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Articolo metodologico

Interrogatorio funzionale di età ipotalamico neurogenesi con focale Radiological inibizione

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DOI:

10.3791/50716

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14 novembre 2013

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1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

La funzione dei neuroni di mammifero adulto-nato rimane un'area attiva di ricerca. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita di nuovi neuroni. Utilizzando la tomografia computerizzata guidata irradiazione focale (CFIR), tridimensionale anatomico di mira specifiche popolazioni progenitrici neurali può ora essere utilizzato per valutare il ruolo funzionale della neurogenesi adulta.

Abstract

La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa. Approcci per inibire neurogenesi adulta tramite consegna virale invasivo o animali transgenici hanno potenziali confonde che rendono l'interpretazione dei risultati di questi studi difficile. Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di indagare in modo non invasivo la funzione di selezionare gruppi di neuroni adulti nati attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti Focal inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni e consente il targeting di specifiche regioni progenitrici neurali. Per illuminare il potenziale ruolo funzionale che la neurogenesi adulta ipotalamico svolge nella regolazione dei processi fisiologici, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti nati nel eminenza mediana dell'ipotalamo. Descriviamo un metodo per C omputer tomografia-guidaf Ocal ir radiazione (CFIR) la consegna per consentire preciso e accurato anatomica di targeting in piccoli animali. CFIR utilizza l'orientamento dell'immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose di radiazione, riduce al minimo l'esposizione alle radiazioni regioni cerebrali nontargeted, e consente la distribuzione della dose conforme con i confini del fascio taglienti. Questo protocollo permette di porre domande riguardanti la funzione dei neuroni adulti di nascita, ma apre anche le aree a domande nei settori di radiobiologia, biologia dei tumori, e dell'immunologia. Questi strumenti radiologici faciliteranno la traduzione di scoperte al banco al capezzale.

Introduzione

Recenti scoperte hanno dimostrato che il cervello dei mammiferi adulti può subire un notevole grado di plasticità. Neuroni nati adulti, vengono generati durante l'età adulta in nicchie specializzate del cervello dei mammiferi 1. Qual è la funzione di questi neuroni adulti nati? E tanto più, non giocano un ruolo nella fisiologia e del comportamento? Studi su questo argomento sono tradizionalmente focalizzati sulla zona subventricular dei ventricoli laterali e la zona subgranulare dell'ippocampo, tuttavia, studi recenti hanno caratterizzato neurogenesi in altre regioni del cervello come l'ipotalamo mammifero 2. Neurogenesi è stata riportata nel postnatale e adulta ipotalamo 2-10, e la funzione di questi neuroni ipotalamici neonati rimane un'area attiva di ricerca.

La caratterizzazione funzionale dei neuroni adulti nati rimane una sfida significativa per il campo delle neuroscienze in generale. L'inibizione selettiva di specific popolazioni progenitrici neurali resta limitata dalla mancanza di marcatori molecolari disponibili che sono unici per singole popolazioni progenitrici neurali 11. Così, l'eliminazione selettiva dei neuroni adulti nati da questi progenitori neurali tramite il targeting genetico rimane difficile. Allo stesso modo, la consegna virale di indirizzare neuroni adulti nati soffre di potenziali variabili confondenti quali l'introduzione di lesioni e infiammazioni nell'ambiente 12.

