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Articolo metodologico

Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

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DOI:

10.3791/50816

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31 dicembre 2013

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

In questo articolo

Sommario

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potenziali, famiglia vanilloid, tipo 4) è ampiamente espressa nei tessuti vertebrati ed è attivato da diversi stimoli, tra cui da forze meccaniche. Alcune mutazioni TRPV4 causano complesso osso ereditaria o patologie neuronali umano. Wild-type o mutante TRPV4 transgeni sono comunemente espresse in cellule di mammifero in coltura ed esaminati dalla Fura-2 fluorometria e da elettrodi. In termini di meccanismo mechanosensitivity e le basi molecolari delle malattie, la letteratura attuale è confusa e controversa. Per completare metodi esistenti, si descrivono due metodi aggiuntivi per esaminare le proprietà molecolari di TRPV4. (1) Rat TRPV4 e un transgene aequorina si trasformano in lievito in erba. Uno shock ipo-osmtic della popolazione trasformante produce un segnale luminometrici causa della combinazione di equorina con Ca 2 +, rilasciato attraverso il canale TRPV4. Qui TRPV4 è isolato dai suoi abituali partner di proteine ​​di mammiferie rivela la propria mechanosensitivity. (2) cRNA di TRPV4 viene iniettato in oociti di Xenopus. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la corrente TRPV4 macroscopico viene esaminato con un morsetto di tensione a due elettrodi. L'attuale aumento dopo la rimozione di osmoticum inerti dal bagno ovocita è indicativo di mechanosensitivity. I microampere (10 -6 a 10 -4 A) correnti da ovociti sono molto più grandi rispetto alle subnano-to nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti da cellule in coltura, producendo quantificazioni più chiare e valutazioni più sicuri. Correnti microscopiche che riflettono le attività delle proteine ​​dei singoli canali possono anche essere direttamente registrati sotto una patch clamp, in on-cella o in modalità asportato. Lo stesso ovocita fornisce più campioni di patch, consentendo la replica dei dati migliori. Aspirazioni applicate le patch possono attivare TRPV4 per valutare direttamente mechanosensitivity. Tali metodi dovrebbero anche essere utile nello studio di altri tipi di canali TRP.

Introduzione

TRP (potenziali recettori transitori) comprendono sette sottofamiglie di canali di comunicazione che servono funzioni sensoriali 1,2. Nei mammiferi, TRPV, sottofamiglia vanilloid del TRP, ha sei varietà. TRPV4 (tipo 4) 3,4 risponde al calore, alcune sostanze chimiche, gonfiore osmotico, o shear stress. Il gene TRPV4 stato ripetutamente isolato mediante candidato-gene e / o espressione clonazione 5-8. Quest'ultimo metodo seguito la risposta del prodotto genico di ipo-osmolarità. TRPV4 è espresso in quasi tutti gli organi e le funzioni per lo sviluppo, fisiologia, patologia o di molti tipi di cellule disparate 3,4.

Striking sono le autosomiche dominanti umano mutazioni TRPV4> 50, causando neuropatie periferiche e / o displasie scheletriche (anomalie nello sviluppo scheletrico) 9-11. La gamma di displasie scheletriche da lievi tipo brachyomia 3 (tipo 3 nanismo), displasia spondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasie, alcuni causando la morte neonatale o embrionale. Anche se tutte le maniere di meccanismi sembrano possibili, nessuno spiega la diversità, la complessità, la variabilità e sovrapposizioni occasionali di queste malattie 4.

Come altri canali TRP 1, TRPV4 è un tetramero. Nel ratto o TRPV4 umana, ogni subunità è costituita da 871 residui. Il suo elemento centrale è il sei transmembrana una eliche (S1-S6), che sono probabilmente disposti in un modo simile a K + canali voltaggio-dipendenti. Lì, S1 a S4 formare un dominio periferico e la S5 e S6 formano il dominio permeazione poro. Tra S5 e S6 di TRPV4 è un'elica poro breve seguito dal LDLFKLTIGMGDL sequenza, quattro delle quali presumibilmente convergono per formare il filtro catione. Il 470-residuo N-terminale del segmento citoplasmatico contiene 6 ripetizioni ankyrin, noti per legare le proteine ​​o piccoli ligandi. Il 152-residuo segmento citoplasmatica C-terminale include una sequenza-calmodulina legame tra gli altri possibili siti che legano oti suoi elementi 3.

