Articolo metodologico

Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 dicembre 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura rapida e a basso consumo di materiale per l'integrazione di array extracromosomici transgenici nel genoma di Caenorhabditis elegans utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV). Inoltre, questo protocollo è particolarmente adatto per le linee transgeniche che trasmettono array extracromosomici ad alta velocità.

Abstract

Microiniettare DNA nel citoplasma della gonade sinciziale di Caenorhabditis elegans è la tecnica principale utilizzata per stabilire linee transgeniche che mostrano tassi di trasmissione parziali e variabili di array extracromosomici alla generazione successiva. Inoltre, gli animali transgenici sono a mosaico ed esprimono il transgene in un numero variabile di cellule. Gli array extracromosomici possono essere integrati nel genoma di C. elegans utilizzando l'irradiazione UV per stabilire ceppi transgenici non mosaici con un tasso di trasmissione del 100% del transgene. A tal fine, le progenie F1 di animali transgenici irradiati con raggi UV sono sottoposte a screening per animali portatori di un'integrazione eterozigote del transgene, che porta a un tasso di trasmissione mendeliana del 75% alla progenie F2. Una delle sfide di questo metodo è distinguere tra la percentuale di trasmissione transgenica in una popolazione prima (X% di animali transgenici) e dopo l'integrazione (≥75% di animali F2 transgenici). Pertanto, questo metodo richiede la scelta di una linea transgenica non integrata con una percentuale di animali transgenici significativamente inferiore alla segregazione mendeliana del 75%. Di conseguenza, le linee transgeniche non integrate con un tasso di trasmissione extracromosomico alla generazione successiva ≤60% sono solitamente preferite per l'integrazione e l'integrazione transgenica in ceppi altamente trasmissibili è difficile. Qui mostriamo che l'efficienza dell'integrazione degli array extracromosomici nel genoma è aumentata quando si utilizzano linee transgeniche altamente trasmittenti (≥80%). Il protocollo descritto consente una facile selezione di diverse linee indipendenti con integrazione omozigote del transgene nel genoma dopo l'irradiazione UV di vermi transgenici che mostrano un alto tasso di trasmissione di array extracromosomici. Inoltre, questo metodo è abbastanza veloce e richiede un basso consumo di materiale. La possibilità di generare rapidamente diverse linee che esprimono un particolare transgene integrato è di grande interesse per gli studi incentrati sul pattern e la regolazione dell'espressione genica, la localizzazione e la sovraespressione delle proteine, nonché per lo sviluppo di marcatori subcellulari.

Introduzione

I transgeni sono ampiamente utilizzati in C. elegans per una vasta gamma di applicazioni. I ceppi transgenici sono tipicamente generati mediante iniezione di DNA nella gonade ermafrodita sinciziale1,2. Il DNA che trasporta il transgene di interesse viene iniettato insieme ai plasmidi che codificano per i marcatori di coiniezione1,3,4. I marcatori di coiniezione sono transgeni stabiliti che portano all'espressione di una proteina fluorescente o a uno specifico fenotipo comportamentale o morfologico. I DNA iniettati si riorganizzano per formare array extracromosomici multicopia; Pertanto, il transgene di interesse e il marcatore di coiniezione vengono trasmessi insieme5,4. Le linee transgeniche vengono selezionate nella generazione F2 di animali iniettati seguendo il fenotipo indotto dall'espressione del marcatore di coiniezione (fluorescenza o fenotipo specifico)1. Le linee transgeniche mostrano velocità di trasmissione parziali e variabili degli array extracromosomici alla generazione successiva. A seconda del ceppo, il 10-100% (il 100% è un evento raro) degli animali eredita array extracromosomici. Inoltre, gli animali transgenici sono a mosaico ed esprimono il transgene in un numero variabile di cellule. È probabile che questo mosaicismo sia correlato alla velocità di trasmissione alla generazione successiva. Infatti, sia nelle cellule germinali che in quelle somatiche la velocità di trasmissione dipende dalla segregazione degli array extracromosomici durante le divisioni cellulari. Un modo per evitare questo problema è integrare il transgene nel genoma. Classicamente, l'integrazione di un transgene in un cromosoma si basa sull'irradiazione (ultravioletta o gamma) di vermi transgenici portatori di array extracromosomici3. In breve, 50-100 animali ermafroditi vengono irradiati allo stadio larvale L4. Nella generazione F1 vengono selezionati 200-800 animali transgenici e allevati individualmente su piastre. Secondo la segregazione mendeliana, gli animali F1 transgenici portatori di un'integrazione eterozigote del transgene nel genoma produrrebbero 1/2 dei discendenti transgenici che sono eterozigoti per l'array integrato, 1/4 dei discendenti transgenici che sono omozigoti per l'array integrato e 1/4 dei discendenti che non hanno integrato l'array (Figura 1). Pertanto, le piastre contenenti la generazione F2 vengono sottoposte a screening visivo per il ≥75% di animali transgenici, come osservato dall'espressione del marcatore di coiniezione. Si presume che circa 1/3 degli animali F2 selezionati per essere candidati integranti siano omozigoti per l'array integrato e che producano il 100% di animali F3 omozigoti. Quindi, da ogni piastra selezionata, da tre a otto animali F2 transgenici vengono allevati individualmente e vengono selezionate piastre con il 100% di discendenti transgenici. Successivamente, otto animali F3 vengono coltivati individualmente per confermare l'ereditarietà del 100% del transgene.