Nuovi strumenti radiologici stanno emergendo, tuttavia, che permettono di aggirare queste confonde e indagare queste domande attraverso accurata e precisa di targeting anatomica nei piccoli animali. Radiazioni ionizzanti inibisce la nascita e la differenziazione di nuovi neuroni, e permette un metodo non invasivo per indirizzare le popolazioni progenitrici neurali 13-15. Recentemente, abbiamo descritto una regione germinale dell'eminenza mediana dell'ipotalamo mammiferi (ME) che abbiamo chiamato la zona proliferativa ipotalamico (HPZ) 2 . Abbiamo scoperto che quando i giovani topi femmina adulti sono stati dati una dieta ricca di grassi (HFD), i livelli di neurogenesi nei topi HFD-alimentati erano nettamente superiori a loro chow normale (NC) controlli alimentati in questa regione ME 2. Per verificare se neurogenesi adulta all'interno della ME ipotalamo regola il metabolismo e il peso, abbiamo cercato di interrompere questo processo. L'eminenza mediana è una piccola struttura unilaterale alla base del terzo ventricolo da cui vengono rilasciati ormoni regolamentazione. Al fine di inibire la proliferazione e la successiva neurogenesi senza alterare le altre funzioni fisiologiche di questa regione del cervello, abbiamo sviluppato una tecnica di irradiazione focale non invasivo per inibire selettivamente la nascita di neuroni adulti appena nati nel eminenza mediana ipotalamico 2.

Un certo numero di gruppi hanno impiegato radiazione per sopprimere la neurogenesi nelle regioni canonici 14-28. Tuttavia, gli approcci radiologici precedenti hanno generalmente mirata grandi aree, o often involontariamente preso di mira anche diverse aree cerebrali in cui e 'stato segnalato neurogenesi, il che rende difficile associare in modo univoco tutti i difetti comportamentali osservati con difetti in specifiche popolazioni progenitrici neurali. La capacità di irradiazione più mirato è fornito dalle piattaforme radiologiche che combinano c omputer tomografia guidata con radiazioni Ocal f fascio ir (CFIR) la consegna per consentire precisa anatomica di targeting 29-36. Fasci di radiazioni fino a 0,5 mm di diametro sono a disposizione per indirizzare specifiche popolazioni progenitrici neurali 35. Questa metodologia ci permette di indirizzare il ME ipotalamo e l'arresto della proliferazione e blocchiamo la neurogenesi nei piccoli animali. Dopo il trattamento radiologico nelle popolazioni progenitrici, prove funzionali e comportamentali possono essere eseguite per illuminare la funzione potenziale di cellule adulte-nato. Il targeting focale è particolarmente importante per la nostra applicazione in quanto laghiandola pituitaria si trova vicino alla eminenza mediana dell'ipotalamo, irradiazione dell'ipofisi può influenzare la funzione ormonale e successivamente confondere risultati.

La base biologica per la soppressione della neurogenesi dopo irradiazione rimane ancora poco chiaro. Gli studi di radiazione precedenti hanno fatto affidamento su grandi travi della zona, e hanno concluso che la soppressione della neurogenesi è mediata da una risposta infiammatoria 14, 37. Come tale non è chiaro se l'irradiazione altamente focale potrebbe sopprimere la neurogenesi, dal momento che non evoca una risposta infiammatoria notevole. Tuttavia, studi recenti nostro gruppo del classico regione neurogenica nell'ippocampo hanno dimostrato che l'irradiazione altamente focale con una dose di 10 Gy può sopprimere neurogenesi per almeno 4 settimane dopo l'irradiazione 35.

Per interrogare la funzione di adulti nati neuroni ipotalamici nella eminenza mediana, usiamo una radiazione di precisione device in grado di erogare TC in combinazione con piccolo diametro fasci di radiazioni per inibire ME neurogenesi. L'utilizzo di un tubo a raggi X attaccato ad un cavalletto che ruota in un intervallo di 360 °, trasportiamo arco-Trave micro irradiazione con l'uso di un portaoggetti controllato robot che permette la rotazione di un soggetto animale durante il trattamento con radiazioni (Figura 1) . Un rivelatore di raggi X ad alta risoluzione viene utilizzato per acquisire immagini quando il cavalletto è in posizione orizzontale 33. Per questo studio, immagini CT sono state ricostruite con una dimensione voxel isotropico di 0.20 mm. Bordo TC permesso l'identificazione di un obiettivo, mentre l'animale è in posizione di trattamento. L'obiettivo è stato localizzato utilizzando il software di navigazione CT dose di pianificazione, che era inclusa con il nostro disponibile in commercio piattaforma radiologica. Dopo localizzazione nostro ROI TC, l'animale è stato spostato nella posizione di trattamento appropriato dal portaoggetti robotico che ha quattro gradiRees di libertà (X, Y, Z, θ). Attraverso una combinazione di angoli gantry e stage robot, le travi possono essere forniti da quasi qualsiasi direzione rispetto per l'animale, e trattamenti ad arco-like stereotassica sono possibili 29. Per questi e altri studi di imaging, i topi sono stati posizionati in un dispositivo di immobilizzazione che consente l'erogazione di gas anestetico isoflurano mentre limita il movimento. Il letto immobilizzazione è compatibile CT, e si connette al portaoggetti robotico 34.