TRPV4 è un canale cationico che esclude essenzialmente anioni 1. Mentre la sua funzione fisiologica è per trasdurre stimoli a Ca 2 + afflusso, è anche permeabile ai cationi attraverso una sequenza permeabilità Eisenman IV, favorendo bivalente a P Ca: P Na ~ 7 12. Conduttanza monocanale rettifica a ~ 90 pS verso l'esterno e verso l'interno ~ 40 pS 6,13,14. Eterologamente espressa corrente (in basso) può essere attivato da ipo-osmotico gonfiore, sforzo di taglio, o di calore 15. Inoltre è stato attivato da acidi grassi polinsaturi 16,17 e l'estere sintetico phorbal 4αPDD 18. Allo stato attuale, il più potente agonista è GSK1016790A 19 e antagonista è GSK2193874, efficace nel 10 -9 a 10 -8 M 20, entrambi scoperti da alta velocità, schermo piccolo-molecolare.

Due settori chiave della ricerca TRPV4 rimangono confuse: (1) Anche se TRPV4 è ampiamente studiato per la sua mechanosensitivity, la sua base molecolare è controversa. Un modello descrive ipo-osmolarità qualche modo attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) per produrre l'acido grasso polinsaturo (PUFA) acido arachidonico (AA), che viene convertito in acido epoxyeicosatrienoic (TEE) da un epoxygenase, e il legame di EET attiva TRPV4 16, 17. Eppure, TRPV4 si è dimostrato di rispondere direttamente ai membrana tratto 14 (sotto), fornendo una spiegazione più semplice. (2) Le patologie mutanti TRPV4 sono sconcertanti. Alla base, si ha la necessità di sapere se le malattie sono dovute alla perdita, la riduzione o l'aumento di attività di canale. Anche qui, la letteratura è tutt'altro che chiara. Mentre alleli multipli scheletrico-displasia sono stati segnalati per avere attività superiori, (guadagno-di-funzione, GOF) 4,21, vari sono stati segnalati per aver ridotto le attività (perdita-di-funzione, LOF) 10,22. Uno studio sistematico di 14 alleli li ha trovati pertutte le mutazioni essere GOF (sotto) 23. L'affermazione che alcuni sono LOF sembra contraddire il fenotipo di TRPV4-/ - topo knockout, che sono vitali o fertili, con solo piccoli difetti, nonostante una perdita completa della funzione TRPV4.

Una parte di queste polemiche ha origine metodologica. I laboratori usano metodi diversi, o varianti di un metodo, e utilizzano diversi standard di giudizio. Più comunemente, TRPV4 viene transitoriamente espresso in cellule di mammifero in coltura (HEK, CHO, HeLa) e l'ascesa di interno [Ca 2 +] sulla agonista o stimolazione ipotonico è registrato con il colorante fluorescente + sensibile Ca 2, Fura-2. L'eccessivo affidamento su questo test fluorimetrico è stato criticato 1. Il livello di espressione in differenti popolazioni, la distribuzione in esso, nonché la concentrazione di colorante efficace, deve essere controllato e documentato. Più attendibile è esami elettrofisiologici diretti. Anche questo, come commonly praticato, inoltre, non è senza problemi. Poiché i livelli di espressione in cellule coltivate individuali sono difficili da controllare, correnti di cellule intere hanno grandi variazioni. Inoltre, perché le correnti sono piccole, statistiche affidabili dovranno fare affidamento su campioni di grandi dimensioni, spesso non è pratico. Raramente sono stati effettuati gli esami di patch-clamp. Alcune di queste registrazioni mostrano gruppi di scoppi di attività che rendono la valutazione statistica impegnativo 16,17.

Per capire meglio il mechanosensitivity molecolare, abbiamo sviluppato due sistemi aggiuntivi per esaminare TRPV4. (1) Per isolare TRPV4 lontano dai suoi abituali partner di mammiferi, abbiamo espresso ratto TRPV4 in erba lievito 24. Espressione funzionale di TRPV4 in questo contesto evolutivamente distante ha dimostrato che potrebbe ancora rispondere alla forza osmotica senza i suoi abituali partner. Perché il lievito non rilascia acidi grassi polinsaturi come AA o EET, e il suo genoma non ha PLA2 o epoxygenase geni, questa espresSsion dimostra anche che non sono necessari per TRPV4 di percepire la forza. Avere TRPV4 in eucarioti biologicamente più suscettibili molecolari permette anche manipolazioni efficiente avanti o indietro genetici 25. (2) Per le analisi biofisiche di TRPV4 in profondità, abbiamo espresso TRPV4 in ovociti di Xenopus. A differenza delle cellule coltivate, che producono sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) correnti, un ovocita esprime correnti μA di (10 -6 a 10 -4 A). Molto più grande segnale su rumore consente una migliore quantificazione e comparazione più sicuri. TRPV4, così espresso, può anche essere esaminata come singole molecole utilizzando una patch clamp. Un singolo ovocita permette il campionamento di patch ripetuto, ancora una volta rendendo quantificazione più attendibile. Tali studi hanno dimostrato che canale TRPV4 stessa può essere attivata direttamente con la forza membrana tratto 14. Le analisi hanno inoltre dimostrato che 14 rappresentative alleli scheletrico-displasia sono tutte le mutazioni guadagno-di-funzione. Inoltre, il Degree di questa costitutiva Ca 2 + perdite parallelo alla gravità delle malattie scheletriche 23.

