Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X

Sommario

Questo documento descrive l'applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.

Abstract

In questo articolo vengono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure quantitative di contenuti elementale intracellulare utilizzando la tecnica conosciuta come sonda di elettroni microanalisi (EPMA). Calcio intramitocondriale è una particolare attenzione per il ruolo fondamentale che il sovraccarico di calcio mitocondriale svolge nelle malattie neurodegenerative. Il metodo si basa sull'analisi dei raggi X generato in un microscopio elettronico (EM) per interazione di un fascio di elettroni con il campione. Al fine di mantenere la distribuzione nativo di elementi diffusibili in campioni di microscopia elettronica, EPMA richiede "cryofixation" del tessuto seguita dalla preparazione di criosezioni ultrasottili. Rapido congelamento delle cellule in coltura o colture fetta organotipica viene effettuata da tuffo congelamento in etano liquido o sbattere congelamento contro un blocco metallico freddo, rispettivamente. Criosezioni nominalmente spessore 80 nm sono tagliati a secco con un coltello di diamante a ca. -16076, C, montato su carbonio / griglie di rame pioloform rivestite, e cryotransferred in un Cryo-EM utilizzando un supporto cryospecimen specializzato. Dopo l'indagine visiva e mappatura posizione a ≤ -160 ° C e bassa dose di elettroni, criosezioni congelati-idrato sono liofilizzati a -100 ° C per ~ 30 min. Immagini a livello organello di criosezioni secchi sono registrati, anche a basse dosi, per mezzo di una telecamera CCD a lenta scansione e regioni subcellulari di interesse selezionato per l'analisi. Raggi X emessi da ROI da una, concentrata, sonda di elettroni ad alta intensità stazionaria vengono raccolti da un raggi X a dispersione di energia (EDX) spettrometro, elaborato da elettronica associata, e presentata come spettro ai raggi X, cioè un appezzamento di intensità dei raggi X vs energia. Software aggiuntivo facilita: 1) l'identificazione di componenti elementari dai loro "caratteristici" energie di picco e di impronte digitali, e 2) analisi quantitativa per estrazione delle aree dei picchi / sfondo. Questo documento si conclude con due esempi che illustrano tipiciApplicazioni EPMA, uno in cui l'analisi di calcio mitocondriale disponibile una visione critica dei meccanismi di danno excitotoxic e un altro che rivelavano la base della resistenza ischemia.

Introduzione

Gli ioni calcio sono senza dubbio l'entità segnalazione cellulare più importante e versatile in biologia, gioca un ruolo fondamentale nei processi normali diversi come trasmissione sinaptica e l'espressione genica. D'altra parte, il calcio è ugualmente importante nella morte cellulare. In particolare, la deregolamentazione calcio è un fattore chiave nel danno neuronale in ictus, Parkinson, Alzheimer e altre malattie neurodegenerative ^3,5. Pertanto, è estremamente importante capire quantitativamente come calcio è distribuito all'interno delle cellule, e come questo cambia seguente stimoli fisiologici o patofisiologici. Questo obiettivo è complicato dal fatto che il calcio è distribuita dinamicamente tra due stati fisici - liberi in soluzione o legato ad un substrato - e che le concentrazioni di calcio cellulare commutati diversi ordini di grandezza a seguito di stimolazione.

Mentre ci sono diverse metodologie avanzate disponibili per l'analisi di free calcio intracellulare, la determinazione delle concentrazioni di calcio totale in compartimenti intracellulari definiti è realisticamente limitata ad un approccio, cioè, elettrone sonda microanalisi (EPMA). EPMA è una tecnica che le coppie uno spettrometro a raggi X di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La pistola TEM elettronico si concentra una sonda elettronica submicronico fermo su una regione subcellulare di interesse e raggi X specifici degli elementi emessi a seguito del bombardamento di elettroni sono raccolti e analizzati (vedi riferimenti ^{7, 4} per dettagliate recensioni tecnici). I vantaggi di EPMA sono sola risoluzione a livello di organelli e sensibilità submillimolar. In pratica, tuttavia, richiede EPMA cryotechniques specializzati e strumentazione per la preparazione dei campioni e analisi. Qui sono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure di calcio intracellulare mediante EPMA. Calcio intramitocondriale è di i particolarinterest sul conto del ruolo fondamentale che gioca mitocondriali sovraccarico di calcio nelle malattie neurodegenerative.

Protocollo

L'approccio qui descritto è stato sviluppato utilizzando strumenti specifici, strumenti e software. Dato che i laboratori non utilizzano lo stesso setup sperimentale l'approccio è generalizzata, ove possibile.

