Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

Sommario

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Abstract

WRN l'esonucleasi è coinvolta nella risoluzione del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA o in seguito all'esposizione a genotossine endogene o esogene. È probabile che svolga un ruolo nella prevenzione dell'accumulo di intermedi ricombinogenici che altrimenti si accumulerebbero alle forcelle di replicazione transitoriamente bloccate, coerentemente con un fenotipo iper-ricombinante di cellule prive di WRN. Nell'uomo, il dominio esonucleasico comprende una porzione N-terminale di una proteina molto più grande che possiede anche attività elicasica, insieme a siti aggiuntivi importanti per l'interazione tra DNA e proteine. Al contrario, in Drosophila, l'attività esonucleasica di WRN (DmWRNexo) è codificata da un locus genetico distinto dalla presunta elicasi, consentendo la dissezione biochimica (e genetica) del ruolo dell'attività esonucleasica nei meccanismi di stabilità del genoma. Qui, dimostriamo un metodo fluorescente per determinare l'attività dell'esonucleasi WRN utilizzando DmWRNexo ricombinante purificato e oligonucleotidi fluorescenti marcati all'estremità. Questo sistema consente una maggiore riproducibilità rispetto ai saggi radioattivi, poiché gli oligonucleotidi del substrato rimangono stabili per mesi, e fornisce un metodo più sicuro e relativamente rapido per l'analisi dettagliata dell'attività della nucleasi, consentendo di determinare la polarità, la processività e le preferenze del substrato della nucleasi.

Introduzione

Le nucleasi svolgono un ruolo vitale nelle cellule nella rimozione del DNA danneggiato, nella risoluzione di strutture non duplex come le giunzioni di Holliday e nel fornire capacità di correzione delle bozze durante la replicazione del DNA, sia intrinseca all'interno delle DNA polimerasi che estrinseca ad esse¹. Le nucleasi possono agire degradando sequenzialmente il DNA dalle estremità libere (esonucleasi) o scindendo i legami fosfodiestere interni all'interno di una molecola di DNA più lunga (endonucleasi). La perdita dell'attività della nucleasi può provocare fenotipi di instabilità del genoma altamente specifici. Mentre la mutazione del membro della famiglia dell'elicasi RecQ BLM provoca tassi eccessivamente elevati di scambio di cromatidi fratelli e tassi di cancro elevati a livello globale (rivisto da Payne e Hickson²), la mutazione della proteina WRN altamente correlata porta all'invecchiamento precoce³; la principale differenza significativa tra questi due membri della famiglia è la presenza di un dominio esonucleasico 3'-5' con in WRN⁴. L'evidenza di un ruolo critico dell'esonucleasi WRN nel mantenimento della stabilità del genoma si è accumulata dall'analisi dei genotipi nei pazienti con WS⁵, insieme a studi di mutazione puntiforme e delezioni in cellule umane, supportati da studi cristallografici del dominio esonucleasico^{isolato 6}. Tuttavia, la cooperazione e il dialogo incrociato tra l'attività esonucleasica di WRN e la sua attività centrale dell'elicasi⁷ rendono difficile separare la funzionalità di ciascuna e i loro contributi relativi alla stabilità del genoma. Nelle piante e negli animali con metazoi inferiori, l'attività esonucleasica WRN è presente su un singolo polipeptide privo di attività elicasica^8-10 (rivisto in Cox e Boubriak¹¹); è stato dimostrato biochimicamente in Arabidopsis che questa esonucleasi agisce in modo coordinato con l'affine, WRN elicasi, ricostituendo efficacemente le attività enzimatiche combinate osservate nel vertebrato WRN⁹. Abbiamo studiato l'esonucleasi WRN in Drosophila poiché gli eccellenti strumenti genetici consentono l'analisi dell'impatto della mutazione dell'esonucleasi (senza influire sulla presunta elicasi affine) a livello dell'intero organismo e attraverso lo sviluppo^10,12. Inoltre, abbiamo clonato, espresso e purificato l'esonucleasi ricombinante Drosophila WRN (DmWRNexo) consentendo un'analisi biochimica completa delle sue proprietà enzimatiche^13,14.

