Inchworming è un movimento di scavo sincrono altamente ripetitivo visualizzato dal BTBR T + Itpr 3TF / J (BTBR) i topi, quando sono immessi in una gabbia test con biancheria da letto di segatura sufficiente. La procedura è una modifica del protocollo di interazione sociale giovanile e viene qui utilizzato per valutare stereotipie motorie ripetitive relative al disturbo dello spettro autistico.
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Articolo metodologico
Inchworming: A Novel Motor stereotipia nel BTBR
In questo articolo
Sommario
Abstract
Disturbo dello Spettro Autistico (ASD) è un disordine dello sviluppo neurologico comportamentale definita caratterizzata dalla diminuzione della reciproca interazione sociale, comunicazione anomala e comportamenti ripetitivi con interesse limitato. La diagnosi si basa su criteri clinici, tutti i modelli di roditori potenzialmente rilevanti di questo disturbo eterogeneo dovrebbero idealmente riassumere questi tratti comportamentali diverse. Il tf BTBR T + Itpr3 / J (BTBR) mouse è un modello animale consolidata di ASD, mostrando comportamenti ripetitivi come l'aumento governare, così come rigidità cognitiva. Per quanto riguarda l'interazione sociale e l'interesse, il test di gioco minorile è stato impiegato in diversi modelli di roditori di ASD. Qui, dimostriamo che quando i topi BTBR sono testati in una custodia interazione sociale giovanile contenente biancheria da letto di segatura, che mostrano un movimento di scavo sincrono ripetitivo. Questo comportamento motorio ripetitivo, denominato "inchworming," è stato nominatoa causa della natura stereotipica dei movimenti presentati dai topi mentre si muove orizzontalmente sul pavimento. Topi Inchworming devono usare le loro anteriori e arti posteriori in sincronia per spostare la biancheria da letto, eseguendo un minimo di un attivo e un movimento verso l'esterno. Anche se entrambi (B6) topi BTBR e C56BL/6J presentano questo comportamento, i topi BTBR dimostrano una durata significativamente maggiore e la frequenza di inchworming e una latenza ridotta per avviare inchworming quando sono immessi in un recinto letti. Concludiamo che questo comportamento appena descritto fornisce una misura di una stereotipia motore ripetitivo che può essere facilmente misurata in modelli animali di ASD.
Introduzione
Sebbene la fisiopatologia dei disturbi dello spettro autistico (ASD) rimane poco chiaro, la diagnosi dipende dalla presenza di tre grandi categorie di sintomi: anormale reciprocità sociale, menomazioni della comunicazione, e ripetitivi comportamenti stereotipati / 1. La maggior parte dei modelli di roditori sono in grado di riprodurre contemporaneamente tutti e tre i sintomi in un singolo animale. Così, i modelli in grado di simulare in modo affidabile alcuni o tutti gli aspetti del disturbo tenere un grande valore per lo sviluppo di efficaci strategie preventive e terapeutiche. Un modello che fa visualizzare tutti e tre gli aspetti della ASD è il mouse 1,2 BTBR.
In combinazione con vocalizzazioni ultrasoniche e saggi approccio sociale, la prova di interazione sociale giovanile è comunemente usato per caratterizzare modelli murini di ASD pediatrica; Questi test misurano diminuito e comportamenti sociali anomali che rappresentano le caratteristiche principali di ASD. Oltre alla prova di interazione sociale giovanile, molti altritest sono stati utilizzati per misurare i comportamenti stereotipati in modelli animali di ASD. Ad esempio, il test di seppellimento marmo, che esamina la tendenza di un animale a spostare lettiera utilizzando il muso e zampe anteriori nel tentativo di coprire un oggetto, è pensato per misurare comportamenti stereotipati compulsivi che si verificano in risposta a stimoli avversi 3,4. Di conseguenza, i test di scavo sono state implementate per quantificare questo comportamento ripetitivo in modelli animali ASD e diverse specie di roditori 3,5-7. Comportamenti di scavo sono definiti come ovvie azioni dirette del muso o zampe per spostare materiali biancheria da letto e sono stati ipotizzati essere un parametro sensibile del comportamento motorio ripetitivo 4.