1. Congelamento rapido

Il metodo analitico descritto è assolutamente dipendente approcci criogenici per: 1) il "cryofixation" di cellule o tessuti in modo da preservare quantitativamente la distribuzione dei componenti del tessuto diffusibili e degli elementi chimici come erano in cellule vive nell'istante di congelamento e 2) la preparazione degli ultraleggeri criosezioni adatto per l'imaging e analisi in un TEM. Queste tecniche sono brevemente descritti, ma i dettagli necessari a riprodurre tali procedure in altri laboratori sono oltre la portata di questo articolo. I lettori interessati sono indicati eccellenti articoli recenti ^9,14.

Attenzione: Questa sezione descrive l'uso di sapone liquidetano efied, che è altamente infiammabile ed esplosiva, devono essere prese le opportune precauzioni. L'operatore deve anche avere familiarità con azoto liquido (LN ₂₎ precauzioni di sicurezza, tra cui protezione da laboratorio camice, occhiali e guanti cryoresistant. Nota: Qui e in tutto, tutti gli strumenti (pinze, ecc) utilizzati per gestire i campioni congelati devono essere pre-raffreddata in LN ₂ prima dell'uso per evitare lo scongelamento accidentale.

Cellule coltivate su vetrini

1. Preparare un dispositivo congelamento tuffo condensando etano gassoso a -160 ° C in LN _{2-raffreddato} pozzetto centrale. Riempire fino al segno e coprire il pozzo con il coperchio di alluminio basculante quando non in uso.
2. Utilizzando cunei di carta da filtro, macchia lamelle di plastica di cellule coltivate in sperimentalmente condizioni adeguate per un film acquoso sottile. Tamponare dal bordo in modo da non toccare il tessuto, la pellicola residua ideale, determinato per tentativi ed errori, è il più sottile possibile, ma non così thcome evaporare e permettere l'essiccazione della superficie del tessuto.
3. Tenendo il vetrino per il bordo con una pinza di serraggio, immergere subito in etano liquido, manualmente o utilizzando lo stantuffo-gravità alimentati.
4. Posizionare il vetrino congelato in una ciotola polistirolo nelle vicinanze di LN _2, grande abbastanza per manipolare il numero desiderato di vetrini in contenitori di stoccaggio a lungo termine. Barattoli con tappo a vite di alluminio che non colgono sotto LN ₂ sono raccomandati.

Congelamento rapido di fette di cervello in coltura

5. Sotto un microscopio da dissezione, vista e orientare una fetta dell'ippocampo organotipica, indisturbato e ancora attaccato alla membrana inserto cultura. Posizionare punti di riferimento sulla membrana vicino al bordo della fetta con una penna Sharpie tipo nero e fotografia.
6. Sempre sotto il microscopio, tagliare ca. 5 x 5 millimetri quadrati di membrana con le singole sezioni incentrate sulle piazze. Evitare di toccare la fetta o piegare il membrane.
7. Montare una fetta membrana sostenuta, ammortizzato da un ¼ in rilievo diametro agar, su un disco in alluminio progettata su misura per adattarsi a una cryoultramicrotome (descritto di seguito). Rapidamente congelare la fetta da pneumaticamente propulsione contro un blocco di zaffiro LN _{2-raffreddato} per mezzo di un dispositivo personalizzato "sbattere di congelamento".
8. Sposta in memoria come descritto per cellule in coltura.

2. Criosezionamento

CAVEAT: produrre con successo nastri secco taglio di sezioni ultrasottili, mentre la semplice e logica, richiede una formazione, pazienza e una notevole pratica.