L'analisi della nucleasi in vitro è stata tradizionalmente condotta utilizzando oligonucleotidi radiomarcati, valutando la degradazione cercando il laddering dei prodotti su gel di acrilammide^4,8,15. Sebbene sensibili, tali saggi non sono riproducibili quantitativamente giorno per giorno a causa del decadimento radioattivo dei substrati marcati. Inoltre, la manipolazione e lo smaltimento dei reagenti radioattivi pongono notevoli problemi ambientali e sanitari; Anche l'approvvigionamento di radiolabel sta diventando sempre più problematico. Un metodo alternativo recente valuta la quantità del prodotto di degradazione finale mediante spettrometria di massa¹⁶. Tuttavia, richiede molto tempo (richiede diversi giorni), richiede attrezzature specializzate e la lettura è la quantità di prodotto finale (singolo nucleotide), quindi non è adatta per la misurazione sensibile di aspetti come la processività enzimatica o per determinare se alcuni nucleotidi, sequenze o modifiche portano alla pausa o all'arresto della nucleasi. Per superare questi problemi, abbiamo adattato i tradizionali saggi basati su gel per l'uso con substrati oligonucleotidici fluorescenti, generando substrati stabilmente marcati che possono essere utilizzati in modo riproducibile per lunghi periodi di tempo e quindi consentono il confronto diretto delle attività nucleasici in diverse condizioni.

Protocollo

1. Preparazione di oligonucleotidi di substrato

1. Sintetizzare oligonucleotidi personalizzati.
   1. Progettare un oligonucleotide a filamento singolo con una molecola di fluoresceina coniugata 5'; questa sarà la spina dorsale per ogni substrato. (Si noti che questo è per un'esonucleasi 3'-5'; per un'esonucleasi con polarità 5'-3' utilizzare un filamento dorsale coniugato 3'). Se la polarità non è nota, è necessario testare sia 3' che 5'
   .
   2. Progettare filamenti complementari in modo tale che, una volta ricotti all'oligonucleotide marcato in fluorescenza, si formino i substrati duplex di scelta. Si noti che il filamento complementare non è coniugato a un fluoroforo. Al momento dell'ordine, specificare PAGE-purification (la desalinizzazione non è sufficiente).
   3. Conservare le scorte di oligonucleotidi tamponate in 10 mM a 1 nmol/μl a -20 °C e al buio.
2. Mescolare l'oligonucleotide marcato con ogni oligonucleotide complementare non marcato in un rapporto molare 1:1,2 di marcato:non marcato in tampone (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM NaCl). (Nota: un rapporto 1:1 è più desiderabile, ma è più importante che TUTTO il filo etichettato sia legato. I rapporti di 1:1 - 1:1,5 possono funzionare.)
3. Riscaldare un bagnomaria o un blocco di calore a 95 °C e immergervi la miscela di ricottura per 3 minuti, quindi spegnere e lasciare raffreddare il tutto lentamente (1 °C/min) a meno di 30 °C.
4. Controllare la ricottura completa dell'oligonucleotide marcato eseguendo il substrato duplex risultante su un gel nativo di poliacrilammide al 10% (10% 19:1 acrilammide:bis-acrilammide in 1x Tris-Borato-EDTA (TBE, 89 mM Tris base, 89 mM acido borico, 2 mM EDTA) polimerizzato con 0,05% p/v di persolfato di ammonio (APS) e 0,005% v/v TEMED). Visualizzazione tramite PhosphorImager (vedere la sezione 5 di seguito).