Ci aspettiamo che CFIR fornirà anticipazioni concettuali in un certo numero di aree di ricerca. Anche se usiamo il targeting radiologica dell'eminenza mediana ipotalamico come prova di principio di questa tecnica, CFIR può essere utilizzato per mirare qualsiasi regione del corpo di qualsiasi piccola organismo modello in linea di principio. Nelle neuroscienze, per esempio, prevediamo questa tecnica può essere utilizzata per valutare la funzione di popolazioni progenitrici attivamente proliferanti che sono state proposte per esit in altri organi circumventricolari, come l'area postrema 38, 39, organo subfornicale 40, e l'ipofisi 41. Controversie di lunga data per quanto riguarda il ruolo funzionale della neurogenesi adulta e che identificano un ruolo causale nel comportamento possono ora essere meglio affrontati. In songbird, questa tecnica potrebbe riguardare il ruolo di neurogenesi nel mantenere il comportamento robusta e stagionale degli uccelli 42, che è stato ostacolato dalla capacità di inibire selettivamente neurogenesi in specifiche regioni cerebrali. La comprensione di questo modello comportamentale robusta potrebbe gettare nuova visione del ruolo della neurogenesi adulta nel regolare altri comportamenti dimorfismo sessuale. In alternativa, nel campo metabolico, CFIR potrebbe essere utilizzato per esplorare aspetti del ruolo di epatociti proliferazione e il suo ruolo nel metabolismo e bilancio energetico. La possibilità di avanzamento concettuale in molteplici discipline di ricerca viene migliorato con l'introduzione di questa tecnica.

In questo lavoro, abbiamo dimostrato le capacità di CFIR per la precisione anatomica di targeting di un fascio di irradiazione focale. Anche se inizialmente abbiamo sviluppato questa piattaforma di ricerca sulle radiazioni di piccoli animali (SARRP) per i nostri studi, altri dispositivi simili sono ora disponibili in commercio che può compiere simili TC guidata irradiazione focale 43, 44. Quindi, generalizziamo questo protocollo CFIR con passaggi necessari per tutte le piattaforme di ricerca piuttosto che quelli specifici per SARRP. I vantaggi di CFIR oltre approcci radiologici precedenti per inibire neurogenesi sono che questa tecnica permette orientamento immagine volumetrica tridimensionale per la localizzazione e il targeting della dose, la dose conformazionale minimizza l'esposizione di regioni cerebrali nontargeted e geometria della trave alta precisione permette di distribuzione della dose conforme con confini fascio taglienti. Delineiamo come usare l'imaging TC guidata di indirizzare la dose di una regione anatomica specifica e su questo modo, come visualizzare la radiazionedosare la distribuzione direttamente nel tessuto utilizzando colorazione immunoistochimica per γ-H2AX, un marker di DNA a doppio filamento breaks 35, 45-48. L'uso di questo approccio per l'irradiazione selettiva di nicchie neurogena può avere implicazioni significative nel rivelare il ruolo funzionale di nuovi neuroni adulti nati sulla fisiologia e patologia.