1. Cuocere un cryoultramicrotome dotato di cryoattachment e raffreddare a -135 ° C.
2. Tagliare coprioggetto congelati in ca. 3 x 3 millimetri quadrati con un forte, bisturi preraffreddato. Incorporare pezzi con culture rivolta verso l'alto in un liquido viscoso "cryoglue" (a 1:06 miscela di etanolo e 2-propanolo ^11), sullo standard 3mm perni in alluminio di diametro progettato per adattarsi mandrino provino microtomo. Evitare perdite cryoglue sulla superficie cultura. Solidificare cryoglue abbassando la temperatura cryobox a ≤ -160 ° C.
   • Per sezioni di cervello congelati, fissare saldamente dischi direttamente ad un esemplare mandrino su misura per mezzo di una ghiera filettata.
3. Trim aree selezionate dei campioni congelati - ad esempio, spazi ricchi di cellule di pezzi coprioggetto o aree individuate di fette - un ca. Blocco 250 x 250 micron viso e ~ 100 micron di profondità utilizzando un utensile diamantato taglio.
4. Nastri secco taglio di sezioni sottili a ca. -160 ° C utilizzando un diamante cryoknife 35 °, essenzialmente come descritto nel referencs ^{4, 9.} Velocità di taglio e coltello angolo di spoglia sono determinati empiricamente, un buon punto di partenza è 0,4-0,6 mm / sec a 9 °. Lo spessore nominale, cioè esemplare anticipo, di sezioni idratati is tipicamente 80 nm, sebbene sezioni sono in realtà 1.5-2.0x spessa, principalmente a causa della compressione. Per sezionamento soddisfacenti, un dispositivo antistatico è essenziale. Posizionare la punta ionizzante dei dispositivi di 0,5-1 cm dal bordo coltello e regolare la potenza di uscita fino a quando si producono nastri soddisfacenti sezioni.
5. Preparare le sonde ciglia per incollaggio (con resina epossidica) ciglia legno stick applicatori. Utilizzando tale sonda, pick up e trasferimento sezioni dal retro del coltello Onto, film di sostegno pioloform carbonio rivestite glow-scarica espressi oltre 100 maglie griglie di rame piegatura e di riposo su un indio busta mezzo foglio ripiegato su una mensola di lavoro alle spalle il coltello. Ripiegare la metà superiore della griglia e busta, stampa con uno strumento di spremitura a freddo.
6. Trasferimento griglie avvolto ad una casella della griglia comoda e conservare in un alluminio possono come descritto al punto 1.4.

3. Cryotransfer dei campioni al microscopio elettronico

Lo strumento di base per EPMAin questo laboratorio è un microscopio elettronico analitica operati a 120 kV e attrezzato per cryomicroscopy, cioè, progettato con un aspirapolvere, campione-zona anticontaminator, una fotocamera digitale 2k x 2k alta sensibilità e titolare cryotransfer campione. Controllare in anticipo l'allineamento microscopio e condizioni di funzionamento in entrambe le modalità a basso e ad alto ingrandimento e confermare una colonna sotto vuoto soddisfacente, idealmente ≤ 10 ^-7 Torr. Tune up, se necessario.

1. Verificare che l'isolamento sotto vuoto del componente Dewar del cryoholder è soddisfacente. Pompa, se necessario.
2. Raffreddare il cryoholder alla sua temperatura minima, almeno -160 ° C, mentre sotto alto vuoto all'interno del portaoggetti, scollegare il cavo di collegamento al detentore di sua scatola di controllo. Inclinare il goniometro di 45 ° in senso orario prima di rimuovere il supporto per ridurre al minimo LN ₂ spargimento sulle superfici dell'operatore e del microscopio.
3. Preparare la cryoworkstation banco raffreddando il insulate integraled coppa a ≤ 160 ° C.
4. Transfer (quickly!) il cryoholder raffreddato da microscopio per crio workstation. Ritrarre scudo gelo del titolare.
5. Recupera sotto LN _2, un panino griglia di stoccaggio e posto sul tavolo di lavoro del cryoworkstation. Un anello di arresto per pozzetto del titolare è anche posto sul tavolo.
6. Aprire la busta indio e spostare la griglia pieghevole allegato al pozzo esemplare di cryoholder. Fissare la griglia con anello di sicurezza utilizzando lo strumento chiave in dotazione e chiudere lo scudo gelo.
7. Rimuovere rapidamente il cryoholder dal cryoworkstation e inserire nella camera d'equilibrio del microscopio e passare attraverso la sequenza di pompaggio più rapidamente possibile. Sull'inserimento, ci dovrebbe essere il minimo disturbo del vuoto colonna.
8. Goniometro Ritorna a 0 ° di inclinazione. Riconnettersi e ricaricarsi la scatola di controllo e verificare che la temperatura del campione è ≤ 150 ° C.
9. Riempire il Dewar deldel campione titolare e permettono vuoto e temperatura a recuperare pienamente.

4. Indagine visiva delle sezioni

1. Ritrarre lo scudo gelo del titolare di esporre campioni e accendere il fascio di elettroni.
2. Visivamente valutare il campione a basso ingrandimento, tipicamente 250X, e scarsa illuminazione. Come illustrato nella Figura 1, sezioni devono essere sottile e liscia, non piegata o sovrapposte, piana e ben attaccato alla pellicola di supporto, e generalmente non oscurata da sbarre di griglia.
3. Facoltativamente fotografare sezioni selezionate. (NOTA: Ridurre al minimo l'esposizione del fascio, in quanto sezioni congelate-idrato sono molto sensibili ai danni fascio-indotta.) Utilizzare il palco goniometro digitale automatizzati atti a memorizzare le coordinate delle sezioni selezionate.