2. Preparazione dei gel di acrilammide

1. Configura il sistema di colata del gel, ad esempio il rig di gel Hoefer SE400 con piastre da 16 cm x 18 cm e distanziatori da 1,5 mm.
   1. Pulire accuratamente le lastre di vetro e i distanziatori con detersivo e acqua. Indossare guanti puliti per evitare di sporcare nuovamente le piastre con l'olio delle dita, che ostacolerebbe la formazione costante del gel.
   2. Sciacquare le piastre con abbondante acqua distillata (deionizzata) per rimuovere i residui di detersivo, quindi strofinare con un fazzoletto privo di lanugine (ad es. Kimwipes).
   3. Infine, spruzzare con etanolo al 70% e strofinare: le lastre di vetro dovrebbero cigolare se sono pulite. Mettere da parte in posizione verticale per consentire l'evaporazione dell'ultimo etanolo.
   4. Pulire il resto dell'attrezzatura per la formatura del gel con acqua distillata (utilizzare prima il detersivo se necessario) e asciugare.
   5. Assemblare le lastre di vetro e i distanziatori nel banco di formazione del gel, assicurandosi che il sistema sia a tenuta stagna.
2. Preparare la soluzione in gel alla percentuale di poliacrilammide desiderata
   1. Per il dosaggio della nucleasi, utilizzare gel di poliacrilammide denaturanti al 14% con urea 8 M in 1x TBE.
   2. Per fare 100 ml (sufficienti per 2 gel con abbondante eccesso per perdite) prendere 48,05 g di urea in un becher largo e aggiungere 35 ml di soluzione di acrilammide 19:1 al 40% e 10 ml di TBE 10x (890 mM Tris, 890 mM di acido borico, 20 mM EDTA, pH 8,3 con NaOH). ATTENZIONE: Indossa i guanti: l'acrilammide è una potente neurotossina. Sciogliere l'urea utilizzando un'ancoretta e una piastra di agitazione magnetica (l'operazione richiederà un po' di tempo).
   3. Una volta sciolto, aggiungere acqua deionizzata milliQ a 100 ml. Sterilizzare con filtro utilizzando una membrana da 0,22 μm. Se non deve essere utilizzato immediatamente, degassare brevemente utilizzando l'attrezzatura di aspirazione e conservare al buio (si conserva qualche giorno). Non conservare in frigorifero poiché l'urea precipiterà.
3. Polimerizzare e fondere il gel.
   1. Assumere l'urea-acrilammide e aggiungere 0,5 ml di persolfato di ammonio (APS, 10% p/v) e 50 μl di TEMED. Agitare lentamente il contenitore per mescolare senza far uscire aria (che inibirà la polimerizzazione) e versare nel gelformatore. Agire rapidamente o il gel potrebbe indurirsi prima che il versamento sia terminato.
   2. Aggiungere il pettine appropriato per formare pozzetti per il caricamento del campione (scelto in base al gel rig e al numero di campioni da analizzare, ad es. i pettini a 15 o 29 denti sono adatti per l'uso con il gel rig Hoefer). Verificare che non si introducano bolle d'aria sotto i denti del pettine.
   3. Lasciare solidificare. Monitorare la presenza di perdite. La polimerizzazione completa è ritardata ai favi a causa del contatto con l'atmosfera. Quando i pozzetti saranno solidi, il resto del gel sarà solidificato.
   4. Rimuovere i pettini e sciacquare l'acrilammide non polimerizzata con acqua e una pipetta.
4. Prepara il gel per la corsa.
   1. Posizionare il gel colato nel sistema di scorrimento del gel e aggiungere la quantità appropriata di 1x tampone di corsa TBE nella camera inferiore e nei pozzetti del gel. Il gel è ora pronto per essere caricato.