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Protocollo

Uso Animal

Ottenere l'approvazione dal Comitato istituzionale, cura degli animali ed uso di protocolli di cura standard di utilizzo. Il protocollo attuale è stato sviluppato per studi di irradiazione focali 5,5-10 settimane di età adulte C57BL6 / J topi, come precedentemente descritto (Figura 2) 2. Tuttavia, altre epoche e le piccole specie animali (ratti, criceti, scoiattoli di terra, ecc) possono essere utilizzati anche, a condizione che i protocolli di anestesia efficaci e di un atlante di riferimento radiografici che consentono di identificare la regione di interesse (ROI) sono disponibili.

1. Taratura di TC guidata piattaforma radiologica

Effettuare calibrature a pellicola per dose di radiazioni sulla piattaforma radiologica in anticipo per ciascun formato collimatore e tipo di filtro tubo radiogeno utilizzato. Al fine di indirizzare un fascio di irradiazione arco al sito bersaglio desiderato, utilizzare la radiazione software dose-pianificazione 49 dispone sulla maggior parte delle piattaforme di radiazione commerciali per calcolare i tempi di consegna necessaria in base alla dose di radiazione, la profondità della regione di interesse (ROI) basato su TC del mouse e la velocità di rotazione della piattaforma robotica; dettagli su questo sono lasciati fuori di questo protocollo in quanto essi differiscono tra le piattaforme di radiazione. Ai fini della visualizzazione del ventrobasal ipotalamo 2 (Figura 3) con TC, azionare il tubo radiogeno con macchia focale 0,4 mm ed energia del fascio 100 kVp con 1 mm Al filtrazione. Per irradiazione focale del HZP azionare il tubo radiogeno a 225 kVp, 13 mA, e un punto focale 1 mm con filtrazione 0,15 mm e Cu, per fornire 10 Gy di radiazioni tessuti a una profondità di 0,6 cm su un trattamento tempo di 4.6 min. Targeting tra diversi ROI sarà necessario calcolare diversi parametri.

