip tallone. I bordi esterni del distanziatore dovrebbero circondare le staffe all'interno della stazione di assemblaggio. Ripetere l'operazione per gli altri chip sommersi nel PB1.
13. Posizionare la barra di montaggio in plastica nella stazione di montaggio mediante innesto su scanalature. Posizionare delicatamente un vetrino sopra il distanziatore in plastica spingendo l'estremità posteriore della slitta contro la barra di montaggio e lentamente abbassando la fronte nel liquido. La scanalatura sulla parte superiore della slitta deve essere rivolto verso il basso, direttamente sopra il codice a barre del chip, lasciando uno spazio tra il chip tallone e la slitta a fine codice a barre. Ripetere l'operazione per gli altri chip sommersi nel PB1. Per un diagramma completo assemblaggio a flusso continuo, vedere la Figura 5.
14. Verificare la presenza di bolle tra il chip e scivolo. Se compaiono bolle, sollevare delicatamente il vetrino alla fine del codice a barre e riprovare. Bollicine persistenti possono essere rimosse dal vetro con un tovagliolo di carta laboratorio (Kimwipe).
15. Snap due ganci di metallo intorno al vetrino, una verso la fine del codice a barre e uno verso la parte posteriore. I bordi delle chiusure devono afferrare il tutore flow-through di plastica sotto il chip. Ripetere l'operazione per tutti i chip immerso in PB1.
16. Rimuovere i gruppi a flusso continuo completati e posizionare orizzontalmente sulla bEnch. Fare attenzione a non inclinare il montaggio in verticale, permettendo al liquido sotto il vetrino di fuggire. Se più chip sono in attesa nel vassoio lavaggio, possono essere montati sotto la stessa PB1. Se altri chip sono in attesa nelle loro camere Hyb originali, eliminare tutto il liquido nella stazione di montaggio e lavare i piatti, e tornare al punto 7.6.
17. Una volta che tutti i chip tallone siano nelle loro assiemi a flusso continuo, prendere un paio di forbici chirurgiche e tagliare le due estremità del distanziatore off, il più vicino al vetrino possibile.

8. Colorazione ed estensione

1. Verificare che il rack vaschetta di ricircolo ha raggiunto 44 ° C in più posizioni con una sonda di temperatura. Se la temperatura è spento da più di mezzo grado, regolare la temperatura del bagno d'acqua.
2. Collocare un gruppo deflusso truciolo tallone sulla cremagliera camera facendo scorrere l'assieme e agganciando il tutore in alto. Il lato posteriore del chip tallone deve toccare il telaio della camera. Il gdiapositiva lass deve essere rivolto verso l'esterno, con la scanalatura nella parte superiore per formare un serbatoio di reagente. Ripetere l'operazione per ogni assemblea di chip tallone.
3. Usando una pipetta 200 microlitri, aggiungere 150 microlitri RA1to assemblee flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 30 sec. Ripetere 5x.
4. Usando una pipetta 1.000 ml, aggiungere 450 microlitri XC1to assemblee flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 10 min.
5. Aggiungere 450 microlitri XC2 agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 10 min.
6. Aggiungere 200 microlitri TEM ai gruppi a flusso continuo da erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 15 min.
7. Aggiungere 450 microlitri della miscela 95% formammide / EDTA agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 1 min. Ripetere 1x.
8. Incubare le assemblee a flusso continuo per 5 min.
9. Impostare il bagno di acqua calda alla temperatura lSOCIE sui tubi di STM (o 37 ° C se viene mostrato nessuno). Assicurarsi che ogni tubo STM ha la stessa temperatura elencato.
10. Aggiungere 450 microlitri XC3 alle assemblee flusso continuo. Incubare per 1 min. Ripetere 1x.
11. Quando la temperatura del bagno di acqua calda ha raggiunto la temperatura desiderata, aggiungere 250 μLSTM agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 10 min.
12. Aggiungere 450 microlitri XC3 agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 1 min. Ripetere 1x.
13. Incubare le assemblee a flusso continuo per 5 min.
14. Aggiungere 250 microlitri ATM agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 10 min.
15. Aggiungere 450 microlitri XC3 agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 1 min. Ripetere 1x.
16. Incubare le assemblee a flusso continuo per 5 min.
17. Aggiungere 250 microlitri STM al flusso passantegruppi di erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 10 min.
18. ADD4 50 microlitri XC3 agli assembly flusso continuo dalla erogazione del liquido nel serbatoio di vetro. Incubare per 1 min. Ripetere 1x.
19. Incubare le assemblee a flusso continuo per 5 min.
20. Ripetere i passaggi 8,14-8,19 1x.
21. Rimuovere i gruppi a flusso continuo dal rack da camera e spegnere il bagnomaria.

