Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

Sommario

Presenteremo i metodi per studiare l'effetto di PSMs e altre tossine secrete da Staphylococcus aureus Sui neutrofili mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza.

Abstract

Vi presentiamo i metodi per studiare l'effetto di modulins solubili fenolo (PSM) e altre tossine prodotte e secrete da Staphylococcus aureus sui neutrofili. Per studiare gli effetti delle PSMs sui neutrofili isoliamo neutrofili freschi utilizzando densità centrifugazione in gradiente. Questi neutrofili sono caricati con un colorante fluorescente che su di mobilizzazione del calcio. L'attivazione dei neutrofili da PSMs avvia un aumento rapido e transitorio nella concentrazione di calcio intracellulare libero. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata monitorando la fluorescenza di un colorante pre-caricato che reagisce alla maggiore concentrazione del Ca ^{2 +.} Usando questo metodo è possibile determinare la concentrazione di PSM necessario attivare la neutrofili, e misurare gli effetti degli inibitori specifici e generali di attivazione dei neutrofili.

Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intracellulare, we hanno costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone PSMα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono fagocitati dai neutrofili, l'induzione di espressione può essere osservato mediante microscopia a fluorescenza.

Introduzione

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus ^1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione ^2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza ^4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all'attivazione di tale G-p....

Protocollo

1. Isolamento dei PMN dal sangue umano da densità centrifugazione

1. Disegnare 5 9 ml provette di sangue venoso eparina.
2. Preparare doppio strato gradienti Ficoll (4 gradienti per 5 provette sangue) come segue: Versare 12 ml di una densità di 1.119 g / ml soluzione Ficoll in un tubo da 50 ml e strato accuratamente 10 ml di una densità di 1,077 g / ml soluzione Ficoll in cima.
3. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS.
4. Strato il sangue diluito con cura sullo strato doppio gradiente Ficoll; 20-25 ml per gradiente.
5. Centrifugare 20 min a 396 xg in un rotore oscillante, 22 ° C senza freni.
6. Preparare freddo RPMI ....

Risultati

Flusso saggio citometria per la valutazione di mobilizzazione del calcio in PMN umani

Incubando neutrofili con una serie di concentrazione PSMα3 sintetici conseguente attivazione rapida come misurato da flusso di calcio, che è indicata da un aumento nel segnale in FL-1. Pre-incubazione di sintetico PSMα3 con 0,01%, siero umano 0,1% o 1% inibito significativamente la capacità di suscitare flussi di calcio (Figura 1).

Analisi di espressione GFP nei batte.......

Discussione

Nei metodi descritti qui alcuni passaggi sono molto critico. Ci metterà in evidenza questi qui.

Per l'isolamento dei neutrofili centrifugazione in gradiente di densità è importante non disturbare gli strati durante o dopo le fasi di centrifugazione. Quando aspirazione dei neutrofili utilizzando una pipetta di plastica, fare attenzione a non schiacciare il pallone, mentre nello strato di cellule, come liquido di espulsione disturberà gli strati. Inoltre, controllare visivamente il pellet .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	densità 1,077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	densità 1,119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	contiene 25 mM HEPES e L-glutammina
Leica TCS SP5 microscopio	Leica Microsystems, Paesi Bassi	TCS SP5	obiettivo: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	Molto importante che il tubo possa essere rimosso e sostituito durante il processo di misurazione