I principali svantaggi di questo metodo sono che

  1. richiede uno screening visivo di diverse centinaia di piastre F1 per il ≥75% di progenie F2 transgenica, che richiede molto tempo a causa della percentuale variabile e imprevedibile di trasmissione di array extracromosomici non integrati. In alternativa, per evitare lo screening delle piastre F1, è possibile eseguire diverse fasi successive di digiuno dopo l'irradiazione degli animali P0; Seguito dalla selezione di 100 animali transgenici e dallo screening per la progenie transgenica al 100%3.
  2. Non è adatto per ceppi che presentano una percentuale di trasmissione extracromosomica superiore al 60% poiché questa percentuale è difficile distinguere questa percentuale dal 75%.
  3. Poiché possono essere utilizzati solo ceppi con una velocità di trasmissione relativamente bassa, è necessario un numero elevato di animali P0 transgenici irradiati e l'osservazione di numerosi animali F1 e F2, che richiede molto tempo e un numero considerevole di piastre.

L'irradiazione dei vermi induce presumibilmente rotture a doppio filamento nel DNA e l'integrazione di array extracromosomici nei cromosomi avviene durante la riparazione del DNA. Pertanto, è probabile che le possibilità di ottenere un'integrazione mediata dall'irradiazione siano direttamente proporzionali al numero di cellule germinali che trasportano un array extracromosomico. I ceppi con un'alta velocità di trasmissione possono contenere più array di DNA transgenico rispetto ai ceppi con una bassa velocità di trasmissione, come suggerito in2, e mostrano un numero maggiore di cellule germinali che trasportano array extracromosomici. Pertanto, abbiamo ragionato che nelle linee altamente trasmittenti, i transgeni potrebbero essere più facili da integrare rispetto alle linee con una bassa velocità di trasmissione. Tuttavia, il protocollo standard esclude la possibilità di integrare transgeni con un'alta frequenza di trasmissione in quanto la percentuale di animali transgenici con un array extracromosomico non integrato può difficilmente essere distinta da quella della progenie di un animale F1 portatore di un'integrazione eterozigote del transgene nel genoma (Figura 1).

Qui mostriamo che per un particolare transgene, il numero di linee integrate recuperate dopo l'irradiazione con luce ultravioletta (UV) dipende dalla percentuale iniziale di trasmissione dell'array non integrato. Presentiamo un protocollo migliorato per l'integrazione dei transgeni mediata dall'irradiazione UV che è particolarmente rilevante per le linee che presentano un alto tasso di trasmissione di array transgenici.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Coltivare nematodi transgenici prima dell'integrazione

Le linee transgeniche possono essere generate come descritto in1. Queste linee di solito contengono un plasmide marcatore di coiniezione che porta all'espressione di una proteina fluorescente o a uno specifico fenotipo comportamentale o morfologico in un dato stadio di sviluppo1,3. Questo protocollo di integrazione può essere applicato a ceppi che esprimono marcatori di coiniezione fluorescenti o non fluorescenti. Nell'esempio seguente, è stato utilizzato un ceppo con un marcatore di coiniezione fluorescente.

