Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali<em&gt; In Vitro</em&gt; È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale Modello

Sommario

Esecuzione di test di coltura cellulare per indagare adesione batterica e l'invasione in condizioni aerobiche è di solito non rappresentativo della In vivo Ambiente. Un modello di camera di diffusione verticale permette lo studio delle interazioni del patogeno umano Campylobacter jejuni Con le cellule epiteliali intestinali in più In vivo Condizioni simili, con conseguente maggiore invasione batterica.

Abstract

Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Abbiamo sviluppato un modello in vitro di infezione che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas. La camera di diffusione verticale (VDC) modello simula le condizioni nell'intestino umano, dove i batteri saranno in condizioni di tessuto, mentre molto basso di ossigeno sarà fornita con l'ossigeno dal flusso sanguigno. Posizionamento polarizzati cellulari (IEC) monostrati epiteliali intestinali cresciute in Snapwell inserisce in un VDC crea compartimenti apicale e basolaterale separati. Il vano basolaterale è riempito con mezzo di coltura cellulare, sigillato e perfusi con l'ossigeno wHilst compartimento apicale è pieno di brodo, tenute aperte e incubate in condizioni microaerobiche. Sia Caco-2 e T84 IECs possono essere mantenuti nel VDC in queste condizioni, senza apparenti effetti negativi sulla sopravvivenza delle cellule o l'integrità monostrato. Esperimenti Coculturing eseguiti con differenti C. jejuni ceppi wild-type e diverse linee IEC nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale riproducibile risultano in un incremento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche ^1. L'ambiente creato nel modello VDC imita più da vicino l'ambiente incontrate da C. jejuni nell'intestino umano e mette in evidenza l'importanza di esibirsi in saggi di infezione in vitro in condizioni che mimano più da vicino la realtà in vivo. Noi proponiamo che l'uso del modello VDC consentirà nuove interpretazioni delle interazioni scommettonoween batteri patogeni e cellule ospiti.

Introduzione

Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. L'uso di tali saggi di coltura cellulare, adesione batterica alle cellule ospiti, l'identificazione dei recettori della cellula ospite, cellula ospite vie di segnalazione e l'invasione batterica delle cellule ospiti sono stati tutti studiati in dettaglio, con conseguente molte importanti osservazioni. Tuttavia tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche che possono non essere rappresentativi della ambiente in vivo. Una limitazione importante di modelli in vitro u....

Protocollo

1. La crescita di monostrati IEC su speciali filtri 0,4 micron

1. Coltura cellule Caco-2 a modificate mezzi essenziali di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina e 1% (v / v) aminoacidi non essenziali in un standard di coltura tissutale incubatore a 37 ° C in 5% di CO ₂ e il 95% di aria. Seme di 4 x 10 ⁵ Caco-2 IECs per 0,4 micron filtro e crescono di polarizzazione di 21 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni.
2. Misurare la TEER per confermare lo stato di polarizzazione del monostrato utilizzando un misuratore di resistenza Volt-Ohm. Nei nostri st....

Risultati

Esperimenti Coculturing eseguite con il C. jejuni ceppo selvatico e IECs nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale hanno dimostrato un aumento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche in un momento maniera dipendente dalla ^1. Questa osservazione era riproducibile utilizzando due diversi C. jejuni ceppi wild-type (11168H e 81-176) e due linee IEC diversi (Caco-2 e T84), mettend.......

Discussione

L'uso di metodi di coltura cellulare in vitro per studiare le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti è una tecnica largamente impiegata in molti laboratori di ricerca. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Il ampiamente usato in modelli di infezione in vitro sono partico.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di diffusione verticale speciale per l'uso con inserti Snapwell	Apparecchio Harvard	66-0001	Collettore e sei camere Snapwell
Tappi Apparato	Harvard	66-0020
O-ring	Apparato Harvard	66-0007
Morsetti	Apparato Harvard	66-0012
Filtri Snapwell (dimensione dei pori 0,4 μ m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm spettrofotometro	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II	Biochrom	80-3003-72