Qui riportiamo un nuovo tipo di scavo, che abbiamo chiamato "inchworming," nel ceppo BTBR di topi. La caratterizzazione di questo romanzo comportamento può fornire una misura affidabile di un comportamento ripetitivo motore che può essere utilizzato per ulteriori validation di modelli di roditori, quali ASD, Huntington 'malattia o disturbo ossessivo compulsivo 8,9. Definiamo "inchworming" come almeno un movimento sincrono degli arti anteriori e arti posteriori verso l'interno seguite da un movimento sincrono verso l'esterno che porta allo spostamento della lettiera. Questo differisce dal comportamento scavo tipico in molti modi. In primo luogo, il comportamento inchworming di solito si osserva come una combinazione di episodi piuttosto che un singolo evento isolato. Al contrario, scavo può verificarsi come unico movimento coordinato sia del posteriore o zampe anteriori 3. Inoltre, movimenti inchworming tendono a verificarsi orizzontalmente sul pavimento custodia in contrapposizione alle posizioni fisse che sono caratteristici di scavo comportamenti. Infine, il comportamento inchworming seguito descritto si manifesta frequentemente nel ceppo di topi inbred BTBR ma è raramente identificato nel ceppo di controllo B6, mentre i comportamenti tipici di scavo sono comuni in ceppi B6 e BTBR di topi 10. Le procedure di prova inchworming descritte in questo studio rappresentano modifiche di un minore protocollo di interazione sociale standard 1.
Dato che sepoltura di marmo, scavare, e il gioco minorile hanno stabilito un valore per misurare il comportamento anomalo in modelli murini di ASD, il comportamento inchworming integra queste misure precedentemente definiti di comportamenti stereotipati. In particolare, il comportamento inchworming fornisce una misura utile alla riduzione dei stereotipie motorie ordini che vengono comunemente identificati in ASD 8,11. Inoltre, questa nuova procedura inchworming può fornire ai ricercatori un ulteriore strumento prezioso per l'analisi dei comportamenti motori ripetitivi pertinenti a disturbi dello sviluppo come ASD.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con il Comitato Animal Care canadese e approvato dalla University of Calgary Comitato Animal Care.
1. Preparazione degli animali
- Isolare topi durante la notte (12 ore) prima del test. Per fare questo, inserire tutti i BTBR e topi B6 (P35-P40) necessario per l'analisi sperimentale in gabbie da soli, il giorno prima del test.
- Posizionare il mouse isolato in analisi comportamentale camera 30 min prima del test in modo che gli animali abituarsi al nuovo ambiente.
2. Preparazione del materiale
- Posizionare i cm in plexiglas 30 x 30 scatola con un coperchio rimovibile in sala prove. Porre il recipiente su un tavolo e posizionare la videocamera ad un angolo di 45 ° dal basso; questa posizione della telecamera permetterà la visualizzazione di tutto il piano del contenitore e il mouse. Utilizzare una retroilluminazione a infrarossi per ridurre al minimo i riflessi dal muro dila scatola.
- Utilizzare una videocamera che possiede una funzione di zoom alto con funzionalità a infrarossi per ottimizzare le riprese in un ambiente a basso lux. Mettere a fuoco la fotocamera sul contenitore allargando l'immagine in modo che i topi vengono visualizzati in tutta la scatola.
- Coprire l'intero pavimento della scatola con biancheria da letto di segatura (dovrebbe essere circa 1 cm di profondità).
3 Procedura di test
- Posizionare una coppia intra-ceppo di topi (BTBR - BTBR o B6-B6) all'interno della custodia di test.
- Spegnere le luci in sala prove.
- Avviare la videocamera per registrare e uscire dalla stanza. Ciò impedirà sperimentatore influenza sul comportamento dei topi. Registrare l'attività per 11 min.
- Una volta che la registrazione è completa, ri-entrare nella sala prove e restituire i topi nelle loro gabbie a casa originali.
- Smaltire la biancheria da letto segatura, lavare l'intera scatola di prova con il 70% di etanolo, e inserire nuovi letti segatura sul fondo dei testcustodia.
- Ripetere l'intera procedura per il resto delle coppie intra-macchia e restituire i topi nelle loro gabbie a casa originali.
Nota: Per verificare l'affidabilità dei dati inchworming, la procedura può essere ripetuta nei giorni successivi con diverse BTBR-BTBR e combinazioni di coppie B6-B6. Questo farà sì che il comportamento osservato non dipende dal partner specifico nel contenitore, ma l'individuo inchworming.