  1. Se studiare gli effetti della dieta ricca di grassi sulla neurogenesi nel eminenza mediana come descritto in precedenza 2, avere quattro settimane di età C57B femminileL6 / J topi da laboratorio Jackson Mouse, e case di quattro topi per gabbia. Passare cibo da chow normale ad una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Consentire topi per acclimatarsi alle nuove abitazioni e cibo. Eseguire il trattamento CFIR a 5,5 settimane di vita. Trasporti sottopone alla sala operatoria che contiene la piattaforma radiologica. Ridurre al minimo i livelli di stress durante il trasferimento. Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Quindi, aggiungere un singolo mouse nella camera. In parallelo, preparare rilievo di riscaldamento (livello basso) per il post-trattamento.
  2. Una volta mouse è sotto e non risponde alla compressione piede-pad, portare il soggetto alla piattaforma radiologica e posizionare sul letto immobilizzazione della fase robotico. Posizionare la bocca del soggetto in anestesia tazza naso-cone, e denti nella guardia morso (Figura 1D). Posare il mouse sul letto immobilizzazione e verificare se continua a mantenere insensibilità. Se è così, il nastro fino mouse sul letto con nastro garza. Mentre taping giù il mouse per il letto, Assicurarsi che la testa è livellato ad un piano orizzontale. Questo può essere determinato tirando le orecchie e vedere se sono livellate. Una volta che il mouse è nella posizione corretta, chiudere lo scudo protettivo di piombo.
  3. Acquisire la scansione del computer-tomografia utilizzando il software a bordo della piattaforma radiologica dello sperimentatore (questo sarà diverso tra le piattaforme), che fornirà un tridimensionale anatomico scansione strutturale del soggetto mouse. Controllare per vedere se la testa del mouse è livellata al piano orizzontale. In caso contrario, ripetere i passaggi 1,2-1,3 fino a quando la testa del soggetto è livellato.
  4. Identificare ROI per immagine TC. Calcolo della distanza da ROI alla superficie del cranio con un angolo di 45 ° rispetto al piano orizzontale, come mostrato nella Figura 3E.
  5. Utilizzo del software di bordo, prendere una radiografia del soggetto mouse da sopra, come mostrato in Figura 4A. Quindi, rimuovere il mouse dalla piattaforma radiologica, messo in rilievo di riscaldamento, e monitorare fino attiva.
  6. Dalle immagini CT coronali, calcolare la profondità media ROI anatomica di almeno tre topi per determinare consegna dosaggio. Come esempio di un precedente studio 2 dove 10 Gy di irradiazione è stato somministrato all'ipotalamo ventrobasal, la profondità della ROI dal cranio (da un angolo di 45 °) è 0,66 centimetri (vedere Figura 3E). Sapendo che, i ricercatori hanno utilizzato il software di pianificazione dose (DPS) installato sulla loro piattaforma radiologica per calcolare la velocità di rotazione e della lunghezza del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato al ROI.
  7. Dopo aver determinato la durata del trattamento e velocità di rotazione della fase robotico con il software dose-pianificazione, misurare distribuzioni di dose dei parametri calcolati con pellicole sensibili alle radiazioni GAFchromic incorporati in una plastica modello mock-topo equivalente-acqua. Per fare questo, inserire tre film sensibili alle radiazioni GAFchromic tra quattro impilati verticalmente equivalente in acqua blocchi di plastica da 29mostrato nella Figura 4B.
  8. Posizionare il modello finto topo contenenti film GAFchromic sul palco robotica, ed eseguire il fascio di irradiazione focale con i nuovi parametri calcolati. Ad esempio, per indirizzare la ventrobasal ipotalamo, inserire i parametri da 0,15 mm Filtro Cu, 225 kVp, 13 mA, 1-mm impostazione radiazioni diametro del fascio, 45 ° a portale, 1,3 ° / sec rotazione e 4,6 min per ottenere un ROI la dose radiologica di 10 Gy.
  9. A seguito di irradiazione, controllare film per modello e l'intensità della dose di radiazioni. Per un angolo di rotazione di 360 ° con i parametri elencati di indirizzare l'ipotalamo ventrobasal, un anello scuro nella pellicola sopra all'isocentro un piccolo punto croccante alla pellicola isocentro, e un anello leggero nel film sotto la isocentro corrispondente al cono- somministrazione fascio di irradiazione sarà osservato (Figura 4B).
  10. Sovrapporre isocentro pellicola GAFchromic sulle radiografie di soggetti topo da cui i parametri sono stati calcalcolato. Il punto focale irradiato di isocentro dovrebbe sovrapporsi con la regione ROI desiderato come mostrato in figura 4C.

Metodo alternativo: se difficoltà di mirare ROI cervello persiste, utilizzare contrasto iodato iniettato intratecale per migliorare la visualizzazione dei ventricoli in immagini CT. Per brevità, questa procedura è lasciato fuori di questo protocollo, ma viene descritto in precedenza 35, 50. Contrasto iodato fornirà punti di riferimento ventricolari supplementari (Figura 5A).

2. Determinare l'accuratezza di irradiazione del fascio

Ulteriore conferma CFIR precisione fascio per la visualizzazione diretta del fascio di radiazioni nel tessuto 2, 35, 51. Per fare questo, eseguire immunoistochimica per rilevare γH2AX 51, una proteina istone e un marker precoce di DNA a doppio filamento si rompe. Soggetti mouse deve essere transcardiaca perfusi e fissati entro un'ora di irradiazione. A seguito di irraggiamentoation, riparazione del DNA rapidamente ne deriva, e livelli di ΥH2Ax diminuiscono in modo significativo 35.