  1. Preparare le piastre di coltura:
    1. Preparare circa 500 piastre di Petri grandi 60 mm versate in modo asettico con 10 ml ciascuna di terreno di crescita dei nematodi (NGM)6,7.
    2. Seminare ogni piastra con 0,3 ml di coltura satura di Escherichia coli OP50 seguendo la procedura standard6,7.
  2. Valutare la velocità di trasmissione della linea transgenica da integrare:
    1. Per ogni linea transgenica, prelevare dieci adulti gravidi fluorescenti su dieci piastre di coltura separate sotto uno stereoscopio fluorescente utilizzando un verme come descritto in7.
    2. Coltivare gli animali in un'incubatrice per lombrichi a 15-25 °C (a seconda del background genetico) per consentire ai vermi di riprodursi.
    3. Osservare la progenie ogni giorno per valutare in quale fase di sviluppo il marcatore di coiniezione è espresso e può essere osservato al meglio. L'espressione della maggior parte dei marcatori di coiniezione attualmente utilizzati si osserva allo stadio larvale L4 o in età adulta.
    4. Valutare la velocità di trasmissione della progenie determinando la percentuale di progenie fluorescente mediante osservazione sotto uno stereoscopio fluorescente.
  3. Scegli una linea transgenica per l'integrazione transgenica:
    1. Selezionare la linea transgenica con la velocità di trasmissione più alta possibile (idealmente ≥80%).
  4. Ottenere una popolazione di animali transgenici sincronizzati allo stadio larvale L4 per l'integrazione:
    1. Raccogli 30 adulti gravidi fluorescenti su cinque piastre di coltura (sei animali per piastra).
    2. Lasciare deporre le uova per 3-4 ore a 15 °C.
    3. Eliminare gli adulti dai piatti dopo aver verificato la presenza di almeno 30 uova per piatto.
    4. Allevare gli animali in un'incubatrice per vermi a 15-25 °C fino a quando la progenie raggiunge lo stadio larvale L4 (96 ore a 15 °C o 36 ore a 25 °C).

2. Irradiazione UV e recupero di vermi transgenici

  1. Irradiazione con vermi:
    1. Raccogli 30-100 animali fluorescenti transgenici L4 su piastre di coltura separate (15-20 animali per piastra).
    2. Posizionare le piastre, senza i coperchi, in un reticolante UV. Irradiare i vermi a 0,012 J/cm2. Si noti che i ceppi sono più o meno sensibili ai raggi UV e che i risultati possono essere variabili a seconda dell'irradiatore UV utilizzato. È possibile testare un intervallo di dose compreso tra 0,010 e 0,015 J/cm2.
  2. Recupero dai vermi dopo l'irradiazione:
    1. Posizionare le piastre con vermi irradiati per una notte a 15 °C per il recupero.
    2. Controlla il numero di animali vivi. Nelle nostre mani, un tasso di sopravvivenza di circa l'80-90% è adattato per un'irradiazione efficiente.
    3. Far crescere gli animali irradiati a 15-25 °C fino a quando la progenie non ha raggiunto lo stadio di sviluppo, consentendo l'osservazione dell'espressione del marcatore di coiniezione, come stabilito nella fase 1.2.