9. Lavaggio e tenuta

1. Riempire un piatto di lavaggio chip di colorazione tallone con PB1 (circa 315 ml). Occorrono due piatti di lavaggio verticali e un vassoio di chip branello verticale, insieme con almeno un collettore di vuoto.
2. Smontare un gruppo flow-through inserendo una barra di metallo sottile tra i fermagli e il tutore e poi girevole. Mettere da parte il vetrino e rimuovere il chip tallone. Porre immediatamente il chip tallone nel vassoio di chip cordone verticale e immergere in PB1. Ripetere l'operazione per ogni assemblea flow-through, avendo cura di affrontare each di chip tallone nella stessa direzione e minimizzare la loro esposizione all'aria.
3. Agitare delicatamente il vassoio di chip tallone per rimuovere le bolle. Incubare le patatine tallone sommerse in PB1 per 5 min. Riempire il secondo piatto lavaggio verticale con la XC4 preparato il giorno precedente. Agitare di nuovo il vassoio di chip tallone.
4. Spostare il vassoio di chip tallone al piatto di lavaggio riempita con XC4. Agitare delicatamente il vassoio per rimuovere le bolle. Incubare per 5 minuti e agitare di nuovo.
5. In un unico movimento fluido, estrarre il vassoio di chip tallone dal piatto di lavaggio e impostare su un rack provetta, in modo che le perline su tutti i chip tallone volto verso l'alto. Con pinzette autobloccanti, far scorrere un chip tallone dal vassoio e posizionare su un rack provetta. Ripetere l'operazione per tutti i chip tallone.
6. Trasferire con cautela il rack provetta di chip per un essiccatore a vuoto. Chiudere e accendere il vuoto, assicurando una tenuta adeguata. Incubare per 50-55 min. Se necessario, riscaldare lo scanner durante l'incubazione.

10. Scansione

1. Turn fuori il vuoto e lentamente tornare la pressione atmosferica. Controllare che i chip tallone sono asciutti. Se necessario, pulire i bordi e il fondo del chip con un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido o detriti.
2. Attivare il software di scansione e spostare i chip tallone di vassoio scansione. Scarica decodificare i file del chip (DMAP) attivando il software client di decodifica di file e inserendo i codici a barre di chip tallone desiderati, insieme ai loro corrispondenti ID box. Chip tallone non scansite possono tranquillamente essere conservati in un luogo asciutto e buio fino a 72 ore.
3. Una volta che i chip sono correttamente inseriti nel vassoio e decodifica i file vengono riconosciuti dal software, avviare la scansione.

Risultati

Un chip tallone adeguatamente trasformati dovrebbe mostrare intensità della luce laser rosso e verde brillante e distinti durante la scansione. Nella Figura 6, il software di scansione iScan visualizza un campione di DNA genomico di serie ibridato con successo in una matrice di SNP genotipizzazione custom-panel. I nucleotidi marcati che sono stati attaccati durante le fasi di ampliamento e di colorazione fluorescenti sotto le luci dei due laser. Poiché questi nucleotidi selettivamente estendono catena oligonucleotide del tallone ibridato al filamento di DNA frammentato, e come le catene oligonucleotidiche sono progettati per terminare al sito della variante, il colore e l'intensità del segnale risultante può essere utilizzato per determinare gli alleli presenti alla sito SNP.

Un foglio user-generated campione che corrisponde ID dei campioni e le informazioni cliniche per ChipID e la posizione, e SNP manifesto specifico array, ottenuto direttamente dalla società, sono entrambi necessari per importare la scafile di output NNER nel software di analisi GenomeStudio. Fogli Esempio di esempio si possono trovare sul sito web della società. Una volta che il progetto GenomeStudio è costruito, genotipi possono essere ottenuti dai grappoli di intensità risultanti generati automaticamente dal software. Anche se esistono diverse opzioni di visualizzazione, la visualizzazione predefinita, Norm-R (un valore di intensità normalizzato) vs Norm-Theta (un rapporto di intensità allelica), è spesso la trama più semplice per distinguere tre gruppi distinti. La maggior parte degli SNPs dovrebbero mostrare una, due, o tre gruppi, a seconda della frequenza dell'allele minore.

I tre cluster rappresentano esempi che dimostrano AA, AB, o alleli BB (vedi Figura 7). Questi gruppi possono essere assegnati genotipi sia importando un modello di posizione di clustering di serie direttamente dalla società, selezionando "cluster All SNPs" dalla barra degli strumenti di analisi del software, o cliccando e trascinando i cerchi colorati nelle piazzole intensità di edi manualmente t chiamate. Il colore del campione sul terreno intensità (rosso, viola o blu) indica la chiamata (AA, AB o BB, rispettivamente); nero indica nessuna chiamata. Scorrendo gli SNPs elencati nel riquadro Dati completa del software, il raggruppamento per ogni SNP può essere visualizzato o richiamato. Una volta che i grappoli vengono assegnati chiamate soddisfacenti, il riquadro Dati completi del software elenca i genotipi per ogni singolo campione a ogni particolare SNP. L'opzione Scelta colonne sopra il tavolo può commutare formati di dati.

