Metodo di preparazione delle diapositive per preservare l'architettura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari

Sommario

Il materiale qui descrive un metodo sviluppato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo è stato definito il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). Questo metodo migliora la sensibilità per il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH).

Abstract

Durante la differenziazione testicolare delle cellule germinali, la struttura della cromatina nucleare cambia dinamicamente. Di seguito viene descritto un metodo progettato per preservare la disposizione tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari presenti nei topi; questo metodo è stato definito come il metodo di scorrimento tridimensionale (3D). In questo metodo, i tubuli testicolari vengono trattati direttamente con una fase di permeabilizzazione che rimuove il materiale citoplasmatico, seguito da una fase di fissazione che fissa i materiali nucleari. I tubuli vengono quindi dissociati, la sospensione cellulare è citospun e le cellule aderiscono alle diapositive. Questo metodo migliora la sensibilità verso il rilevamento di strutture subnucleari ed è applicabile per l'immunofluorescenza, il DNA e la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione in situ (FISH) e la combinazione di questi metodi di rilevamento. Come esempio di una possibile applicazione del metodo di scorrimento 3D, viene mostrato un COT-1 RNA FISH per rilevare gli RNA nascenti. Il metodo di scorrimento 3D faciliterà l'esame dettagliato delle relazioni spaziali tra la struttura della cromatina, il DNA e l'RNA durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari.

Introduzione

Nei teste, le cellule germinali si differenziano dalla spermatogonia diploide attraverso la meiosi in spermatozoi maturi e aploidi. Durante questo processo, la struttura della cromatina nucleare delle cellule germinali viene continuamente e dinamicamente rimodellata. Le crepa superficiali sono comunemente utilizzate per l'esame citologico delle singole cellule spermatogeniche. Un metodo prevalente di diffusione superficiale utilizza un trattamento ipotonico con cui le singole cellule spermatogeniche vengono diffuse e appiattite¹. Queste condizioni sono ottimali per l'analisi dettagliata dei cromosomi meiotici. Le caratteristiche cromosomiche come lo stato sinaptico e i focolai di ricombinazione sono facilmente osservabili usando questo metodo. Tuttavia, il trattamento ipotonico interrompe l'architettura della cromatina subnucleare, quindi questa tecnica non è adatta per l'analisi strutturale dei nuclei. Di conseguenza, è stato progettato un metodo migliorato per preservare la struttura tridimensionale della cromatina delle cellule germinali testicolari. Questo metodo è stato definito metodo di scorrimento tridimensionale (3D) (Figura 1). Il metodo di scorrimento 3D ha permesso il rilevamento della nascente localizzazione dell'RNA nei nuclei perché inizialmente è stato ottimizzato per esaminare l'espressione genica e gli stati di cromatina durante la differenziazione delle cellule germinali testicolari mediante ibridazione della fluorescenza dell'RNA in situ (FISH)^2,3. Questo metodo 3D è applicabile anche alla combinazione di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH. Inoltre, questo metodo ha aiutato nella scoperta della cromatina sessuale postmeiotica (PMSC), un compartimento silenzioso dei cromosomi sessuali trovato negli spermatidi postmeiotici².

Il metodo di scorrimento 3D è stato originariamente ottimizzato attraverso la combinazione di due fasi essenziali di preparazione dello scivolo comunemente utilizzate per la colorazione nucleare: la fase di fissazione progettata per fissare i materiali nucleari e la fase di permeabilizzazione destinata a rimuovere i materiali citoplasmatici al fine di migliorare l'accessibilità dei reagenti di colorazione, come anticorpi e sonde FISH. Come descritto in precedenza in^{un'altra pubblicazione 3}, è stato determinato che la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione al fine di ottenere risultati ottimali con basso background citoplasmatico. In questo metodo di scorrimento 3D, la fase di permeabilizzazione e la successiva fase di fissazione vengono eseguite direttamente su tubuli seminiferi e sono seguite dalla dissociazione meccanica delle cellule germinali con forcep prima della citospinning su diapositive. Un metodo alternativo per RNA FISH di cellule spermatogeniche è stato sviluppato in un altro laboratorio⁴. In questo metodo, coerentemente con il metodo 3D, la fase di permeabilizzazione deve precedere la fase di fissazione per ottenere risultati ottimali di RNA FISH.