3. Preparazione della proteina DmWRNexo ricombinante con tag His-taged

1. Espressione batterica della proteina DmWRNexo
   1. Utilizzando un circuito di inoculazione, raccogliere i batteri raschiando sulla superficie delle scorte di glicerolo mantenute a -80 °C (i batteri sono E. coli T7 Iq LysY (NEB) trasformato con pIVEX2.3d-DmWRNexo). Applicare su piastre di LB-agar (10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 15 g di agar fino a 1 L con acqua distillata e pH regolato a 7,4) con 50 μg/ml di ampicillina. Incubare capovolto per una notte a 37 °C.
   2. Prelevare una singola colonia dalla piastra in 50 ml di LB (10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl fino a 1 L con acqua distillata) integrati con 50 μg/ml di ampicillina (composta in acqua e sterilizzata con filtro a 0,22 μm). Coltivare agitando a 220 giri/min 37 °C durante la notte.
   3. Inoculare 1,8 L (aliquote di 600 ml ciascuna in tre palloni conici da 2 L per garantire un'adeguata aerazione) di LB-ampicillina con la coltura notturna da 50 ml e crescere fino a OD₆₀₀ ~ 0,8. Aggiungere IPTG a una concentrazione finale di 0,7 mM e incubare a 26 °C (per prevenire l'aggregazione proteica) agitando per 4-8 ore.
   4. Raccogliere il pellet cellulare mediante centrifugazione a 8.000 giri/min a 4 °C per 10 minuti - utilizzare 6 flaconi da centrifuga in plastica sterile da 500 ml con 300 ml di sospensione cellulare ciascuno. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un piccolo volume (10 ml) dell'LB-amp originale, trasferirlo in una provetta Falcon da 15 ml e poi girare nuovamente a 5.000 giri/min per pellettare le celle - rimuovere nuovamente il surnatante e congelare a -80 °C (questo aiuta con la lisi).
2. Lisi cellulare batterica
   1. Preparare 3,2 ml di tampone di lisi contenente 1 ml di NaCl 5 M, 1 ml di DTT 1 M, 200 μl di benzammidina 1 M e 1 ml di lisozima 10 mg/ml (risospeso in acqua distillata).
   2. Ad ogni pellet derivato da 300 ml di sospensione batterica, aggiungere 320 μl di tampone di lisi. Risospendere il più possibile: utilizzare un puntale p1000 "segato" e mescolare, oltre a pipettare su e giù. Incubare su ghiaccio 20 min. Aggiungere altri 100 μl di tampone di lisi e mescolare bene, quindi trasferire il più possibile del lisato risospeso in una provetta per microfughe (sarà molto viscosa e difficile da pipettare).
   3. Centrifugare il lisato a 14.000 giri/min in un rotore microfuge preraffreddato a 4 °C per 30 min, quindi portare il surnatante in una provetta microfuge pulita: questa contiene la proteina ricombinante.
3. Purificazione della trappola di His
   1. Preparazione dei reagenti: Etichettare 5 provette per microfugo per ciascuna delle seguenti concentrazioni di imidazolo: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM e 500 mM (ad es. etichetta 40-1, 40-2, 40-3, ecc.), che verranno utilizzate per raccogliere le frazioni della colonna. Conservare i tubi con ghiaccio in una griglia con i coperchi aperti (ma coprire senza stringere con pellicola trasparente o simili per mantenerli puliti mentre si prepara tutto il resto). Preparare 25 ml di 20 mM di imidazolo e 10 ml di stock di ciascuna delle altre concentrazioni di imidazolo in provette universali da 25 ml, utilizzando 1x PBS (8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄, 0,24 g di KH₂PO₄, pH aggiustato a 7,4 e portato a 1 L con acqua distillata) come diluente.
   2. Regolare il lisato batterico a 20 mM di imidazolo utilizzando un volume appropriato di soluzione madre di 2 M di imidazolo e regolare il volume ad almeno 1 ml (<5 ml) utilizzando 20 mM di imidazolo.
