Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Summary

Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

Abstract

Biomarcatori stanno diventando sempre più importante nel processo decisionale clinico, così come la scienza di base. Diagnosi di infarto del miocardio (MI) è in gran parte determinata rilevando proteine ​​cardiaco-specifici nel siero o nel plasma dei pazienti come indicatore di danno miocardico. Avendo recentemente dimostrato che miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C) è rilevabile nel siero dopo MI, abbiamo proposto come potenziale biomarker per MI. Biomarcatori sono in genere rilevati dai tradizionali panino saggi immunoenzimatica. Tuttavia, questa tecnica richiede un volume di campione grande, ha una piccola gamma dinamica, e può misurare solo una proteina alla volta.

Qui vi mostriamo un test immunologico multiplex in cui tre proteine ​​cardiache possono essere misurate simultaneamente con alta sensibilità. Misurare cMyBP-C in Uniplex o insieme a creatina chinasi MB e troponina cardiaca ho mostrato sensibilità paragonabile. Questa tecnica utilizza il Meso Scale Discovery(MSD) metodo di multiplazione in una piastra a 96 pozzetti combinato con ElettroChemiLuminescenza per il rilevamento. Mentre sono necessari solo piccoli volumi di campione, alta sensibilità e una grande gamma dinamica si ottengono. Utilizzando questa tecnica, abbiamo misurato cMyBP-C, creatina chinasi MB e troponina cardiaca I livelli in campioni di siero di 16 soggetti con infarto miocardico e confrontato i risultati con 16 soggetti di controllo. Siamo stati in grado di rilevare tutti i tre marcatori in questi campioni e ho trovato tutti e tre i biomarcatori per essere aumentati dopo il MI. Questa tecnica è quindi adatto per la rivelazione sensibile dei marcatori cardiaci in campioni di siero.

Introduction

La misura di basse quantità di proteine ​​in campioni biologici complessi, quali siero, è di crescente importanza clinica per la gestione del paziente, così come la scienza di base. Per esempio, un aumento dei livelli sierici di marcatori cardiaci, quali troponina I, in un ambiente clinico è coerente con infarto acuto del miocardio (MI) ^1. Per rilevare le proteine ​​in campioni di siero, saggio immunoenzimatico standard (ELISA) è la tecnica più utilizzata come ha alta sensibilità e consente la quantificazione assoluta dell'analita. Tuttavia, ELISA tradizionali richiedono una quantità relativamente grande di campione (tipicamente 100 pl), hanno alta seg....

Protocol

1. Uniplex cMyBP-C Assay

1. Il giorno prima dell'esperimento, cappotto della piastra standard nuda a 96 pozzetti MSD con anticorpo di cattura. Per cMyBP-C, utilizzare un volume 30 pl di topo monoclonale anti-cMyBP-C (gelatina libero) ad una concentrazione di 5 mg / ml diluito in tampone fosfato (PBS).
2. Poiché il pozzo è idrofobo, pipettare la soluzione nel angolo inferiore del pozzo; toccare i lati della piastra di diffondere la soluzione su tutta bene.
3. La piastra è rivestita con un adesivo ed incubata O / N a 4 ° C senza agitazione.
4. Rimuovere la soluzione di anticorpo di cattura toccando la soluzione fuori sopra un lavandino ....

Results

I principi di base e flusso del saggio 3-plex sono riportati nella Figura 1, e il flusso di lavoro complessivo è descritto nella Tabella 1. Saggi Uniplex funzionano lungo lo stesso principio, tranne che l'intero fondo pozzo viene rivestito con un anticorpo di cattura. Rilevazione del segnale è fatto da ECL in cui un segnale elettrico viene applicato al fondo del pozzo. Questo, a sua volta, avvia una produzione locale di luce attraverso una reazione chimica del buffer di lettura con l'et.......

Discussion

In questo studio, mostriamo l'applicabilità di un immunodosaggio multiplex per la rilevazione di più marcatori cardiaci nel siero di pazienti. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto tradizionale ELISA. Prima, nel kit ECL saggio è usato invece di rilevazione colorimetrica. In ECL, un segnale elettrico stimola la produzione locale di proprietà misurate (luce), quindi sganciare l'evento stimolazione dal segnale, che riduce sfondo ^14. Questo permette di elevata sensibilità, come si può vedere .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) con tensioattivo	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
Blocco MSD A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Soluzione salina tamponata con fosfato, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filtro prima dell'uso
Anticorpo della proteina C legante la miosina, monoclonale di topo (E7), privo di gelatina	Santa Cruz	SC-137180L	Per il rivestimento, l'anticorpo deve essere privo
Plates and Equipment
Multi-Array 96-well standard	plate Meso Scale Discovery	L15XA-3
Un prototipo di piastra a 3 plex, quattro punti, 96 pozzetti con cMyBP-C, cTnI e CK-MB	Meso Scale	Discovery N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A		su scala meso
Agitatore per microtitolazione digitale MTS 2/4	IKA	3208001