Articolo metodologico

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

DOI:

10.3791/50786

⸱

8 agosto 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

In questo articolo

Sommario

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Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

Abstract

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Biomarcatori stanno diventando sempre più importante nel processo decisionale clinico, così come la scienza di base. Diagnosi di infarto del miocardio (MI) è in gran parte determinata rilevando proteine ​​cardiaco-specifici nel siero o nel plasma dei pazienti come indicatore di danno miocardico. Avendo recentemente dimostrato che miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C) è rilevabile nel siero dopo MI, abbiamo proposto come potenziale biomarker per MI. Biomarcatori sono in genere rilevati dai tradizionali panino saggi immunoenzimatica. Tuttavia, questa tecnica richiede un volume di campione grande, ha una piccola gamma dinamica, e può misurare solo una proteina alla volta.

Qui vi mostriamo un test immunologico multiplex in cui tre proteine ​​cardiache possono essere misurate simultaneamente con alta sensibilità. Misurare cMyBP-C in Uniplex o insieme a creatina chinasi MB e troponina cardiaca ho mostrato sensibilità paragonabile. Questa tecnica utilizza il Meso Scale Discovery(MSD) metodo di multiplazione in una piastra a 96 pozzetti combinato con ElettroChemiLuminescenza per il rilevamento. Mentre sono necessari solo piccoli volumi di campione, alta sensibilità e una grande gamma dinamica si ottengono. Utilizzando questa tecnica, abbiamo misurato cMyBP-C, creatina chinasi MB e troponina cardiaca I livelli in campioni di siero di 16 soggetti con infarto miocardico e confrontato i risultati con 16 soggetti di controllo. Siamo stati in grado di rilevare tutti i tre marcatori in questi campioni e ho trovato tutti e tre i biomarcatori per essere aumentati dopo il MI. Questa tecnica è quindi adatto per la rivelazione sensibile dei marcatori cardiaci in campioni di siero.

Introduzione

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La misura di basse quantità di proteine ​​in campioni biologici complessi, quali siero, è di crescente importanza clinica per la gestione del paziente, così come la scienza di base. Per esempio, un aumento dei livelli sierici di marcatori cardiaci, quali troponina I, in un ambiente clinico è coerente con infarto acuto del miocardio (MI) 1. Per rilevare le proteine ​​in campioni di siero, saggio immunoenzimatico standard (ELISA) è la tecnica più utilizzata come ha alta sensibilità e consente la quantificazione assoluta dell'analita. Tuttavia, ELISA tradizionali richiedono una quantità relativamente grande di campione (tipicamente 100 pl), hanno alta segnale di fondo in alcuni fluidi biologici, e sono limitati alla misurazione di un solo analita per ELISA 2.

Recentemente, una nuova tecnica di immunodosaggio è stata introdotta che aggira molti di questi inconvenienti. Questo test modificato, sviluppato da MSD, utilizza electrochemiluminescrenza (ECL) per la rilevazione del segnale, che consente un background molto bassa e una maggiore sensibilità, consentendo l'uso di piccoli volumi di campione. ElettroChemiLuminescenza è basato sulla molecola reporter rutenio (II) trisbipyridal, che è attaccato agli anticorpi di rivelazione. Questa molecola reporter emette luce a 620 nm sulla stimolazione elettrica del fondo della piastra a 96 pozzetti dotato di elettrodi di carbonio in essi integrati 3. Inoltre, utilizzando rivestimento macchia, anticorpi di cattura multipli possono essere rivestiti in un pozzetto (fino a 10 su una piastra a 96 pozzetti), consentendo la quantificazione simultanea di proteine ​​differenti in un singolo campione 4. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per misurare profili di citochine proinfiammatorie nel siero 5,6. Le piastre multiplex da MSD reggono bene il confronto con altre piattaforme di test multiplex 7.

Utilizzando MSD come la piattaforma di riferimento primario, abbiamo ulteriormente sviluppato un custom made piatto 3-plex che cdi quantificare simultaneamente il livello di miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C), creatina-chinasi MB (CK-MB) e troponina I cardiaca (cTnI), ed i risultati sono stati confrontati con il rilevamento monoplex di cMyBP-C. CK-MB e cTnI sono biomarcatori ben consolidate per MI. Tuttavia, gli aumenti di questi marcatori possono essere causati da patologie diverse da MI, es miocardite o insufficienza renale 8. Questo sostiene l'aggiunta di biomarcatori supplementari per aumentare la specificità della diagnosi di MI. Abbiamo recentemente dimostrato che cMyBP-C è anche un potenziale biomarcatore per MI 9. cMyBP-C è un filamento spesso associata proteina che è espressa nel cuore, 10-12 ma non nei muscoli scheletrici o lisci. Così, l'aumento del livello di cMyBP-C nel sistema circolatorio è un indicatore specifico di danno cardiaco 13.