A causa della loro novità e l'utilità, le modalità dettagliate di questi due metodi sono riuniti qui per consentire repliche in futuro la ricerca sulle TRPV4 o canali simili.

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Protocollo

1. Metodi di lievito luminometria

Utilizzare ceppo BYYT di Saccharomyces cerevisiae. Si tratta di un yvc1-tok1-derivato di BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trasformare cellule con i-equorina esprimendo pEVP1/Aeq plasmide Leu-selezionabili e ura selezionabili rat--TRPV4 esprimendo plasmide p416GPDV4, come descritto in Batiza et al. 26 e Loukin et al. 24 Con metodi standard di costruzione plasmide e trasformazione 27 . Ceppo di lievito e plasmidi sono disponibili su richiesta.

  1. Cultura 2 ml di cellule di lievito durante la notte a fase post-logaritmica in uno shaker 30 ° C in leu-ura-"DCD" dropout medio 28 (una variante solfato-impoverito del mezzo CMD-leu-ura 29), integrato con 1M sorbitolo . Seminare 200 ml di queste culture in 1,8 ml di mezzo fresco integrato con 2 micron del Luciferin coelenterazina. Crescere al buio a temperatura ambiente per altre 24 ore senza agitare.
  2. Misurare la osmolarità della cultura (tipicamente a 1.400 mOsm) e altre soluzioni (sotto) usando un osmometer pressione di vapore.
  3. Aliquota 20 ml di coltura fresca in un tubo luminometro 12 mm per un singolo luminometro tubo.
  4. Per lo shock ipotonico, aggiungere 200 ml di una soluzione contenente 25 NaEGTA mM (pH 7,2) o nomi (pH 7.2) e 500-100 mM NaCl, (osmolarità totale di 1,200-400 mOsm) a seconda del grado di shock desiderato. Monitorare costantemente la luminescenza prima e almeno 120 secondi dopo la downshock osmotica, interrotta solo dalla breve operazione di diluizione. Registrati uscita luminometer su un computer desktop come unità di luminescenza relativa (RUL).

Anche se non per lo studio di TRPV4 transgenico, abbiamo utilizzato una variante del protocollo di cui sopra in un sistema automatizzato per esaminare le risposte di un gran numero di ceppi di lievito. Studio of risposte alle ipo-30 o iperosmotico 31 stimoli del deletome lievito (la raccolta di 4.906 lievito deletants un singolo gene) usando un luminometro micropiastre e analizzati con il software corrispondente ha avuto successo.

2. e 3. Ovociti Metodi di Elettrofisiologia

Elettrofisiologia utilizza metodi di base 32. PCR amplifica la cornice open-lettura della wild-type o TRPV4 mutante con alta fedeltà PfuUtra polimerasi e integrato nel pGH19 33. Ciò comporta un inserimento preciso della ORF tra i 5 'e 3' UTR del Xenopus β-globina ed a valle di un promotore T7 RNA polimerasi. Linearizzare il costrutto valle UTR in 3 'e usato come modelli in vitro un T7 RNA polimerasi in reazione. Utilizzare tecniche di biologia molecolare standard di 34.

Utilizzare fase V-VI ovociti da X. laevis. Zootecnia, ovariecto parzialela mia, la rimozione busta defolliculation, e vitellina seguire procedure standard 32,33,35. Iniettare 2-40 ng di soluzione di cRNA per ovocita con un microinjector automatico Drummond Nanoinject II. Iniettare ~ 30 ovociti per ciascuna serie di esperimenti. Dopo l'iniezione TRPV4-cRNA, incubare gli ovociti nel medio ND96 con gentamicina (100 ug / ml) e 1 mM rosso rutenio 14.