3. Isolamento di linee transgeniche integrate

  1. Selezione di animali F1:
    1. Singoli 150-200 animali F1 fluorescenti su piastre di coltura separate. Per linee altamente trasmittenti (≥80%), sono sufficienti 100 animali F1.
    2. Conservare queste piastre F1 a 15-25 °C fino a quando la progenie non raggiunge uno stadio appropriato per l'osservazione di animali fluorescenti F2.
    3. Scartare tutte le piastre F1 che presentano i) nessuna progenie, indicando che l'animale F1 era sterile o è morto, o ii) nessun animale F2 fluorescente o solo pochi animali, indicando che l'animale F1 non ha trasmesso il transgene alla velocità prevista. Questo passaggio è rapido e rappresenta un reale vantaggio rispetto al protocollo standard che richiede una stima della percentuale di vermi F2 fluorescenti per selezionare piastre F1 che presentano ≥75% di progenie fluorescente (Tabella 1).
  2. Selezione di animali F2:
    1. Singoli quattro animali F2 transgenici fluorescenti da ciascuna piastra F1 selezionata. Quando si utilizzano transgeni fluorescenti (ad esempio mCherry8, gfp9 o dsRed10), scegliere vermi F2 con un alto livello di fluorescenza in quanto ciò potrebbe indicare che questi animali sono omozigoti per l'array integrato. Si noti che quando si scelgono animali F2 è fondamentale non portare con sé uova o larve, al fine di evitare falsi negativi nel passaggio successivo.
    2. Alleva animali F2 a 15-25 °C.
  3. Isolamento e validazione di ceppi transgenici integrati:
    1. Piastre F2 per vermi F3 transgenici fluorescenti al 100%. Lo schermo è abbastanza rapido in quanto la presenza di un singolo verme non fluorescente indica che la lastra deve essere gettata via. Un animale omozigote F2 per il transgene integrato darà una progenie fluorescente omozigote al 100%.
    2. Estrarre otto animali F3 fluorescenti da piastre selezionate per confermare l'ereditarietà del 100% del transgene. In teoria, scegliere un animale è sufficiente in questa fase. Tuttavia, la selezione di otto animali fluorescenti F3 può essere necessaria per evitare di selezionare animali non fertili o malsani, poiché l'irradiazione può indurre casualmente mutazioni che influenzano geni importanti per la fisiologia dei vermi.
    3. Se possibile, mantenere diversi ceppi transgenici integrati indipendenti, cioè ceppi recuperati da diversi animali F1.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

L'integrazione di transgeni in due linee diverse che trasmettono array extracromosomici con una frequenza simile (50-60%) è stata eseguita utilizzando il protocollo standard e quello migliorato (Tabella 1). Il protocollo standard ha permesso l'isolamento di tre linee indipendenti integrate dopo l'irradiazione UV di 91 animali transgenici in stadio L4, mentre il protocollo migliorato ha permesso l'isolamento di una linea integrata dopo l'irradiazione UV di 30 animali transgenici in stadio L4. Ciò suggeris...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo efficiente per integrare array transgenici extracromosomici nel genoma di C. elegans. Utilizzando diverse linee non integrate, che hanno trasmesso lo stesso transgene Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) a velocità diverse (10-15%, 50-60% e >80%), abbiamo dimostrato che il numero di ceppi integrati recuperati dopo l'irradiazione UV dipende dal livello iniziale di trasmissione della linea non integrata (Tabella 2). Pertanto, i transgeni sono più faci...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Claire Lecroisey e Laurent Ségalat per aver generato Pdyc-1::d yc-1::gfp non integrati; Ceppi transgenici Pmyo-2::d sRed e Pmyo-3::gfp. Ringraziamo Andy Fire per il dono del plasmide Pmyo-2::d sRed e Pamela Hoppe per il dono del plasmide Pmyo-3::gfp. Questo lavoro è stato fondato dal Centro Nazionale Francese di Ricerca Scientifica (CNRS) e dall'Università Claude Bernard di Lione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarProlabo20768.292per la preparazione NGM (terreno di crescita dei nematodi) (6,7)
NaClChimie-Plus40045per la preparazione NGM
Bacto-peptoneBD211820per la preparazione NGM
KH2PO4Roth3904-1per la preparazione NGM
K2HPO4Prolabo26930.293per la preparazione NGM
MgSO4RothP027.2per la preparazione NGM
CaCl2Prolabo22317.297per la preparazione NGM
ColesteroloRectapurper la preparazione NGM
LB-brothSigmaL3022per la coltura di OP50 batteri
ATTREZZATURA
Cross-linker U.V.Fischer ScientificLunghezza d'onda 254 nm
Microscopio SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Piastre di Petri, 60 mmCMLBPS55E6
Filo di platino 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Per fare un piccone per i vermi (7)

Riferimenti

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Irradiazione UVSelezione di Linee TransgenicheScreening a FluorescenzaIntegrazione OmozigoteAnalisi del Tasso di TrasmissioneScreening della Progenie F1Selezione di Piastre F2Generazione di Ceppi Indipendenti

Articoli correlati