  1. Ripetere i passaggi 1,1-1,3.
  2. Dopo che il bersaglio è identificato CT, il soggetto mouse viene spostato sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Parametri calcolati ingresso (velocità di rotazione e durata del trattamento per raggiungere il dosaggio desiderato) dal punto 1.6 nel software dose di pianificazione e iniziare il trattamento. Il trattamento è fornito con il cavalletto puntato a 45 ° rispetto alla verticale mentre il mouse ruota attorno ad un asse verticale orientato.
  3. A seguito di irradiazione, eseguire perfusione transcardial su argomenti mouse. Eseguire perfusione entro un'ora 52. A seguito di cervelli perfusione, l'immersione fissi nel 4% PFA / PBS e rock delicatamente notte a 4 ° C.
  4. La mattina seguente, lavare 5 min in PBS 3x per rimuovere paraformaldeide fissativo. Poi, immergere in 30% saccarosio in PBS 1x su un agitatore a 4 ° C.
  5. Agitare delicatamente a 4 ° C (usmanualmente 12-16 ore), fino al cervello affonda al fondo della provetta. Questo serve come un passo crioprotezione. Una volta che il cervello lavello, rimuovere il cervello con un cucchiaio forato per evitare che l'eccesso del 30% sucrose/1x trasferimento PBS. Rapidamente incorporare nel congelamento di media in ghiaccio secco. Agitare medie congelamento con puntale e allineare cervello in stampi in plastica.
  6. Una volta completamente congelato, trasferire i blocchi del cervello a -20 ° C per una conservazione.
  7. Il giorno in cui verrà effettuata l'immunoistochimica, sezione coronale a 40 micron di spessore, e galleggiare in una piastra a 24 pozzetti contenenti PBS con un pennello sottile. Le sezioni devono essere conservati in modo seriale corretto per immunoistochimica per determinare la copertura irradiazione della regione di destinazione.
  8. Preriscaldare 0,01 M soluzione di citrato di sodio a 80 ° C a bagnomaria in preparazione per il passaggio recupero dell'antigene. Contemporaneamente, mentre il citrato di sodio si sta riscaldando, eseguire 5 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS.
  9. Una soluzione di citrato di sodio è a 80 ° C, immergere sezioni di cervello in la soluzione tampone di citrato di sodio. Lasciare in bagno d'acqua a 80 ° C per 1 ora.
  10. Smontare la parte e lasciare soluzione di citrato di sodio a temperatura ambiente, quindi eseguire tre lavaggi di 5 minuti in 0,01 M PBS.
  11. Bloccare sezioni di cervello per 1 ora in PBS-Triton contenenti siero di capra normale al 5%.
  12. Incubare le sezioni cerebrali overnight nella PBS-Triton contenenti siero di capra normale 5% con 1:700 concentrazione di topo anticorpo primario anti-fosfo-H2AX a 4 ° C.
  13. Il giorno dopo, eseguono 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  14. Incubare le sezioni cerebrali PBS-Triton contenente 5% di siero di capra normale di capra anti-topo anticorpo secondario coniugato con 488 nm fluorphore a 1:500 concentrazione per 2 h.
  15. Eseguire 15 min lavaggi 3x in 0,01 M PBS-Triton.
  16. Esegui 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia (1:5.000 in PBS) per 10 min per visualizzare nucleo. Poi, lavare sezioni di cervello per 5 minuti con PBS.
  17. Montare su elettrostaticamente chmicroscopio arged scivola dalla sezione galleggianti in PBS. Pulire l'eccesso di PBS e lasciare i vetrini si asciughino. Coprioggetti i vetrini con mezzo di montaggio e permettono i vetrini si asciughino al buio a temperatura ambiente per una notte.
  18. Scatta foto di sezioni coronali seriali con microscopio a fluorescenza. ΥH2Ax immunostaining (verde) indica sito di irradiazione. DAPI (blu) è un colorante nucleare (Figura 5B).

3. Preparazione del mouse Soggetti di irradiazione focale

Esaminare i risultati di immunoistochimica ΥH2Ax. Una volta soddisfatti con la calibrazione e la destinazione del fascio di irradiazione, procedere con l'esperimento. A questo punto, il tempo totale necessario per trattare un mouse (da impostazione animale a completamento di consegna fascio) è di circa 10-15 minuti per un trattamento di 10 Gy con un raggio di 1 mm.