   3. Lavare una colonna His-Trap da 1 ml (Amersham) con 10 ml di acqua MilliQ utilizzando una siringa da 5 o 10 ml con Luer lock e leggera pressione manuale, quindi equilibrare la colonna facendo passare 10 ml di 20 mM di imidazolo composto in PBS (vedere il passaggio 3.3.1 sopra).
   4. Caricare il lisato sulla colonna. Quando il lisato viene caricato sulla colonna, si può verificare una significativa contropressione; Questo è perfettamente normale. Non essere tentato di applicare troppa forza alla siringa e mantenere una pressione costante e uniforme. È normale vedere un lieve cambiamento di colore quando il lisato entra nella colonna. Raccogliere il flusso in un flacone Sterilin bijou (capacità 7 ml) e conservare in ghiaccio.
   5. Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM di imidazolo e raccoglierla in un tubo universale da 25 ml su ghiaccio, etichettato come "lavaggio".
   6. Far passare 5 ml di 40 mM di imidazolo attraverso la colonna, raccogliendo 1 ml di frazioni in ciascuna delle provette per microfuge (etichettate 40.1, 40.2, 40.3, ecc.): osservare attentamente lo stantuffo della siringa in quanto ciò consente la misurazione di 1 ml.
   7. Ora passare in sequenza 5 ml di ciascuno di 60 mM, 100 mM, 300 mM e 500 mM di imidazolo, raccogliendo nuovamente 5 frazioni da 1 ml ad ogni concentrazione di sale.
4. Analisi delle frazioni di colonna
   1. Dot blot: Dotare 2 μl di ogni frazione di colonna (e anche caricare, fluire e lavare) su un foglio di nitrocellulosa - è più facile se questo è preregolato con una griglia usando una matita morbida). Lasciare asciugare all'aria. Elaborare il dot blot bloccando per 15 minuti a 1 ora di temperatura ambiente in latte in polvere scremato al 5% composto da PBS con 0,2% v/v Tween 20, quindi lavare in PBS-Tween più volte e incubare con anticorpo HRP-anti-his diluito 1:500 in PBS-Tween per 30-60 minuti. Lavare a fondo con PBS-Tween e poi con PBS e rilevare gli anticorpi legati utilizzando la chemiluminescenza potenziata (ECL), visualizzata su Hyperfilm MP. Questo dot blot fornisce un'idea eccellente delle frazioni di picco prima dell'analisi SDS-PAGE e può informare le successive fasi di purificazione, se necessario (ad esempio, se la stabilità delle proteine è un problema, è possibile raggruppare le frazioni di picco in base ai risultati del dot blot e caricarle direttamente sulle colonne di filtrazione su gel - vedere il passaggio 3.5 di seguito).
   2. SDS-PAGE: Raccogliere 50 μl di ciascuna frazione di colonna in una provetta per microfuge marcata contenente 50 μl di coloranti di caricamento 2x SDS-PAGE (4% p/v SDS, 20% v/v glicerolo, 120 mM Tris-HCl pH 6.8 con 200 mM DTT). Far bollire questi campioni per 5 minuti a 95-100 °C (notare che se si utilizza un blocco caldo senza coperchio riscaldato, praticare un piccolo foro nel coperchio di ciascuna provetta con un ago per siringa di calibro ridotto per evitare che le provette "esplodano" mentre si riscaldano). Eseguire minigel SDS-PAGE al 10% caricando 10 μl di ciascuna frazione di colonna e colorare con blu brillante Coomassie per verificare le frazioni di picco e la % di purezza della proteina. Se necessario, è anche possibile effettuare il western blot per la proteina marcata con his-tagging trasferendo le proteine separate da SDS-PAGE su nitrocellulosa; bloccare le membrane con il 5% di latte scremato in PBS-0,2% Tween 20, quindi lavare e sondare con anticorpi anti-his coniugati HRP (1:500) come per il dot blot.
5. Per aumentare la purezza, le frazioni di picco della colonna his-trap possono essere raggruppate e caricate su una colonna di filtrazione su gel Superdex 75 con eluizione in sale crescente (come precedentemente descritto Boubriak et al.¹³ e Mason et al. ¹⁴).