4. Analisi dei dati
- Inchworming è definito come il movimento sincrono verso l'interno e verso l'esterno delle anteriori e posteriori-piedi dell'animale, con un minimo di un co-occorrenti verso l'interno e quindi conseguente movimento verso l'esterno che sposta in modo efficace la biancheria da letto. Guardare manualmente e segnare due volte (una volta per ciascun topo) I video di accertare la durata totale, frequenza, e la latenza di inchworm nel video 10 min. Scoring manuale di inchworming durata, frequenza e la latenza dovrebbe essere basata sul seguitoing definizioni:
Durata Inchworming: è definito come il tempo totale di ogni mouse spende impegnato nel comportamento inchworming. Per segnare questo aspetto della inchworming, utilizzare un timer che può essere avviato e fermato. Avviare tempi quando il mouse comincia a inchworm e fermare il timer quando il mouse si ferma inchworming. Quando e se il mouse comincia a inchworm di nuovo, re-start e ri-arrestare il timer. Ripetere l'avvio e l'arresto del timer per la durata del periodo di osservazione di 10 minuti ogni volta i inchworms mouse. Questo genererà un punteggio durata inchworming che è 0:00-10:00 min.
Inchworming Frequenza: è definito come il numero di volte che il topo impegna nel comportamento inchworming nel periodo di osservazione di 10 min. Un unico conteggio viene assegnato a ogni avvio del mouse e arresti inchworming. Il punteggio frequenza inchworming sarà un numero compreso tra 0 e ∞.
Latenza di Inchworm: è definito come il tempo esimoa passa prima della prima insorgenza di inchworming. Avviare il timer quando il video inizia, questa sarà 0:00, e fermare il timer quando il inchworms del mouse per la prima volta. Se il mouse non visualizza il comportamento inchworming la latenza di inchworm sarà alle 10:00. Quando si analizza la latenza di Bruco, si otterrà un punteggio 0:01-10:00 min. I topi che non riescono a inchworm per la durata del periodo di prova devono essere rimossi dalla popolazione campione per assicurarsi che i risultati sono pertinenti ad una popolazione di topi che mostrano il comportamento inchworming. - Calcolare la frequenza e la durata totale di inchworming per ciascun topo nel video. Calcolare il tempo richiesto per il primo mouse nella coppia di inchworm per la latenza di inchworm per quella specifica coppia di topi. Questi parametri sono basati sul lavoro metodologico prima correlate a comportamenti scavo ripetitivi nei topi 6.
- Calcolare la durata media, frequenza,e la latenza di scavare per ogni gruppo sperimentale nell'analisi (cioè BTBR vs B6). Utilizzare un ANOVA o t-test per confrontare i dati tra ceppi / gruppi sperimentali.
Nota: Al termine della procedura viene completata in un secondo giorno, utilizzare un ripetute misure ANOVA per garantire che non vi sono stati effetti processuali conseguenti o effetti di accoppiamento.
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Risultati
La versione modificata del test di gioco minorile qui descritto può essere usato per osservare e analizzare il romanzo comportamento scavo ripetitivo definito inchworming. Inchworming è esposta ad una misura molto maggiore dai topi BTBR rispetto ai controlli B6. In una tipica sessione di 10 minuti, i topi BTBR visualizzerà il comportamento inchworming distinto (sincrono verso l'interno e verso l'esterno il movimento delle zampe, nel tentativo di spostare la biancheria da letto segatura) per circa 5 minuti, o la ...
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Discussione
Inchworming è una misura romanzo di comportamento ripetitivo che può essere usato per studiare molti disturbi che presentano stereotypies come ASD. Ci sono 4 passi che sono di importanza cruciale per la generazione di dati inchworming attendibili dal protocollo di interazione sociale giovanile modificato: 1) il periodo di isolamento prolungato è essenziale per il test inchworming e non deve essere rimosso dal protocollo o abbreviato. Questo requisito è specifico per il test di inchworming a coppie qui descritti. 2) La v...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati per l'assistenza tecnica e logistica e l'esperienza fornita da Rose Tobias, Younghee Ahn, e David N. Ruskin. Il lavoro qui descritto è stato finanziato dalla Fondazione dell'Ospedale Pediatrico di Alberta e Hospital Research Institute Pediatrico di Alberta.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 30 cm X 30 cm Scatola in plexiglas con coperchio | Può essere costruito | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Trova una telecamera con funzionalità di alta risoluzione e zoom |
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| Segatura | Come il materiale della biancheria da letto |
Riferimenti
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- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
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