I dati possono essere esportati tramite la barra degli strumenti di analisi o direttamente dalla tabella dei dati completi per un'analisi approfondita.

Figura 1. Panoramica - Infinium Assay protocollo.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2. Completa Hyb Camera base e mat, più coperchio. ^[12] Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3 Caricamento di un BeadChip -.. Versare il campione sulle porte di ingresso ^[12] Clicca qui per ingrandire immagine.

Figura 4 Rimozione della BeadChip Coverseal -.. Afferrare la tenuta in un angolo e staccare delicatamente diagonale ^[12] Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5. Complete Assembly BeadChip Flow-through - Il BeadChip è separata da un vetrino con un distanziale e legato con fermagli.> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 6. Successo Scan BeadChip - A) La BeadChip viene scansionato sia con un laser rosso e verde, i display software di scansione entrambi contemporaneamente. Le sezioni di passaggio QC intensità evidenzieranno verde sul display BeadChip a sinistra. Sezioni mancanza QC intensità si evidenziano rosso sul display BeadChip. B) Una volta completata la scansione, il software sovrapporre i display rosso e verde. Viene mostrato un immagine ingrandita. Il colore e l'intensità di ogni singolo cordone indica l'allele presente. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Profili cluster - A) Un valido SNP con tre gruppi distinti che rappresentano AA, AB, e genotipi BB, rosso, viola e blu colorato B) A SNP modifica richiede.. Il cluster centrale, che dovrebbe essere omozigote AB, viene lasciato un-chiamato. Il cluster BB è erroneamente chiamato AB. C) Un povero prestazioni SNP. Non genotipi possono essere ottenuti da questa trama di intensità, come non esistono gruppi distinti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussione

Sono state utilizzate applicazioni di genotipizzazione su larga scala per comprendere meglio il meccanismo genetico alla base di molte malattie umane. La scoperta di una variante significativa attraverso un'analisi di associazione genome-wide in grado di contrassegnare una regione candidato per ulteriori studi. Inoltre, i dati genotipo è un buon strumento per il controllo di qualità su progetti di sequenziamento.

Per ottimizzare la velocità di campionamento, più lastre di esempio possono essere amplificati e conservati nei loro frammentati, stati risospeso. Otto piastre possono essere amplificati in un solo giorno, combinando la prima 24 ore di protocollo per più lotti e di fornire materiale sufficiente per ~ 2-8 giorni di chip di elaborazione. Se le piastre amplificati sono stoccate in anticipo, e se i nuovi campioni sono ibridate al chip subito dopo la scansione comincia in fuga precedente, trasformazione possono funzionare in continuo senza la necessità di una pausa per la preparazione del campione aggiuntivo. Pertanto, anche se i campioni avranno tre giorni per sottoporsi alla completasaggio, i dati possono essere generati giornalmente. Chip Assuming24 sono trattati ogni giorno, una settimana lavorativa di cinque giorni consente da oltre 1.000 campioni di DNA da eseguire su un chip tallone 12 campioni. Se un passaggio o reagente è venuto meno, tuttavia, più batch potrebbero essere a rischio per scarso rendimento prima di qualsiasi correzione può essere applicata. Gli errori possono sfuggire avviso fino a quando gli array sono scansionati o analizzati, pertanto, se la velocità è massimizzata, centinaia di campioni in varie fasi del protocollo potrebbero essere già ricevuto lo stesso trattamento difettoso al momento della scoperta. Come reagenti e dati persi non possono essere recuperati, l'utente deve soppesare i rischi contro la necessità di un flusso di lavoro accelerato.

Il software di analisi GenomeStudio è la prima occasione per misurare realmente il successo del processo di genotipizzazione. Se la norma-R vs Norm-Theta trame intensità siano correttamente raggruppati, il tasso medio di chiamata (per cento del totale SNPs digitato correttamente) dei campioni dovrebbe avvicinarsi al 99%, anche se questo valore varia slightly a seconda del tipo di matrice. I dati da qualsiasi campione con un tasso di chiamata inferiore al 85-90% non è affidabile e devono essere eliminati. Ai fini del controllo di qualità, i risultati devono essere confrontati con eventuali genotipi quando possibile già noti. Se non esistono tali dati, intenzionale duplicazione del campione è uno strumento utile per la verifica della targa o matrice posizionamenti. Queste coppie duplicati dovrebbero essere immessi sul chip separati, piatti, lotti, o progetti, i loro genotipi controllati dopo generazione. Mentre specifici vincoli QC variano a seconda della preferenza del ricercatore, i vincoli comuni SNP sono basati sul successo chiamata di esempio, Hardy-Weinberg, o dati mancanti tra casi e controlli, mentre i vincoli del campione comuni si basano sui tassi di chiamata, incoerenze mendeliana o riferimenti incrociati del cromosoma X eterozigosi ai dati clinici di genere ^[13].

