Lo studio delle interazioni di Staphylococcus aureus Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

Sommario

Presenteremo i metodi per studiare l'effetto di PSMs e altre tossine secrete da Staphylococcus aureus Sui neutrofili mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza.

Abstract

Vi presentiamo i metodi per studiare l'effetto di modulins solubili fenolo (PSM) e altre tossine prodotte e secrete da Staphylococcus aureus sui neutrofili. Per studiare gli effetti delle PSMs sui neutrofili isoliamo neutrofili freschi utilizzando densità centrifugazione in gradiente. Questi neutrofili sono caricati con un colorante fluorescente che su di mobilizzazione del calcio. L'attivazione dei neutrofili da PSMs avvia un aumento rapido e transitorio nella concentrazione di calcio intracellulare libero. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata monitorando la fluorescenza di un colorante pre-caricato che reagisce alla maggiore concentrazione del Ca ^{2 +.} Usando questo metodo è possibile determinare la concentrazione di PSM necessario attivare la neutrofili, e misurare gli effetti degli inibitori specifici e generali di attivazione dei neutrofili.

Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intracellulare, we hanno costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone PSMα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono fagocitati dai neutrofili, l'induzione di espressione può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza.

Introduzione

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus ^1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione ^2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza ^4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all'attivazione di tale G-proteina recettore accoppiato ^6. Uno dei primi eventi è la mobilitazione dei depositi intracellulari di calcio (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agisce come un messaggero secondario per una varietà di funzioni effettrici dei PMN compreso degranulazione e fagocitosi ^7. Pertanto Ca ^{2 +} è un indicatore molto sensibile dellacapacità funzionale del PSM per attivare PMN. Per studiare gli effetti di PSM su neutrofili, neutrofili freschi sono isolati e caricati con un colorante che reagisce su di mobilizzazione del calcio. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata. Usando questo metodo, è possibile studiare gli effetti diretti di componenti tossici e di altro neutrofili, e determinare la concentrazione minima a cui essi sono attivi. Per noi, si tratta di uno strumento molto utile per studiare l'effetto di molte proteine ​​prodotte da S. aureus coinvolta in evasione immune, quali FPR2 proteina inibitoria (FLIPR) ^8, FLIPR-come ^7, e chemiotassi proteina inibitoria di Staphylococcus aureus (chips) ^9. Tutte queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire la mobilizzazione del calcio in neutrofili legandosi al recettore che riconosce l'agonista.

Recentemente, il nostro gruppo ha descritto che PSM sono funzionalmente inibiti dalle lipoproteine ​​sieriche ^{10 <}/ Sup>. Queste lipoproteine ​​sono abbondantemente presenti nel sangue e tessuti umani, indicando che PSMs esercitano la loro funzione principalmente nell'ambiente intracellulare. La disponibilità del saggio mobilizzazione del calcio permesso di misurare con precisione l'effetto di lipoproteine ​​sieriche sull'attivazione dei neutrofili dai PSMs, indicata dalla notevole inibizione da concentrazioni molto basse di siero.

Poiché le PSMs sono funzionalmente inibiti dal siero, abbiamo ipotizzato che ci sia una funzione importante per PSMs come tossine intracellulari. Abbiamo quindi cercato di determinare il ruolo di PSM dopo la fagocitosi. Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intercellulare, abbiamo costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone psmα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono stati fagocitati dai neutrofili, l'induzione dell'espressione era osservabile mediante microscopia a fluorescenza ^10. Ovviamente, questa technique consente di studiare l'espressione di un gran numero di geni in S. aureus o altri patogeni dopo fagocitosi. Poiché per S. aureus sopravvivendo nella nicchia intercellulare è molto importante per superare il sistema immune innato ^{11 10 12,} studiando il ruolo dei geni attivati ​​in questa nicchia è molto importante per comprendere la sua virulenza.

