Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura rapida e a basso consumo di materiale per l'integrazione di array extracromosomici transgenici nel genoma di Caenorhabditis elegans utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV). Inoltre, questo protocollo è particolarmente adatto per le linee transgeniche che trasmettono array extracromosomici ad alta velocità.

Abstract

Microiniettare DNA nel citoplasma della gonade sinciziale di Caenorhabditis elegans è la tecnica principale utilizzata per stabilire linee transgeniche che mostrano tassi di trasmissione parziali e variabili di array extracromosomici alla generazione successiva. Inoltre, gli animali transgenici sono a mosaico ed esprimono il transgene in un numero variabile di cellule. Gli array extracromosomici possono essere integrati nel genoma di C. elegans utilizzando l'irradiazione UV per stabilire ceppi transgenici non mosaici con un tasso di trasmissione del 100% del transgene. A tal fine, le progenie F1 di animali transgenici irradiati con raggi UV sono sottoposte a screening per animali portatori di un'integrazione eterozigote del transgene, che porta a un tasso di trasmissione mendeliana del 75% alla progenie F2. Una delle sfide di questo metodo è distinguere tra la percentuale di trasmissione transgenica in una popolazione prima (X% di animali transgenici) e dopo l'integrazione (≥75% di animali F2 transgenici). Pertanto, questo metodo richiede la scelta di una linea transgenica non integrata con una percentuale di animali transgenici significativamente inferiore alla segregazione mendeliana del 75%. Di conseguenza, le linee transgeniche non integrate con un tasso di trasmissione extracromosomico alla generazione successiva ≤60% sono solitamente preferite per l'integrazione e l'integrazione transgenica in ceppi altamente trasmissibili è difficile. Qui mostriamo che l'efficienza dell'integrazione degli array extracromosomici nel genoma è aumentata quando si utilizzano linee transgeniche altamente trasmittenti (≥80%). Il protocollo descritto consente una facile selezione di diverse linee indipendenti con integrazione omozigote del transgene nel genoma dopo l'irradiazione UV di vermi transgenici che mostrano un alto tasso di trasmissione di array extracromosomici. Inoltre, questo metodo è abbastanza veloce e richiede un basso consumo di materiale. La possibilità di generare rapidamente diverse linee che esprimono un particolare transgene integrato è di grande interesse per gli studi incentrati sul pattern e la regolazione dell'espressione genica, la localizzazione e la sovraespressione delle proteine, nonché per lo sviluppo di marcatori subcellulari.

Introduzione

I transgeni sono ampiamente utilizzati in C. elegans per una vasta gamma di applicazioni. I ceppi transgenici sono tipicamente generati mediante iniezione di DNA nella gonade ermafrodita sinciziale^1,2. Il DNA che trasporta il transgene di interesse viene iniettato insieme ai plasmidi che codificano per i marcatori di coiniezione^1,3,4. I marcatori di coiniezione sono transgeni stabiliti che portano all'espressione di una proteina fluorescente o a uno specifico fenotipo comportamentale o morfologico. I DNA iniettati si riorganizzano per formare array extracromosomici multicopia; Pertanto, il transgene di interesse e il marcatore di coiniez....

Protocollo

1. Coltivare nematodi transgenici prima dell'integrazione

Le linee transgeniche possono essere generate come descritto in¹. Queste linee di solito contengono un plasmide marcatore di coiniezione che porta all'espressione di una proteina fluorescente o a uno specifico fenotipo comportamentale o morfologico in un dato stadio di sviluppo^1,3. Questo protocollo di integrazione può essere applicato a ceppi che esprimono marcatori di coiniezione fluorescenti o non fluorescenti. Nell'esempio seguente, è stato utilizzato un ceppo con un marcatore di coiniezione fluorescente.

1. Preparare le piastre di coltura:
   ....

Risultati

L'integrazione di transgeni in due linee diverse che trasmettono array extracromosomici con una frequenza simile (50-60%) è stata eseguita utilizzando il protocollo standard e quello migliorato (Tabella 1). Il protocollo standard ha permesso l'isolamento di tre linee indipendenti integrate dopo l'irradiazione UV di 91 animali transgenici in stadio L4, mentre il protocollo migliorato ha permesso l'isolamento di una linea integrata dopo l'irradiazione UV di 30 animali transgenici in stadio L4. Ciò suggeris.......

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo efficiente per integrare array transgenici extracromosomici nel genoma di C. elegans. Utilizzando diverse linee non integrate, che hanno trasmesso lo stesso transgene Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) a velocità diverse (10-15%, 50-60% e >80%), abbiamo dimostrato che il numero di ceppi integrati recuperati dopo l'irradiazione UV dipende dal livello iniziale di trasmissione della linea non integrata (Tabella 2). Pertanto, i transgeni sono più faci.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agar	Prolabo	20768.292	per la preparazione NGM (terreno di crescita dei nematodi) (6,7)
NaCl	Chimie-Plus	40045	per la preparazione NGM
Bacto-peptone	BD	211820	per la preparazione NGM
KH2PO4	Roth	3904-1	per la preparazione NGM
K2HPO4	Prolabo	26930.293	per la preparazione NGM
MgSO4	Roth	P027.2	per la preparazione NGM
CaCl2	Prolabo	22317.297	per la preparazione NGM
Colesterolo	Rectapur		per la preparazione NGM
LB-broth	Sigma	L3022	per la coltura di OP50 batteri
ATTREZZATURA
Cross-linker U.V.	Fischer Scientific		Lunghezza d'onda 254 nm
Microscopio SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Piastre di Petri, 60 mm	CML	BPS55E6
Filo di platino 0,25 mm	Alfa Aesar	7440-06-4	Per fare un piccone per i vermi (7)