5. Liofilizzazione delle sezioni

1. Liofilizzare sezioni aumentando la temperatura detentore di ca. -100 ° C per ~ 30 min.
2. Recool detentore di -160 ° C o al di sotto.
3. Prima di imaging, spegnere centralina cryoholder e cavo del controller fisicamente disconnessione per evitare la deriva immagine a causa di cicli termici e / o pick-up vibrazione.

6. Imaging di cellule e gli organelli

Immagini strutturali delle sezioni liofilizzati sono ottenuti a ca. -160 ° C a basso dosaggio, immagini di zero-perdita registrata digitalmente utilizzando una camera CCD slow-scan 2k x 2k controllato dal software appropriato.

1. Attivare la EM in modalità hi-mag.
2. Scegli e immagini a ~ 2.000 X (come TIFF, vedi figura 2) celle selezionate e le aree subcellulare di interesse nelle sezioni di alta qualità, le cui riprese sono stati precedentemente registrato e memorizzato. (NOTA: Le sezioni secche sono ora sostanzialmente meno fragile e meno suscettibile ai danni di elettroni fascio.
3. Valutare le immagini al fine di selezionare le regioni di interesse (ROI) per l'analisi a raggi X. Questo passaggio può facoltativamente essere effettuata fuori linea, nel qual caso l'EM può essere attivataoff e il campione lasciata riscaldare a temperatura ambiente.

7. Acquisizione di raggi X Spectra

Spettri a raggi X può essere registrato utilizzando uno dei vari commerciali o progettati su misura a raggi X sistemi di analisi minimamente costituiti da un raggi X (EDX) rilevatore di energia dispersiva, associate elettronica pulse-processore e l'acquisizione e la visualizzazione software compatibile. (Il sistema utilizzato in questo laboratorio è descritto nella Tabella 1.)

1. Configurare EM per l'acquisizione radiografica inserendo il rilevatore EDX nella colonna (se necessario), ritirando l'apertura dell'obiettivo, e l'inserimento di centraggio e le aperture radiazione diffusa. Regolare il cryoholder alla temperatura più bassa alla quale si evita la contaminazione gelo del campione, ma almeno sotto -100 ° C.
2. Inclinare il supporto 20 ° verso il rivelatore.
3. In condizioni di imaging a grande campo, e supponendo si intende analizzare la matrice di un individual mitocondri, scegliere un mitocondrio per l'analisi, si sposta al centro del campo e concentrarsi.
4. Passare alla modalità spot (su alcuni microscopi appena convergere il fascio utilizzando secondo fuoco condensatore) e aumentare la corrente di fascio di ca. 3 nA (come misurato con una tazza Faraday o simili) in un punto 100 nm.
5. Avviare il software di acquisizione dello spettro e iniziare a 100 acquisizioni sec, che possono essere visualizzati volta in diretta sul monitor. Salvare spettro registrato (Figura 2). Il formato EMSA standard del settore è preferito.
6. Arrestare il EM e trasferire il file di più spettri (s) a una (offline) workstation analisi.

8. Analisi di raggi X Spectra

Analisi qualitativa

Uno spettro EDX (Figura 2, nel riquadro) è essenzialmente un grafico xy dell'intensità dei raggi X vs energia. Spectra contengono informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare di tanalizzava il volume, in quanto l'energia "caratteristica" di un picco identifica l'elemento generatore che picco mentre l'intensità riflette la quantità di tale elemento. I picchi caratteristici corsa su di uno sfondo lentamente variabile, "continuo". (La legenda alla Figura 2 illustra ulteriori dettagli salienti di spettri EDX.) L'energia dei collettori di picco per l'intera tabella periodica sono definiti dalla nota struttura elettronica di elementi, quindi tutti i collegamenti software EDX a un database che identifica automaticamente i componenti di un analita. In un contesto fisiologico, elementi di interesse generale che ben si adattano ad analisi EDX includono Na (K _α a 1.04 keV), P (2.01 keV), K (3.31 keV) e Ca (3,69 keV).

1. Approfittate del database del software disponibile e le routine di picco corrispondente a individuare i principali elementi spettri. In un campione biologico si aspetterebbe di trovare i picchi di Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca. (ATTENZIONE:Gli ultimi due elementi si sovrappongono!)

