Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.
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Articolo metodologico
Trapianti viso a
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malformazioni congenite craniofacciali si verificano in 1 su ogni 700 nati vivi, ma l'eziologia è raramente noto a causa della limitata comprensione dello sviluppo cranio-facciale. Per identificare dove percorsi e tessuti segnalazione agiscono durante patterning del viso sviluppo, una tecnica 'trapianto di faccia' è stato sviluppato in embrioni di rana Xenopus laevis. Una regione di presuntiva tessuto facciale (il "Extreme anteriore Domain" (EAD)) viene rimosso da un embrione donatore in fase tailbud, e trapiantato in un embrione ospite della stessa fase, di cui la regione equivalente è stato rimosso. Questo può essere usato per generare una faccia chimerico in cui il tessuto ospite o donatore ha una perdita o guadagno di funzione in un gene, e / o include un'etichetta lignaggio. Dopo la guarigione, il risultato dello sviluppo è monitorato, e indica ruoli della via di segnalazione all'interno del donatore o circostanti tessuti dell'ospite. Xenopus è un modello valido per lo sviluppo viso, come la regione facciale è grande e facilmente unaccessible per micromanipolazione. Molti embrioni possono essere analizzati, nel corso di un breve periodo di tempo dal momento che lo sviluppo avviene rapidamente. I risultati nella rana sono rilevanti per lo sviluppo umano, dal momento che i processi cranio-facciali appaiono conservati tra Xenopus e mammiferi.
Introduzione
Per comprendere i meccanismi alla base difetti cranio-facciali congenite 1-2, tessuti importanti e il loro contributo di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale deve essere identificato. Nella rana Xenopus laevis, parte del viso, compresa la bocca e la forma narici dal "Extreme anteriore Domain" (EAD), dove ectoderma e l'endoderma sono direttamente giustapposti 3-4. L'EAD funge anche da centro di segnalazione di influenzare i tessuti circostanti, tra cui la cresta neurale cranica, che forma le mascelle e altre regioni facciali 5. Per identificare i geni che contribuiscono alla funzione EAD, una tecnica di '....
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Protocollo
1. Reagenti Preparazione
- 10x MBS: Preparare 1 L di 10x modificata di Barth Saline (MBS) soluzione 17. Fare riferimento alla Tabella 1, reagenti, gli ingredienti e le istruzioni. Utilizzare acqua distillata per tutte le soluzioni. Mescolare in un bicchiere, con un ancoretta, fino al completo scioglimento. Tutte le soluzioni devono essere effettuate a temperatura ambiente.
- 1x MBS: Diluire 100 ml di soluzione 10x MBS in 900 ml di acqua distillata per fare 1 l di 1x MBS. Aggiungere 0,7 ml di 1 M CaCl 2 soluzione.
- 0.1x MBS: diluire 1x MBS per preparare 1 L di soluzione 0,5 x MBS e 2 L di 0.1x soluzione ....
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Risultati
Tessuto trapiantato deve essere completamente inserita nella testa ospitante dopo il trapianto, come mostrato nella Figura 3A, e hanno un ponte di vetro opportunamente posizionato sulla faccia dell'embrione, come mostrato nella Figura 2BC. Il tessuto donatore trapiantato deve essere dimensionato correttamente per l'apertura ospitante, per il trapianto abbia successo. Il tessuto EAD non deve sporgere dalla testa, in qualsiasi modo, come si vede nelle figure 3B e .......
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Discussione
Fasi critiche e limitazioni: La procedura di trapianto di faccia EAD è il tempo e il lavoro intenso. Si richiede pratica, mano ferma, e la destrezza di perfezionare. Il protocollo di trapianto di faccia si basa sulla capacità del ricercatore di rimuovere in modo efficiente e il tessuto di trapianto. Se si prende troppo tempo per inserire il trapianto nel volto del padrone di casa, il volto ospite inizierà a contrarsi e guarire. Pinze possono essere utilizzati per espandere delicatamente la regione facciale. Tutta.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Radek Šindelka per il suo aiuto, e Cas Bresilla per aiutare con la rana allevamento e preparazione embrione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH tramite il R01DE021109 concessione di HLS Laura Jacox è stato finanziato dalla Herschel Smith Graduate Fellowship presso la Harvard University e una borsa F30 borsa individuale F30DE022989-01 attraverso il NIDCR.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipetta Pasteur | VWR | 14672-400 | Vetro Lime |
| Misura 5 3/4 in | cotone con tappo | ||
| Pipetta di trasferimento graduata | VWR | 16001-180 | monouso |
| #5/45 pinza | Fine Science Tools di Dupont medical | 11251-35 | angolata 45 gradi |
| Pinze modello standard | Fine Science Tools | 11000-20 | Dritto; punta seghettata; acciaio inossidabile |
| Tubo capillare (per aghi) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/ |
| Fibra Copertura slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro vetro di copertura; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Estrattore per aghi | Estrattore per aghi Sutter Instrument Co | : fuori produzione Filamento: FB300B | L'estrattore per aghi più simile, attualmente disponibile, è il P-97. Per i filamenti, utilizzare filamenti Sutter a scatola quadrata da 3,00 mm, larghi 3,0 mm. |
| Modello P-80 | per micropipette fiammeggiante / marrone | ||
| Stereomicroscopio | Zeiss | ||
| Stereomicroscopio Illuminazione di Fostec | Fostec | Utilizzare una scatola luminosa con 2 bracci in fibra ottica. | |
| Portaspilli nichelato | Strumenti per la scienza | 26018-17 | Diametro dell'apertura della ganascia: 0-1 mm |
| Portaperno nichelato Moria | per la scienza fine | 26016-12 | Diametro dell'apertura della ganascia: 0-1 mm |
| Aghi di tungsteno Strumenti per | la scienza fine 10130-05 | 0,125 mm Diametro dell'asta | |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Argilla da modellare: bianca, rossa o giallo | |||
| mMessage mMashine SP6 o T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Riferimenti
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potenti....
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Ristampe e permessi