  1. Ordina quattro settimane di età topi C57BL6 / J femminile dai laboratori Jackson Mouse. Casa di quattro topi per gabbia, e passare il cibo da chow normalea una dieta ricca di grassi a cinque settimane di vita. Topi orecchio pugno per dare loro segni di riconoscimento unici. Monitorare la salute dei topi al giorno. Nota: marcatori metallici non possono essere utilizzati come essi rappresentino striature artefatti sul CT.
  2. Pesare i topi il giorno prima del trattamento con radiazioni o sham. Topi suddivisi in due coorti per le radiazioni o il trattamento sham e garantire che non vi è alcuna differenza significativa nel peso tra coorti. Il giorno di trattamento, quando i topi sono sei settimane di vita, si ripesa tutti i topi e registrare la loro massa. Trasportare delicatamente entrambe le coorti alla piattaforma radiologica. Fate attenzione a ridurre al minimo i livelli di stress.
  3. Preparare isoflurane camera di anestesia gassosa. Anestetizzare due topi, uno nel gruppo irradiazione predeterminato, e un altro nel gruppo di controllo sham. Preparare rilievo di riscaldamento impostata sul basso per il trattamento post-operatorio.
  4. Seguire i passaggi 1,2-1,4 per il mouse a ricevere irradiazione. Per il topo finto, tenere il mouse in camera di anestesia mentre il trattamento è in corso. Fai sure che la camera di anestesia si trova vicino alla piattaforma CFIR così eventuali effetti sulle radiazioni ambientali sono presi in Dopo il bersaglio viene identificato in CT, spostare il mouse soggetto sotto controllo robotico per allineare questo obiettivo con il fascio di radiazioni di consegna. Ingresso parametri (velocità di rotazione e durata del trattamento) calcolato nel software dose-pianificazione.
  5. Una volta che il trattamento di irradiazione è completo, di ritorno sia sham e topi irradiati al pad di riscaldamento, e monitorare fino a quando si svegliano.
  6. Rientro sia sham e topi irradiati per stabulario. Controllare ogni giorno. Pesare il mouse ogni metà settimana. Per confermare irradiazione di mirati zona proliferativa ipotalamica, somministrare iniezioni intraperitoneali di BrdU (50 mg / kg), tre giorni dopo il trattamento ed esaminare neurogenesi tra i gruppi per colabeling di immunoistochimica per BrdU e un marcatore neuronale un mese dopo l'esposizione iniziale BrdU (Figura 6) 2.

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Risultati

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Dichiarazioni

JW ha un finanziamento della ricerca e consultazione accordi con Xstrahl, Inc.

Ringraziamenti

Ringraziamo C. Montojo, J. Reyes, e M. Armour per la consulenza e assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health di sovvenzione F31 NS063550 (a DAL), un Premio Basilio O'Connor Starter Scholar e sovvenzioni del Fondo Klingenstein e NARSAD (a SB). SB è un WM Keck Distinguished giovane studioso nella ricerca medica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piattaforma di ricerca SARRPXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP bunker di irradiazioneXstrahlOpzionale, ma l'esposizione alle radiazioni deve essere contenuta con una schermatura alternativa al piombo
GAF film cromicoIPSGAFchromic ETB2
Topo fantasmaGammex457Acquistate da Gammex lastre d'acqua solide di 0,5 cm x 30 cm x 30 cm e tagliatele nella misura desiderata.
Anticorpo anti-fosfo-istone H2AX Ser139 di topoMillipore, Inc.05-636clone JBW301
Dieta per roditori ad alto contenuto di grassiDiete di ricercaD12492i60% delle calorie sotto forma di grassi, il cibo deve essere irradiato
IsofluranoBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0,01 M Citrato di sodioFisher Scientific1,471 g di citrato di sodio sciolto in 500 ml di acqua deionizzata
Superfrost Plus vetriniFisher Scientific12-550-15
DAPIFisher Scientificcontrocolorante nucleare
Mezzo di montaggioFisher ScientificVectashield o Gelvatol è preferibile

Riferimenti

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