I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.
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Articolo metodologico
Totale Estrazione di proteine e 2-D elettroforesi su gel Metodi per
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'indagine dei livelli di proteine intracellulari di specie batteriche è importante per comprendere i meccanismi patogenetici delle malattie causate da questi organismi. Qui si descrive un procedimento per l'estrazione di proteine da specie Burkholderia basato su lisi meccanica utilizzando perle di vetro in presenza di acido etilendiamminotetraacetico e fluoruro phenylmethylsulfonyl in tampone fosfato salino. Questo metodo può essere utilizzato per diverse specie di Burkholderia, per diverse condizioni di crescita, ed è probabile adatto per l'uso in studi di proteomica di altri batteri. Dopo l'estrazione di proteine, una bidimensionale (2-D) elettroforesi su gel tecnica proteomica è descritta per studiare i cambiamenti globali nei proteoma di questi organismi. Questo metodo consiste nella separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico mediante focalizzazione isoelettrica nella prima dimensione, seguita da separazione sulla base del peso molecolaremediante elettroforesi su gel di acrilammide nella seconda dimensione. Visualizzazione di proteine separate avviene tramite colorazione argentica.
Introduzione
Il Burkholderia genere comprende più di 62 specie, microrganismi Gram-negativi isolati da una vasta gamma di nicchie, ed è diviso in due gruppi principali 1,2. Il primo cluster comprende umana, animale e gli organismi phytotrophic, e la maggior parte degli studi si sono concentrati sulle specie patogene di questo gruppo a causa della loro importanza clinica. I membri più patogeni sono B. pseudomallei e B. mallei (che provoca rispettivamente melioidosi e morva) 3,4 e patogeni opportunisti (le 17 specie definite del complesso Burkholderia cepacia, BCC) 5, che causano la malattia della fibrosi cistica ....
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Protocollo
1. Crescita Cultura (Giorni 1 +2)
- Coltivare una coltura starter: 3 ml di Luria Bertani (LB) brodo in una provetta alto a scatto 15 ml, a 37 ° C durante la notte rotatori. Diluire la crescita durante la notte per un OD 600 di 0,6. Aggiungere 1 ml di questa diluizione a 100 ml di brodo LB in una beuta da 250 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 rpm per 16 ore in fase stazionaria (SP), per meglio approssimativa, in coltura batch, in condizioni di infezione e di assicurare che i fattori di virulenza batterici sotto il controllo del segnale di fase stazionaria fattori quali RPOs e quorum sensing, sono espressi. In alternativa, i batteri coltiva....
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Risultati
Analisi comparativa dei profili proteici estratti dalla stessa coltura batterica in due diverse occasioni ha mostrato modelli simili banding indicando estrazioni di proteine successo. Proteine di peso molecolare estratte andavano 10-150 kDa. Figura 1 mostra rappresentante Coomassie blu colorazione gel delle estrazioni proteina whole-cell da multivorans Burkholderia (membro della BCC) isolati clinici coltivati in LB o lievito / Manitol (YEM) brodo e raccolte da fase stazionaria.
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Discussione
Procedimento per la preparazione di proteine è stato descritto che può estrarre la maggior parte delle proteine Burkholderia con buona riproducibilità. Ciò è dimostrato ottenendo lo stesso profilo proteico da due preparazioni indipendenti eseguiti in giorni diversi utilizzando la stessa coltura batterica cresciuta in LB o YEM brodo come mostrato nella Figura 1. Estrazione era efficiente per i batteri coltivati in terreni liquidi, ma non abbiamo testato questo metodo per i batteri coltivat.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Università della British Columbia (a BV) e borse di Cystic Fibrosis Canada e Canadian Institutes of Health Research (a DPS). Ringraziamo Jacqueline Chung per la preparazione iniziale dei protocolli.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Fenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) | Sigma | P7626 | Tossico, corrosivo |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Tampone PBS infiammabile |
| Bioscience | R028 | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | di vetro tossiche | Fisher | BP118-500 |
| (0.1 | 11079101 | ||
| Provette per centrifuga Nalgene Oak Ridge, policarbonato (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| Kit per l'estrazione delle proteine MicroBCA | Pierce | 23235 | |
| Provette per microcentrifuga 2,0 ml Tubo conico con tappo a vite e O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| Kit di pulizia 2-D | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | CHAPS irritante |
| Amersham Biosciences | 17-1314-01 | ||
| Ditiotreitolo (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | |
| Irritante Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Molto tossico, cancerogeno |
| Persolfato di ammonio | Fisher | BP179-100 | Infiammabile, tossico, corrosivo |
| N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Infiammabile |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Fisher | BP166-500 | Tossicità acuta, infiammabile |
| Agarosio | Invitrogen | 15510-027 | |
| Etanolo | Fisher | HC1100-1GL | Infiammabile, tossico |
| Acido acetico | Fisher | A491-212 | Infiammabile, corrosivo |
| Glutaraldeide | Fisher | G151-1 | Molto tossico, corrosivo, pericoloso per l'ambiente |
| Tetrationato di potassio | Sigma | P2926 | Irritante |
| Acetato di sodio | EM Science | 7510 | |
| Nitrato d'argento | Sigma | 209139 | Corrosivo, pericoloso per l'ambiente |
| Formaldeide | Sigma | 252549 | |
| Tossico Tiosolfato di sodio | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glicina | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glicerolo | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Metanolo | Fisher | A412-4 | Infiammabile, tossico, pericoloso per la salute |
| Carbonato di sodio anidro | EMD | SX0400-3 | Olio |
| minerale | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 rotore per ultracentrifuga | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Sistema di messa a fuoco isoelettrica Ettan IPGphor II e accessori | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Sistema di elettroforesi verticale di grandi dimensioni | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
Riferimenti
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Commo....
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Ristampe e permessi