Protocollo

1. Isolamento dei PMN dal sangue umano da densità centrifugazione

1. Disegnare 5 9 ml provette di sangue venoso eparina.
2. Preparare doppio strato gradienti Ficoll (4 gradienti per 5 provette sangue) come segue: Versare 12 ml di una densità di 1.119 g / ml soluzione Ficoll in un tubo da 50 ml e strato accuratamente 10 ml di una densità di 1,077 g / ml soluzione Ficoll in cima.
3. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS.
4. Strato il sangue diluito con cura sullo strato doppio gradiente Ficoll; 20-25 ml per gradiente.
5. Centrifugare 20 min a 396 xg in un rotore oscillante, 22 ° C senza freni.
6. Preparare freddo RPMI contenente 0,05% di albumina sierica umana (RPMI-HSA). Anche preparare 9 ml sterile deionizzata H ₂ O. Pre-raffreddare sia il RPMI e H ₂ O in ghiaccio.
7. Aspirare lo strato superiore contenente Ficoll plasma (colore giallo) e PBMC, e il secondo strato di Ficoll (colore bianco) con l'uso di una pompa a vuoto (mettere un puntale sterile sullala pipetta).
8. Raccogliere i PMN in provette da 50 ml utilizzando una piccola pipetta di plastica (1 tubo per le frazioni di PMN ogni 2 sfumature), e disporli sul ghiaccio.
9. Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C.
10. Togliere il surnatante con l'uso di una pompa a vuoto e agitare delicatamente il pellet (eritrociti e PMN).
11. Aggiungere 9 ml sterile deionizzata H ₂ O e avviare il timer. Fermare l'iper shock osmotico dopo 30 sec esattamente, con l'aggiunta di 1 ml di 10 volte PBS concentrato. Nota: il 30 sec sono molto critici.
12. Aggiungere a freddo RPMI-HSA ad un volume totale di 50 ml e centrifugare per 10 min a 249 xg a 4 ° C.
13. Togliere il surnatante con l'uso di una pompa a vuoto e raccogliere il PMN pellet in 1 tubo con un volume definito (1-2 ml) RPMI-HSA.
14. Determinare la quantità di cellule e regolare la concentrazione di 1.10 ⁷ cellule / ml. A seconda del donatore, la resa dei PMN isolati sarà between 5 x 10 ⁶ e 3 x 10 ⁷ PMN da 9 ml ciascuna provetta di sangue

2. Flusso Assay Cytometric per la Valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani

1. Celle di carico (5 x 10 ⁶ cellule / ml) con 2 mM Fluo-3-AM in RPMI-HSA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente a dondolo lentamente, utilizzando per esempio un dondolo piattaforma shaker, al riparo dalla luce.
2. Nel frattempo preparare una diluizione seriale (es. 3 volte) dello stimolo a 10x la concentrazione finale. PSMα3 viene utilizzata in questo protocollo, ma qualsiasi stimolo GPCR che agisce sui neutrofili è adatto.
3. Preparare concentrato 10x inibitore del recettore in RPMI-HSA. Quando l'inibitore agisce sullo stimolo (ad es HDL on PSMα3) pre-incubare 25 microlitri stimolo con un volume uguale di inibitore per 10 min a temperatura ambiente.
4. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di RPMI-HSA e centrifugare per 249 xg a temperatura ambiente. Risospendere le cellule a 5 x10 ⁶ cellule / ml.
5. Appena prima dell'esperimento, diluire le cellule a 2x10 ⁶ cellule / ml in RPMI-HSA e aggiungere 200 microlitri cellule per provetta FACS. PMN diluito sono molto fragili. Tenerli troppo a lungo a questa concentrazione porterà ad auto-attivazione; lo stesso vale per l'agitazione vigorosa o pipettaggio.
6. Collegare il tubo al citofluorimetro, attendere 3 secondi e iniziare l'acquisizione. Dopo un determinato periodo di tempo (ad esempio, 8 sec), togliere il tubo e in rapida aggiungere 50 microlitri di stimolo al campione. Subito ricollegare il tubo sul supporto del campione e continuare l'acquisto.
7. Iniziare con il più basso e terminare con la più alta concentrazione di stimolo. Lavare l'ago citofluorimetro regolarmente dopo ogni esecuzione con RPMI-HSA.
8. Analizzare i dati con il software di analisi di citometria a flusso. Confrontare il segnale di fluorescenza media prima dell'aggiunta del stimolo che dopo aggiunta dello stimolo e utilizzare gli opportuni controlli positivi e negativi per calcolare l'acforza tivazione per ogni diluizione misurato.