In questo studio, abbiamo confrontato rilevamento uniplex di cMyBP-C con l'uso di un saggio 3-plex personalizzato per misurare i livelli sierici dicMyBP-C, CK-MB e cTnI nel siero dei pazienti con infarto miocardico. In futuro, questa tecnica di firma può essere utilizzato per diagnosticare MI in pazienti che si presentano con dolore toracico in Pronto Soccorso.

La board review istituzione (IRB) del Loyola University di Chicago ha approvato lo studio per l'utilizzo di campioni umani deidentified e l'uso del saggio immunologico (LU # 20392).

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Protocollo

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1. Uniplex cMyBP-C Assay

  1. Il giorno prima dell'esperimento, cappotto della piastra standard nuda a 96 pozzetti MSD con anticorpo di cattura. Per cMyBP-C, utilizzare un volume 30 pl di topo monoclonale anti-cMyBP-C (gelatina libero) ad una concentrazione di 5 mg / ml diluito in tampone fosfato (PBS).
  2. Poiché il pozzo è idrofobo, pipettare la soluzione nel angolo inferiore del pozzo; toccare i lati della piastra di diffondere la soluzione su tutta bene.
  3. La piastra è rivestita con un adesivo ed incubata O / N a 4 ° C senza agitazione.
  4. Rimuovere la soluzione di anticorpo di cattura toccando la soluzione fuori sopra un lavandino e poi su una pila di tovaglioli di carta. Legame non specifico alla piastra è bloccata con l'aggiunta di 150 pl di un 5% (w / v) Una soluzione bloccante (alta qualità BSA) in PBS ad ogni pozzetto.
  5. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione a 700 rpm.
  6. Durante la fase di bloccaggio, preparare gli standard e samples. Rendere la serie standard diluendo frammento ricombinante proteina cMyBP-C (amminoacidi 1-271) ad una concentrazione iniziale di 2,000 ng / ml in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Poi diluire serialmente di un fattore 5 in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Totale di 7 standard + 1 blank (1% (w / v) bloccante A / solo PBS) sono stati utilizzati.
  7. Rimuovere la soluzione di saturazione e lavare la piastra 3 volte con 150 microlitri 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Ogni volta, rimuovere la soluzione di lavaggio invertendo la piastra sopra un lavandino. Dopo la terza fase di lavaggio, con forza flick la piastra sopra un lavandino e Pat la piastra energicamente su uno strato di asciugamani di carta fino a quando non è completamente asciutto. Questo è un punto cruciale, come volumi di incubazione sono piccole, e la soluzione di lavaggio restante sarà diluire significativamente la prossima incubazione.
  8. Pipettare 25 ml di standard e campioni nei pozzetti. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente, agitando a 700 rpm per 1 ora.
  9. Preparare la soluzione di anticorpo di rilevazione a 1 mg / ml in 1% bloccante A / PBS. A custom fatto cMyBP-C anticorpi (epitopi aminoacidi 2-14) con MSD SULFO-TAG etichettatura serve come l'anticorpo di rilevazione. I kit sono disponibili per l'etichettatura SULFO-TAG, che lo rende una procedura relativamente semplice per etichettare qualsiasi anticorpo.
  10. Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4.
  11. Aggiungere 25 ml di soluzione di anticorpo di rilevazione per ciascun bene, sigillare la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore impostato a 700 rpm.
  12. Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software (vedi sezione reagente). Inoltre, diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x lettura-buffer a 15 ml di acqua distillata.
  13. Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4.
  14. Aggiungere 150 ml di lettura del buffer di ogni bene usando una pipetta multicanale. Essere sicuri di evitare bolle d'aria (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l'aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nel SettoreImager.