2. Due elettrodi di tensione morsetto

  1. Tirare borosilicato pipette di registrazione vetro dalla precisione monouso Micropipette 100 microlitri individualmente con un estrattore pipetta.
  2. Pull sia la tensione di misura ed elettrodi pipette correnti-iniezione sono tirato avere un'apertura punta di circa 1 micron di diametro.
  3. Elettrodi recupero informazioni con 2 M KCl conseguente 0,1-0,2 resistenza mW. Li montano sul headstages HS2A, che insieme ad un virtuale di messa a terra clamp bagno VG-2Ax100, sono collegati ad una interfaccia amplificatore GeneClamp 500 attraverso un Digidata 1440 digitalizzatore. Acquisire dati utilizzando il software pClamp10.
  4. Mettere l'ovocita da testare in un bagno di 1 ml in una camera di plastica fabbricato montato sul palco di un microscopio da dissezione con 20X di ingrandimento. La soluzione del bagno è virtuale a terra da un ponte agar 3 M KCl e un filo di argento clorurato collocati in prossimità del ovocita e collegato ad una fase terra virtuale VG-2A.
  5. Costruire la camera di perfusione continua con tubi di plastica come soluzione di ingresso e di uscita. Collegare il tubo di ingresso è collegato ad un sistema di perfusione fabbricato, che è un collettore di sei conchiglie siringa 50 ml, riempiti ognuno con una soluzione differente. Velocità di avanzamento di gravità di qualsiasi soluzione particolare è controllato da ~ 2-3 ml / min con fascette di rampa "Keck" sui tubi.
  6. Montare entrambi gli elettrodi con i loro headstages su micromanipolatori. Eseguire penetrazioni degli elettrodi l'ovocita da micromanipolazione.

3. Patch Clamp Esame della diretta mechanosensitivity

"> I metodi di base di patch clamp compresa la preparazione pipetta, formazione GΩ-sigillo, e la formazione di on-cella o modalità escisse sono quelli in Hamill et al. Conn 36 e 32.

  1. Riempire pipette in vetro borosilicato con una ~ 1 micron apertura del diametro in punta (numero bolla 5-6) con 98 mM KCl, 1 mM MgCl 2, e 10 mM K +-HEPES, pH 7.2.
  2. Fissare la pipetta patch clamp attraverso un tubo di plastica per una siringa da 5 ml e attraverso un giunto a T, anche ad un manometro. Utilizzare un computer per gestire sia l'elettrodo e le uscite manometro. Acquisire dati a 10 kHz, e quindi riprodurre attraverso un filtro a otto poli Bessel a 1 kHz per l'analisi.
  3. Patch differenti possono essere asportati dallo stesso ovocita ripetutamente. Questa pratica rende l'esame delle attività molecolare di TRPV4 più efficiente e affidabile.

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Risultati

In un tipico esperimento luminometria, una serie di 400-1,200 mOsm shock ipotonici non si raggiunge con l'aggiunta di 200 ml di soluzione d'urto di diversa bassa osmolarità a 20 ml di cultura a 1.400 mOsm. L'attività TRPV4 è evidente quando il RLU della disposizione sperimentale è confrontata con quella di due controlli negativi: cellule di lievito trasformate con il plasmide p416GPDV4 vuoto o uno che contiene il gene TRPV4 con una mutazione nel filtro di ioni (Figura 1) 24.

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Discussione

Come indicato nella Premessa, i metodi comunemente usati per studiare le funzioni TRPV4 talvolta portato a incongruenze e controversie. Le due serie di metodi qui descritti offrono alcuni vantaggi e possono integrare i metodi esistenti. Mentre si descrivono solo gli studi sulla TRPV4, i metodi possono essere estesi a studiare altri canali ionici pure.

1. Metodi di lievito luminometria

Lievito in erba ha un nativo di Ca 2 +-risposta afflusso allo shock ip...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Andrea Kremsreiter per l'eccellente assistenza tecnica. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato da NIH GM096088 e Vilas fiducia della University of Wisconsin - Madison.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Osmometro a pressione di vaporeWescor Wescor5500Logan, UT, USA
Luminometro a tubo singolo Sirius Titertek-BerholdSirius Huntsville, LA, USA
Luminometro per micropiastreTitertek-BertholdMithras LB940Huntsville, LA, USA
Software di luminometriaTitertek-BertholdMikroWin2000Huntsville, LA, USA
Patch clamp e softwareAxon InstrumentHS2A headstage, VG-2Ax100 morsetto per vasca virtuale con messa a terra, amplificatore GeneClamp 500, digitalizzatore digidata 1440, software pClamp10Union City, CA, USA
ManometroBio-TecWinooski, VT, USA
Estrattore di pipetteSutter Instrument CoModello P-97Novata, CA, USA
MicroiniettoreDrummond ScientificNanoinject IIBroomall, PA, USA
Luciferina celterazinaInvitrogenCarlsbad, CA, USA
T7 RNA polimerasi reazioneAmbionmMessage mMachineAustin, TX, USA
GentamicinSigma 
Rosso rutenioSigma 
Micropipette Pipette Drummondda 100 microlitriBroomall, PA, USA
PfuUtra polimerasi ad alta fedeltà StratageneLa Jolla, CA, Stati Uniti

Riferimenti

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