Alternativamente quando l'inibitore agisce sui recettori pre-incubare le cellule con l'inibitore.

3. Microscopia a fluorescenza Analisi di batteri espressione GFP dopo fagocitosi da parte dei PMN

1. Grow S. aureus contenenti un costrutto giornalista di interesse per tutta la notte in brodo (con antibiotici quando necessario per mantenere il plasmide reporter). In questo caso MW2 ceppo contenente una PSMα costrutto reporter di GFP è usato ^10, cresciuto in un tubo di plastica da 50 ml con 5 ml di coltura LB medium.
2. Per rimuovere tutte le GFP da espressione O / N, diluire le culture di OD ₆₆₀ 0,01 e crescere per OD ₆₆₀ 0.1. Redilute questa cultura 1:30, e monitorare la crescita fino a quando la cultura raggiunge un diametro esterno di ₆₆₀ 0.1. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione e lavare una volta in DPBS. Risospendere in 1:10 del volume originale per ottenere un OD ₆₆₀ di 1,0 o rviti e dei dadi 5.10 ⁸ UFC / ml.
3. Mescolare i batteri (1,10 ⁷ / ml) con PMN appena isolate (1.10 ⁶ / ml) in RPMI-HSA (rapporto 10:1) in una provetta 1,5 ml e aggiungere siero umano riunito a una concentrazione finale del 10%. Agitare su una piattaforma di agitazione per 10 min a 37 ° C per stimolare la fagocitosi. Diluire i PMN carichi di batteri a 5.10 ⁵ PMN / ml e pipetta 250 microlitri in un pozzo di un vetrino ben camerata 8.
4. Immagine dei PMN con batteri su un microscopio. Un microscopio invertito dotato di un obiettivo NA 40X/0.85 funziona bene e deve essere racchiuso in una camera ad ambiente scuro per mantenere l'ambiente stabilmente a 37 ° C. Acquisire immagini per un certo numero di posizioni preimpostate utilizzando la telecamera ogni 5-10 min sia nel campo chiaro e il canale GFP per seguire la produzione GFP nel tempo.

Risultati

Flusso saggio citometria per la valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani

Incubando neutrofili con una serie di concentrazione PSMα3 sintetici conseguente attivazione rapida come misurato da flusso di calcio, che è indicata da un aumento nel segnale in FL-1. Pre-incubazione di sintetico PSMα3 con 0,01%, siero umano 0,1% o 1% inibito significativamente la capacità di suscitare flussi di calcio (Figura 1).

Analisi di espressione GFP nei batte...

Discussione

Nei metodi descritti qui alcuni passaggi sono molto critico. Ci metterà in evidenza questi qui.

Per l'isolamento dei neutrofili centrifugazione in gradiente di densità è importante non disturbare gli strati durante o dopo le fasi di centrifugazione. Quando aspirazione dei neutrofili utilizzando una pipetta di plastica, fare attenzione a non schiacciare il pallone, mentre nello strato di cellule, come liquido di espulsione disturberà gli strati. Inoltre, controllare visivamente il pellet ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	densità 1,077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	densità 1,119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contiene 25 mM HEPES e L-glutammina
Leica TCS SP5 microscopio	Leica Microsystems, Paesi Bassi	TCS SP5	obiettivo: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Molto importante che il tubo possa essere rimosso e sostituito durante il processo di misurazione