Analisi quantitativa

L'analisi quantitativa degli spettri EDX consiste nell'estrarre l'area integrata di picchi identificati e convertire questo valore per una concentrazione. Per l'analisi biologica, l'approccio determinato rappresenta il metodo picco / continuo Sala ^4,7,10, che sfrutta il fatto che l'intensità del continuum (sopra definito e in Figura 2) è proporzionale alla massa secca del volume analizzato . Così, il rapporto di picco zona zona / continuo, rispetto allo stesso rapporto in spettri di standard di composizione nota, specifica la concentrazione nel compartimento cellulare mirato. Si noti che questo approccio fornisce concentrazioni in moli per unità di peso, tipicamente espressi come mmol / kg di peso secco. Questa unità è inusuale e di interpretazione può richiedere ulteriore conversione, ad esempio, mmol / L peso umido o mmol / mg di proteina, come descritto ELsewhere ^4,10.

2. Estrarre aree dei picchi (e le stime di errore) di elementi biologici tra Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), cioè Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, utilizzando una delle routine di montaggio integrato nel software di analisi (vedi Tabella 1, in particolare nota 4). Questo laboratorio utilizza Simplex o multiple-minimi quadrati. Si noti che questo raccordo richiede particolare attenzione per risolvere la sovrapposizione tra K e Ca picchi (vedi figura 2).
3. Integrare il continuum tra 1,45-1,61 keV. Regioni libere da interferenze alternativi possono essere utilizzati.
4. Calcola rapporti picco / continui e poi concentrazioni rispetto agli standard. Propagare errori durante l'analisi.
5. Utilizzare il software statistico standard e le formule per stimare le medie che riflettono la variabilità biologica.

Risultati

Le cellule cerebrali tipicamente lesioni alle eccitotossico a seguito del rilascio di neurotrasmettitore patologica che si verifica in condizioni ischemiche. EPMA è stato fondamentale per scoprire come la capacità dei mitocondri neuronali di sequestrare enormi quantità di calcio è alla base del meccanismo di lesione. Il microscopio elettronico in Figura 3 illustra l'aspetto di mitocondri in criosezioni liofilizzati di neuroni ippocampali rapidamente congelati dopo 30 minuti di esposizione ad uno stimolo...

Discussione

La base microscopio-analitiche elettrone qui presentato permette l'individuazione, l'identificazione e la quantificazione di diversi elementi di interesse biologico, compresi Na, K, P, e soprattutto Ca. Queste analisi possono essere effettuate a subcellulare, cioè, intra-organello, risoluzione a causa della capacità di localizzare e identificare le strutture di interesse in immagini di alta qualità di criosezioni preparati da campioni congelati rapidamente. Si noti che nessuna colorazione è tenuto a reg...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS/MATERIALS
Thermoanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Inserti di coltura	BD Falcon	353090	Per piastre a 6 pozzetti
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Applicatori in legno scanalato
	EM Sciences	72300
Griglie EM pieghevoli	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Foglio di indio	Alfa Aesar	13982	0,25 mm di spessore
EQUIPMENT
Dispositivo di congelamento a tuffo	Leica Microsystems	KF-80
Dispositivo di congelamento a tuffo	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment per microtomo	Leica Microsystems	FC6
Strumento di criotrim in diamante	Diatome	Cryotrim 45
Cryoknife in diamante	Diatome	Cryo 35
Dispositivo antistatico	Diatome	Hauf Static Line
Cryo microscopio elettronico	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
Portacampioni criogenico EM	Gatan	CT3500
Telecamera CCD a scansione lenta, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Software di acquisizione delle immagini	Olympus SIS	iTEM suite
ED rivelatore di raggi X Oxford	Instruments	Linksystem Pentafet
Processore di impulsi	Instruments	PCI XP-3
scheda	4pi Systems	Spectral Engine II
Computer desktop	Apple	Qualsiasi modello
analisi a raggi X	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
Il CF100 non è più venduto in commercio, sebbene la macchina sia disponibile in molte strutture accademiche, e macchine complete o parti possono essere trovate on-line. Un video tutorial per il supporto per criotrasferimento CT3500 è disponibile all'indirizzo http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. Il SEII è obsoleto; l'Universal Spectral Engine È un prodotto successivo, compatibile con PC con funzionalità comparabili. 4pi ha cessato la produzione e la vendita, ma continua a fornire assistenza tecnica ai clienti. I sistemi usati si trovano spesso online. Il DTSA originale è ormai obsoleto. Il NIST offre nel pubblico dominio un successore aggiornato, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

Oxford Backplane compatibile con OS9 Software di