Se qualunque problema si pone, Dashboard Controls, che si trova nella suite di analisi, può essere presentata alazienda al fine di determinare la causa. Questi controlli possono spesso restringere la questione alla fase più probabile o il fallimento del reagente. Se qualche SNPs di interesse possono essere individuate attraverso un esperimento di genotipizzazione Infinium, le loro trame intensità dovrebbero essere controllate in GenomeStudio per errori di clustering prima di un ulteriore ricerca è condotta.

Un esperimento di genotipizzazione Infinium fallito è probabilmente dovuto a un errore umano o di trasformazione del DNA di ingresso di scarsa qualità. Esempio di quantificazione deve essere accurata e precisa. Per ottenere i migliori risultati, eventuali reagenti aggiunti a qualsiasi campione o chip devono essere dispensati al volume stabilito dal protocollo. Le pipette devono essere opportunamente tarati. I reagenti non devono essere eseguiti dopo la scadenza e non devono essere ricongelati una volta scongelati, tranne che per il reagente RA1. Al fine di minimizzare i possibili errori di colorazione e di estensione, la miscela formammide / EDTA deve essere preparato fresco ogni mese. Tutti i -20 ° C i reagenti devono essere conservati solo in congelatori manuale sbrinamento. Tutte le attrezzature utilizzate nel stAining, ampliamento e lavaggio parti del protocollo devono essere risciacquati abbondantemente con acqua e detergente neutro immediatamente dopo disuso. I serbatoi umidificazione nella camera hyb dovrebbero essere abbattuti con un pennello provetta e un detergente delicato. I vetrini devono essere lavati con candeggina al 10%, come indicato dal loro manuali d'uso, una volta a settimana.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale di consumo o attrezzatura	Produttore	Numero di parte	Minimo richiesto per 96 campioni
0,8 ml Piastra a pozzetti profondi	Thermo Scientific	AB-0765	1
Piastre Tappetini	Thermo Scientific	AB-0674	2
Bacino di reagenti	Fisher Scientific	13-681-502	9
Fogli termosaldanti	Thermo Scientific	AB-0559	1
Distanziatore a flusso continuo	Fisher Scientific	NC9563984	6
Puntali per pipette - 200 μ l	Puntali per pipette Rainin	GP-L200F	192
- 10 μ l	Rainin	GP-L10F	16
puntali per pipette - 1.000 &00 &; l	Rainin	GP-L1000F	16
DNA sospensione tampone	Teknova	T0220	0,5 ml
0,1 N NaOH	Fisher Scientific	AC12419-0010	0,5 ml
Isopropanolo (grado HPLC)	Fisher Scientific	A451	15 ml
Etanolo (200-proof)	Sigma-Aldrich	459836	330 ml
Formamide (100%)	Thomas Scientific	C001K38	15 ml
EDTA (0,5 M)	Amresco	E177	0,2 ml
10 μ l Pipetta a 8 canali	Rainin	L8-10XLS	1
200 μ l Pipetta a 8 canali	Rainin	L8-200XLS	2
1.000 μ l Pipetta monocanale	Rainin	L-1000XLS	1
Agitatore per micropiastre	VWR	13500-890	1
Centrifuga per micropiastre	refrigerata VWR	BK369434	1
Forno di ibridazione	Illumina	SE-901-1001	1
Incubatore per microcampioni Hybex	SciGene	1057-30-0	1
Inserto	per blocchi termici MIDI HybexIllumina	BD-60-601	1
Termosigillatrice	Thermo Scientific	AB-0384	1
Camera Hyb con inserto e tappetino	Illumina	BD-60-402	2
Forbici chirurgiche	Fisher Scientific	13-804-20	1
Flusso attraverso le parti di assemblaggio	Illumina	WG-10-202	8
Stendibiancheria e piatto	Illumina	BD-60-450	1
Genepaint Rack per camera	Tecan	760-800	1
sonda di temperatura	Illumina	A1-99-109	1
rack e piatto di colorazione	Illumina	WG-10-207	1
pinzetta a chiusura automatica	Ted Pella, Inc	5374-NM	1
collettore per vuoto	Ted Pella, Inc	2240	1
iScan o HiScan	Illumina	-	1

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