4. Saggio della nucleasi

1. Realizzare scorte di lavoro di substrati.
   1. Utilizzare 20 pmol di substrato per reazione (anche se questo può essere variato a seconda della domanda da affrontare) in modo che una quantità di lavoro conveniente sia di 200 pmol/μl (cioè 10x). Le scorte di lavoro sono costituite in piccoli volumi di tampone di ricottura (10 mM Tris-HCl pH7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl) o in 10 mM Tris-HCl pH 7.0 (fino a pH 8.5, secondo la nucleasi) senza sale o EDTA, a seconda della sensibilità enzimatica o del saggio da eseguire.
   2. Conservare a 4 °C e al buio (avvolto in un foglio). I substrati durano per molte settimane senza perdita di integrità duplex o di segnale fluorescente.
2. Dosaggio della concentrazione di proteine esonucleasi mediante analisi colorimetrica o spettrometria UV ad Abs₂₆₀.
   1. Conservare in piccole aliquote a -80 °C.
   2. Se i campioni vengono congelati/scongelati una volta, ipotizzare un tasso di misfold proteico del 5% (o definire empiricamente per ciascuna proteina da analizzare) e regolare le concentrazioni di conseguenza.
   3. Scartare le proteine per il test dell'attività dell'esonucleasi dopo due cicli di congelamento/scongelamento e annotare lo stato delle proteine per ogni esperimento.
3. Progettare, sperimentare e calcolare le quantità di master mix (MM) per i campioni.
   1. Realizzare un MM contenente tutti i componenti comuni ai campioni da testare (di solito tutto tranne l'enzima o il substrato) per diminuire la variazione tra i campioni.
   2. Tenere conto degli errori di pipettaggio durante la composizione dell'MM, ad esempio calcolare i volumi per N campioni rendendone sufficiente per (N + 0,1N) campioni.
   3. Impostare le reazioni in un volume totale di 20 μl/campione, contenente 1 pmol di enzima e 20 pmol di substrato (come impostazione predefinita prima dell'ottimizzazione - ovviamente le quantità variano a seconda di ciò che viene testato, ad esempio alterare la quantità di enzima se si verifica l'effetto della concentrazione dell'enzima). Per DmWRNexo, il tampone ottimale per l'attività della nucleasi è risultato empiricamente contenere 40 mM di Tris-HCl pH 8,0, 4 mM di MgCl₂, 5 mM di ditiotreitolo, con 0,1 mg/ml di BSA di grado di biologia molecolare.
4. Imposta le reazioni.
   1. Conservare tutti i reagenti a 4 °C (secchiello del ghiaccio o criorack).
   2. Preparare la miscela master e aliquotare nel numero appropriato di provette sterili da 0,5 ml per microfughe, prive di DNasi. Includere un controllo senza enzimi per visualizzare il substrato iniziale (controllo non degradato).
   3. Impostare un blocco termico alla temperatura appropriata per l'attività dell'enzima (37 °C, con un punto temporale finale di 30 minuti era ottimale per DmWRNexo, anche se potrebbe essere necessario determinarlo empiricamente confrontando l'attività dell'enzima scelto in un intervallo di temperature e tempi). I potenziali inibitori enzimatici comunemente presenti nei tamponi devono essere attentamente testati (ad esempio, l'EDTA inibisce DmWRNexo, così come l'eccesso di ATP¹⁴, presumibilmente attraverso la chelazione del Mg²⁺ critico per l'attività della nucleasi). Si noti che anche alte concentrazioni di imidazolo (>300 mM) non hanno alcun impatto sull'attività dell'enzima DmWRNexo né estinguono la fluorescenza.
   4. Soluzione Make up STOP (80% formammide, 1x TBE). Questo è a 3x. Questo può contenere coloranti come il blu di bromofenolo, se necessario. Negozio presso RT.
   5. Posizionare quanto segue vicino al blocco termico: il reagente o i reagenti finali da aggiungere alla miscela di reazione (solitamente enzima); un pipettatore e puntali da 1-10 μl, un timer, un criorack o un secchiello per il ghiaccio e una soluzione STOP.
5. Inizia la reazione.
   1. Impostare il timer in base all'aggiunta di enzima al primo tubo. Posizionare il tubo nel blocco termico.
   2. Continuare ad aggiungere l'enzima al resto delle provette a intervalli appropriati. (15 secondi sono sufficienti per reazioni semplici che richiedono solo la soluzione STOP per essere completate). Mettere in blocco di calore non appena è stato aggiunto l'enzima.
6. Ferma la reazione.
   1. Quando il timer raggiunge il tempo corretto (ad esempio 15 minuti), aggiungere 10 μl di soluzione STOP al primo campione e miscelare mediante pipettaggio. Mettere immediatamente sul ghiaccio/nella criorack.
   2. Continuare a fermare le reazioni agli intervalli di tempo appropriati e nello stesso ordine in cui sono state impostate, in modo che ogni reazione abbia avuto esattamente lo stesso tempo di incubazione.
7. I campioni sono ora pronti per essere caricati sul gel denaturante preparato.
   1. Caricare metà (o tutto) di ciascun campione utilizzando i puntali di caricamento del gel per un pipettaggio accurato. Ai livelli di oligonucleotide utilizzati nella reazione, metà della reazione darà un buon output per la visualizzazione e consentirà di eseguire una ripetizione (ad esempio se il gel iniziale non funziona correttamente).
   2. È conveniente caricare 1 soluzione STOP contenente colorante (ad es. blu di bromofenolo) in una o più corsie per accertare il funzionamento del gel.
   3. Oligonucleotidi fluorescenti di dimensioni note possono essere utilizzati insieme ai campioni come marcatore dimensionale.
8. Esegui il gel.
   1. Aggiungere la camera tampone di scorrimento superiore all'apparecchio in gel e riempirla con il tampone di corsa (1x TBE), assicurandosi che i campioni non vengano disturbati. Verificare la presenza di perdite dal tampone.
   2. Collegare il gel rig a un alimentatore e farlo funzionare a 200 V (tensione costante) per 150-200 minuti o fino a quando il colorante blu di bromofenolo (se utilizzato) si trova a circa due terzi del percorso nel gel (scorre intorno al livello di DNA di 10 nt in questa percentuale di gel). Monitorare la presenza di perdite di tampone, che possono inclinare o impedire la separazione.
   3. Interrompere il gel e rimuoverlo dall'apparecchio in funzione.