2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay

  1. A soluzioni di 96 pozzetti 3-plex e diluente sono autorizzati a stabilizzare a RT prima dell'uso. Questo piatto è pre-rivestita con anticorpi di cattura per cMyBP-C, CK-MB e cTnI da MSD.
  2. Aggiungere 25 ml di 1% (w / v) bloccante A / PBS ad ogni pozzetto. Toccare i lati della piastra per assicurarsi che l'intera ben è coperto da soluzione.
  3. Sigillare la piastra con un foglio sigillante, collocare la piastra su un agitatore, e agitare a 700 rpm per 30 min.
  4. Nel frattempo, viene preparata una serie di diluizioni di singoli calibratori. Poiché ogni bene ha tre anticorpi di cattura tre calibratori devono essere miscelati e diluiti serialmente prima dell'uso. Diluire ricombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e cTnI (MSD) insieme in 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare un campione con 2.000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, e 25 ng / ml di cTnI (campione A).
  5. Un volume finale di almeno 100 microlitri viene preparato per ciascuno standard. Acompletano la serie standard, serie diluire i campioni sono di un fattore 5. Utilizzare 25 microlitri del campione A in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione B. Quindi utilizzare 25 microlitri di campione B in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione C e così via. Campioni di siero umano di 16 soggetti con infarto miocardico e 16 soggetti di controllo sono stati usati per misurare i livelli di cTnI cMyBP-C, CK-MB e. Questi campioni sono stati diluiti in 2x 1% (w / v) bloccante A / PBS.
  6. Aggiungere 25 ml di standard e di campione diluito al 25 microlitri già presente nei pozzetti della piastra 3-plex. È importante anche includere uno spazio (solo diluente). Di stabilire la tecnica, i campioni vengono caricati in triplicato tecnici. In caso contrario, i duplicati sono sufficienti.
  7. Sigillare nuovamente la piastra (sigillante può essere riutilizzato) e incubare su un agitatore (700 rpm) a temperatura ambiente per 2 ore.
  8. Appena prima l'incubazione è terminata, la soluzione di anticorpo di rivelazione è preparato. Il diluente utilizzato è 1% (w / v) Un bloccante in PBS. Tutti thranticorpi di rivelazione ee SULFO-tag vengono diluiti insieme in una concentrazione finale di 1 mg / ml ciascuno. Anticorpi di rilevamento sono di norma forniti a una concentrazione magazzino 50x.
  9. Per una completa piastra a 96 pozzetti, è necessaria 2,700 ml di soluzione totale diluita (con pipettaggio errore inclusa). Aggiungere 54 ml di ogni anticorpo di rilevazione 2.538 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS.
  10. Dopo 2 ore, togliere le soluzioni da vigorosamente sfogliando la piastra sopra un lavandino. Lavare i pozzetti 3 volte con 150 ml di 0,05% Tween-20 in PBS. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpo di rilevazione ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, ei lati della piastra sono nastrate per assicurare che l'intera ben è coperto da soluzione.
  11. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora agitando a 700 giri al minuto.
  12. Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software. Anche diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x letturatampone a 15 ml di acqua distillata.
  13. Ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 2.8.
  14. Aggiungere 150 ml di buffer di lettura ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Evitare bolle d'aria è fondamentale (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l'aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nella Imager Settore.

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Risultati

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I principi di base e flusso del saggio 3-plex sono riportati nella Figura 1, e il flusso di lavoro complessivo è descritto nella Tabella 1. Saggi Uniplex funzionano lungo lo stesso principio, tranne che l'intero fondo pozzo viene rivestito con un anticorpo di cattura. Rilevazione del segnale è fatto da ECL in cui un segnale elettrico viene applicato al fondo del pozzo. Questo, a sua volta, avvia una produzione locale di luce attraverso una reazione chimica del buffer di lettura con ...

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Discussione

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In questo studio, mostriamo l'applicabilità di un immunodosaggio multiplex per la rilevazione di più marcatori cardiaci nel siero di pazienti. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto tradizionale ELISA. Prima, nel kit ECL saggio è usato invece di rilevazione colorimetrica. In ECL, un segnale elettrico stimola la produzione locale di proprietà misurate (luce), quindi sganciare l'evento stimolazione dal segnale, che riduce sfondo 14. Questo permette di elevata sensibilità, come si può vedere ...

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Dichiarazioni

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Un'applicazione completa di brevetto è in corso (Applicazione di serie n ° 13/464, 466, Pub No. US 2012/0282618 A1 e Data:. 05/04/12) per determinare i fattori di rischio connessi con il degrado cMyBP-C e il rilascio nel liquido corpo umano e quantificare il livello di cMyBP-C in fluido corporeo umano.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan), e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Gli autori ringraziano l'assistenza del dottor Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, per la loro eccellente supporto tecnico e la letteratura nello sviluppo del test.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) con tensioattivoMeso Scale DiscoveryR92TC-2 
Tween-20Acros9005-64-5 
Blocco MSD AMeso Scale DiscoveryR93BA-1 
Soluzione salina tamponata con fosfato, 10XFisher BioReagentsBP399-4Filtro prima dell'uso
Anticorpo della proteina C legante la miosina, monoclonale di topo (E7), privo di gelatinaSanta CruzSC-137180LPer il rivestimento, l'anticorpo deve essere privo
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standardplate Meso Scale DiscoveryL15XA-3 
Un prototipo di piastra a 3 plex, quattro punti, 96 pozzetti con cMyBP-C, cTnI e CK-MBMeso ScaleDiscovery N452A-1 
ThermaSeal Sealing FilmLife Science Products Inc.ST-3098 
MSD SECTOR Imager 2400Asu scala meso 
Agitatore per microtitolazione digitale MTS 2/4IKA3208001 
di gelatina Scoperta

Riferimenti

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Saggio immunoanalitico multiplexRilevazione di biomarcatori siericiMeso Scale DiscoveryPiastra a 96 pozzettiCurva standard del calibratoreMarcatura dell anticorpo di rilevazioneAggiunta di tampone ReidAnalisi della reattivit crociata

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