Questo metodo descrive l'uso di chimica di clic per misurare le variazioni di trascrizione della cellula ospite dopo l'infezione con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12. I risultati possono essere visualizzati qualitativamente tramite microscopia a fluorescenza o ottenuti quantitativamente mediante citometria a flusso. Questo metodo è adattabile per l'uso con altri virus.
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Articolo metodologico
Utilizzando Clicca Chimica per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti virus a RNA sono evoluti la capacità di inibire la trascrizione cellula ospite come mezzo per aggirare difese cellulari. Per lo studio di questi virus, è quindi importante avere un modo rapido e affidabile di misurazione dell'attività trascrizionale nelle cellule infette. Tradizionalmente, la trascrizione è stata misurata mediante incorporazione di nucleotidi radioattivi come 3 H-uridina seguita da rilevamento mediante autoradiografia o conteggio a scintillazione, o incorporazione di uridina analoghi alogenati come il 5-bromouridine (BRU), seguita da rilevamento mediante immunoistochimica. L'uso di isotopi radioattivi, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e non è praticabile in una serie di impostazioni di laboratorio, mentre il rilevamento di Bru può essere ingombrante e può soffrire di bassa sensibilità.
La chimica click recentemente sviluppato, che comporta una formazione triazolo rame-catalizzata da una azide e un alchino, fornisce ora una rapida e highly alternativa sensibili a questi due metodi. Clicca chimica è un processo in due fasi, in cui l'RNA nascente è prima etichettato per incorporazione di uridina analogico 5 ethynyluridine (UE), seguita dalla rilevazione del marchio con una azide fluorescente. Questi azidi sono disponibili come diversi fluorofori differenti, permettendo una vasta gamma di opzioni per la visualizzazione.
Questo protocollo descrive un metodo per misurare la soppressione trascrizionale in cellule infettate con il virus della febbre della valle del Rift (RVFV) ceppo MP-12 utilizzando clic chimica. Contemporaneamente, espressione di proteine virali in queste cellule è determinata dalla classica immunocolorazione intracellulare. Passaggi da 1 a 4 dettaglio un metodo per visualizzare la soppressione trascrizionale tramite microscopia a fluorescenza, mentre i passaggi da 5 a 8 dettaglio un metodo per quantificare la soppressione trascrizionale tramite citometria a flusso. Questo protocollo è facilmente adattabile per l'uso con altri virus.
Introduzione
Tradizionalmente, l'attività trascrizionale è stata misurata attraverso l'inserimento di una radioattivo (3 H-uridina) 1 o alogenati (BRU) 2 nucleosidi in RNA nascenti. Questi analoghi uridina vengono assorbiti dalle cellule, convertiti in uridina-trifosfato (UTP) attraverso la via di recupero nucleoside, e successivamente incorporate nella nuova sintesi dell'RNA. 3 H-uridina possono essere rilevati mediante autoradiografia, che può richiedere molto tempo, o scintillazione conteggio, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, l'uso di isotopi radioattivi non può essere pratico in una serie di im....
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Protocollo
Analisi della trascrizione mediante microscopia a fluorescenza
1. Infettare le cellule con MP-12 e Label RNA nascenti con UE
- Luogo di 12 mm coprioggetto rotondi in 12 pozzetti coltura tissutale, un coprioggetto per pozzetto.
Nota: se le cellule hanno difficoltà aderendo al coprioggetto, cappotto con poli-L-lisina (MW ≥ 70.000) prima di mettere in pozzi. A tale scopo, coprioggetto sommergere in una soluzione sterile 0,1 mg / ml in H 2 O di poli-L-lisina per 5 min. Risciacquare con coprioggetto sterili H 2 O e asciugare per almeno 2 ore.
- ....
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Risultati
La proteina di NSS RVFV (famiglia Bunyaviridae, genere Phlebovirus) 11 inibisce la cellula ospite trascrizione generale attraverso due meccanismi distinti: (i) sequestrando la subunità p44 del fattore di trascrizione basale TFIIH 11 e (ii), promuovendo la degradazione proteasoma della p62 subunità di TFIIH 6. Il RVFV MP-12 vaccino ceppo 13 è stato utilizzato per gli esperimenti descritti in questo protocollo da MP-12 ceppo può essere gestita in un livello 2 l.......
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Discussione
Il protocollo fornito descrive un metodo per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla trascrizione cellula ospite mediante incorporazione della uridina analogico UE in RNA nascenti. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti: è veloce, sensibile, e non si basa sull'impiego di isotopi radioattivi. Inoltre, il metodo può essere adattato per produrre dati qualitativi tramite microscopia a fluorescenza o dati quantitativi tramite citometria a flusso utilizzando essenzialmente gli stess.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo RB Tesh per fornire il mouse policlonale anti-RVFV antisiero e M. Griffin del UTMB Citometria a Flusso Nucleo Struttura per un aiuto con la citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da 5 U54 AI057156 attraverso l'occidentale Centro Regionale di Eccellenza, NIH R01 AI08764301, e il finanziamento del Centro per lo Sviluppo Sealy Vaccino a UTMB.BK è stato sostenuto dalla James W. McLaughlin Fellowship Fund presso UTMB.OL è stato sostenuto da un Maurice R. Hilleman fase iniziale di carriera Career Investigator Award.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-etinil-uridina | Berry Associates | PY 7563 | si dissolve in DMSO per 100 mM di stock |
| 12 mm di coprioggetti rotondi Fisherbrand | 12-545-82 | ||
| Provette di polistirene da 5 ml | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | si dissolve in DMSO per 10 mM di stock |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | si dissolve in H2O per 100 mM di stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | si dissolve in H2O per 5 mg/ml di |
| stock DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| azide fluorescente (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| acido L-ascorbico | Sigma | A-5960 | dissolvere in H2O per 500 mM |
| filtro di carta | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| poli-L-lisina (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | sciogliere in H2O per stock da 1,5 M, pH 8,5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| fluorescenza | es. Citometro | ||
| e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Riferimenti
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine lab....
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Ristampe e permessi