5. Analisi e imaging del gel

1. Determinare la sensibilità dell'imager da utilizzare, ad esempio il Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager è in grado di rilevare la fluorescenza della fluoresceina utilizzando un laser blu da 473 nm, utilizzando l'impostazione di sensibilità massima di F1000 e la lettura dei pixel più piccola (risoluzione) di 50 μm.
2. Scansiona il gel.
   1. Rimuovere con cura i distanziatori e una piastra in gel. Sciacquare accuratamente (ma con attenzione) il gel rimasto sull'altra lastra di gel per rimuovere le tracce di urea precipitata che altrimenti interferirebbero con la scansione.
   2. Posizionare la piastra (con il gel ancora attaccato) sulla superficie di vetro del supporto per gel e posizionarla nella termocamera. Notare le coordinate del gel sul bicchiere (se non riempie l'intera superficie).
   3. Aprire il software appropriato sul computer collegato ed eseguire la scansione della regione annotata dell'area di scansione in cui si trova il gel. Utilizzare le migliori condizioni determinate come al punto 5.1. Il file risultante sarà relativamente grande (diversi MB) ma l'immagine può essere ritagliata e compressa se necessario.
   4. Salvare, quindi esportare come file che può essere letto dal software di analisi, ad esempio esportare come .tiff per l'analisi utilizzando ImageJ.
3. Analizza i dati.
   1. Un saggio di esonucleasi riuscito causerà la degradazione del substrato in sequenza lungo l'oligonucleotide verso il fluoroforo, determinando un caratteristico modello a scala di frammenti di DNA fluorescenti sul gel. Le specie con maggiore mobilità sul gel (che corrono più lontano) sono più piccole del substrato di partenza non degradato e quindi rappresentano prodotti della degradazione dell'esonucleasi.
   2. Utilizzare lo strumento "Gels" in ImageJ per quantificare le intensità relative delle specie in ciascuna corsia a seconda della loro mobilità, al fine di determinare i livelli di degradazione e quindi l'attività esonucleasica in ciascun campione.

Risultati

L'analisi in vitro dell'attività esonucleasica richiede diverse fasi preparatorie oltre all'analisi vera e propria. Una panoramica delle procedure è mostrata nella Figura 1.

Prima di eseguire saggi di esonucleasi basati sulla fluorescenza, è fondamentale ottimizzare il rilevamento dell'oligonucleotide marcati fluorescentemente dopo la separazione su gel di urea-acrilamide, utilizzando un sistema di imaging fluorescente adeguato. La scelta del filtro è estremamente imp...

Discussione

La determinazione dell'attività esonucleasica delle proteine purificate richiede l'analisi dei prodotti di scissione del DNA. La scissione sequenziale del DNA da parte delle esonucleasi può essere visualizzata mediante la separazione dei prodotti di scissione marcati su gel di acrilammide. Storicamente ciò comportava la marcatura finale del substrato di DNA con un radiomarcatore (ad esempio ³²P o ³⁵S), ma con gli svantaggi inerenti all'uso del radiomarcatore (costo, problemi di sicurezza e ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagent/Material
Oligonucleotidi personalizzati	Eurogentec		È necessario ottenerli ad alta purezza es. con purificazione PAGE.
		5'FLO	fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Soluzione di acrilammide	Severn Biotech	20-2400-05	ATTENZIONE: potente neurotossina, quindi i guanti devono essere indossati sempre
Colonne His-Trap (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Tutti gli altri reagenti	di qualsiasi fornitore		È necessario un grado di biologia molecolare (privo di DNasi); allo stesso modo, le provette per microfugi devono essere prive
EquipmentHoefer SE400 apparecchio gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fosforo e fluorescenza
Fuji
Image Reader V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm

affidabile di DNasi e RNasi