Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.
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Articolo metodologico
Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli sforzi per individuare e indagare principali mutazioni oncogene si sono rivelate preziose per facilitare il trattamento appropriato per i pazienti oncologici. L'istituzione di high-throughput, massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" ha favorito la scoperta di molte di queste mutazioni. Per migliorare l'utilità clinica e traslazionale di questa tecnologia, piattaforme devono essere ad alta produttività, conveniente e compatibile con paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni di tessuto che possono produrre piccole quantità di DNA degradato o danneggiato. Qui, descriviamo la preparazione di librerie di DNA barcode e multiplex seguite da base di ibridazione-cattura di esoni mirati per la rilevazione delle mutazioni tumorali associate a tumori freschi congelati e FFPE di sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l'identificazione di mutazioni di sequenza, copia numero di alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono tutti i geni target. Mirato esone sequenziamento offre tegli beneficia di throughput elevato, a basso costo, e la copertura sequenza profondo, conferendo ad alta sensibilità per la rilevazione di mutazioni a bassa frequenza.
Introduzione
L'identificazione di "driver" tumorali eventi genetici in oncogeni chiave e geni oncosoppressori gioca un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento di molti tumori 1. Attività di ricerca su larga scala che utilizzano massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" hanno permesso l'identificazione di molti di questi geni del cancro-associata negli ultimi anni 2. Tuttavia, queste piattaforme di sequenziamento in genere richiedono grandi quantità di DNA isolate da tessuti freschi congelati, ponendo così una limitazione importante nella caratterizzazione e l'analisi di mutazioni del DNA dai tessuti conservati, come la p....
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Protocollo
1. DNA e Preparazione dei reagenti
Nota: Questo protocollo descrive l'elaborazione simultanea e l'analisi di 24 campioni (ad esempio 12 / coppie tumorali normali) ma può essere adattato per lotti piccoli e più grandi. Campioni di DNA possono derivare da FFPE o tessuto fresco congelato, campioni citologici, o di sangue. Tipicamente, entrambi tumore e tessuto normale dello stesso paziente sarà profilata insieme per distinguere mutazioni somatiche da polimorfismi ereditati. Il protocollo inizia immediatamente dopo l'estrazione del DNA.
- Aliquota 50-250 ng (250 ng consigliato) di DNA estratto per campione, dilui....
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Risultati
Una piscina di 24 biblioteche sequenza codice a barre (12 paia tumore-normale) è stato catturato utilizzando sonde corrispondenti a tutti gli esoni codificanti proteine di 279 geni del cancro e sequenziato da 2 x 75 bp legge su una sola corsia di una cella di flusso HiSeq 2000. Tumore e biblioteche normali sono stati raggruppati in un rapporto 2:1. Metriche di performance Esempio per una piscina di surgelati campioni di DNA del tumore sono mostrati in figura 1, tra cui il tasso di allineamento, distri.......
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Discussione
Il nostro test IMPACT produce un alto tasso di allineamento, alto tasso on-target, elevata copertura di destinazione, e ad alta sensibilità per le mutazioni rilevamento, indels, e numero di esemplari alterazioni. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro test IMPACT alla sequenza di DNA sia fresco congelato e archiviato campioni FFPE di ingresso DNA bassa. Eseguendo mirata esone sequenziamento dei geni del cancro-associata chiave, si può ottenere una copertura sequenza molto profondo per gli esoni di questi geni più cri.......
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Dichiarazioni
Il dottor Berger ha ricevuto compensi per consulenze e finanziamenti per la ricerca da Medicine Foundation, una società di diagnostica del cancro.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Agnes Viale e il MSKCC Genomica Nucleo Laboratorio per l'assistenza tecnica. Questo protocollo è stato sviluppato con il sostegno della Geoffrey Beene Cancer Research Center e dalla Fondazione Farmer famiglia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Modulo di legatura rapida | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomica | ||
| Codici a barre NEXTflex senza PCR – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| Kit di amplificazione per librerie HiFi | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT DNA umano, grado fluorimetrico | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Kit di ibridazione e lavaggio | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Libreria Esche | Roche NimbleGen | ||
| Kit di purificazione per PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| Kit di analisi Qubit dsDNA ad ampio intervallo (BR) | Life Technologies | Q32850 | |
| Kit di test Qubit dsDNA ad alta sensibilità (HS) | Life Technologies | Q32851 | |
| Kit Agilent DNA HS | Tecnologie Agilent | 5067-4626, 4627 | |
| Bioanalizzatore Agilent 2100 | Agilent | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Supporto Magnetico-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Riferimenti
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C....
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Ristampe e permessi
