Dimostriamo un semplice test PCR multiplex per lo screening rapido e la tipizzazione di Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) di tipo I-V per Staphylococcus aureus resistente alla meticillina e forniamo alcuni dei passaggi vitali e delle sfumature procedurali che lo rendono efficace per adattare questo test ai singoli laboratori.
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Articolo metodologico
Multiplex PCR per la tipizzazione di stafilococco cassette cromosomiche Mec Tipi I a V, resistente alla meticillina
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Stafilococco Cassette Cromosoma mec (SCC mec) tipizzazione molecolare
Introduzione
Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) ha acquisito e integrato nel suo genoma di un elemento genetico mobile 21-67-kb, definito il stafilococco cassetta cromosoma mec (SCC mec) che ospita la resistenza alla meticillina (mecA) gene e altri fattori determinanti di resistenza agli antibiotici 1 . SCC mec
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Protocollo
Queste procedure devono essere effettuate in un laboratorio certificato di livello 2 di biosicurezza. Adeguati dispositivi di protezione individuale, come guanti e camici da laboratorio deve essere utilizzato in ogni momento.
1. Preparazione del campione
- Sono tenuti fresche durante la notte culture piastra di MRSA. Il giorno prima della PCR deve essere fatto, selezionare una singola colonia di MRSA con una cultura bastoncino sterile e preparare una pesante striscia di batteri su una piastra di Tryptic Soy Agar (TSA). Campioni multipli possono essere strisciati su un singolo piatto. Incubare per una notte a 37
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Risultati
Questo M-PCR aggiornato è in grado di determinare (classificare) i tipi di SCCmec da I a V, oltre ai principali sottotipi di SCCmec IV. Il saggio mira a loci unici e specifici di SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE e V, con contemporanea rilevazione del gene mecA. È inoltre possibile un'identificazione provvisoria di SCCmec VI e VIII, ma sarebbero necessari ulteriori test per confermarla. Figura 3 illustra i rappresentanti di SCCmec I-VI e VIII...
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Discussione
Il test PCR multiplex qui descritto fornisce un metodo semplice e affidabile per classificare i tipi e i principali sottotipi di SCCmec I-V negli stafilococchi, con discriminazione simultanea di MRSA da MSSA. Il test è robusto, viene eseguito comodamente in un'unica reazione PCR e i risultati sono facili da interpretare. Il test ha dei limiti in quanto si rivolge a singoli loci all'interno di ciascun tipodi mec SCC, ma non offre una tipizzazione completa del complesso CCR e MEC , e qui...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre, e D. Coleman per il gentile dono di alcuni ceppi di riferimento utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato in parte sostenuto finanziariamente dal Centre for Antimicrobial Resistance (CAR), Alberta Health Services-Calgary/Calgary Laboratory Services/University of Calgary.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tryptic Soy Agar | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Acqua distillata sterile | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: include 10x tampone PCR e 50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Acido borico | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agarosio | Life Technologies | 16500-500 | |
| Glicerolo | Life Technologies | 15514-011 | |
| Blu di bromofenolo | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ Scala DNA | Life Tecnologie | 10787-026 | |
| Bromuro di etidio | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Bastoncini per coltura | VWR | CA10805-018 | |
| Provette per PCR | Diamed | AD0210-FCN (new #: DIATEC420-1250) | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5417c | |
| Blocco termico | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| Thermalcycler | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| Camera di elettroforesi su gel orizzontale sommergibile con stampo in gel | BioRad | 170-4469 | |
| Alimentazione | BioRad | 164-5050 | |
| Agitatore a bilanciere | VWR | 40000-300 | |
| Molecolare Imager Gel Doc System | BioRad | 1708170 |
Riferimenti
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
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- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
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- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