Il seguente protocollo descrive il metodo di scorrimento 3D e fornisce un esempio di una possibile applicazione, Cot-1 RNA FISH per il rilevamento di RNA nascenti nucleari. Il DNA Cot-1 è costituito da elementi ripetitivi nel genoma. Qui, una sonda del DNA Cot-1 è ibridata ad un introne e a un UTR delle trascrizioni nascenti, rilevando così le regioni trascrittili attive nel nucleo^5,6. Le diapositive 3D sono versatili e possono essere applicate a una combinazione di tecniche di immunofluorescenza, DNA e RNA FISH al fine di ottenere un esame dettagliato delle relazioni spaziali tra l'architettura della cromatina.

Protocollo

1.3D preparazione delle diapositive

1. Preparare i seguenti reagenti:
   1. Tampone CSK: NaCl da 100 mM, saccarosio da 300 mM, tubi da 10 mM, 3 mM MgCl₂. Regolare il pH a 6,8 con 1 M NaOH. Conservare il buffer CSK a 4 °C.
   2. Tampone CSK con 0,5% Tritone X-100: Aggiungere 200 μl di Tritone X-100 a 40 ml di tampone CSK. Mescolare la soluzione utilizzando l'agitatore magnetico fino a quando Triton X-100 non viene completamente sciolto. Conservare il buffer CSK con 0,5% Tritone X-100 a 4 °C.
   3. 4% Paraformaldeide (PFA)–PBS, pH 7.4: Sciogliere 4 g di PFA in circa 70-80 ml di acqua. Per accelerare il processo di dissoluzione, aggiungere circa 20 μl di 4 N NaOH e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua a 60 °C fino a quando la PFA non si è completamente sciolta e la soluzione è trasparente. Questo processo richiede circa 1 ora. Dopo che la PFA si è completamente sciolta, aggiungere 10 ml di 10x PBS. Regolare il volume finale a 100 ml con acqua e raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (25 °C). Utilizzare una soluzione preparata al momento per ogni nuovo esperimento.
      Nota: ottenere l'autorizzazione istituzionale per tutto il lavoro sugli animali e aderire alle linee guida pertinenti per la cura degli animali.
2. Eutanasia dei topi maschi. Usando forcep e forbici, asporta il testicolo dal mouse. Posizionare il testicolo in PBS (o RPMI 1640). Dopo la rimozione del testicolo, eseguire rapidamente i seguenti passaggi 1.3-1.4 al fine di prevenire la degradazione dell'RNA.
3. Rompono il testicolo su una piccola piastra di Petri e tolgono la tunica albuginea. Dipanare i tubuli seminiferi in PBS sul ghiaccio usando le forcep.
4. Utilizzando le forcep, trasferire diversi tubuli (diversi pezzi di tubuli di circa 5-10 mm di lunghezza) in un pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente 500 ml di tampone CSK + 0,5% Tritone X-100 sul ghiaccio e incubare per 6 minuti. La sovraesposizione al buffer CSK può causare l'interruzione delle celle.
5. Utilizzando le forcep, trasferire tutti i tubuli in un unico pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente il 4% di soluzione PFA-PBS. Questo passaggio può essere preformato senza stereomicroscopio, ma opzionalmente può essere utilizzato. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Inizia contemporaneamente a preparare 12 camere di citospino durante i periodi di incubazione.
6. Utilizzando le forcep, trasferire tutti i tubuli in un pozzo di un piatto da 4 pozzetti contenente PBS. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Sul retro di uno scivolo di vetro, trasferire tutti i tubuli in 30 μl di PBS (la parte superiore dello scivolo deve essere evitata a causa della carica cationica). Usando le punte di due forcep, strappare i tubuli a pezzi. Tritare i tubuli in direzione orizzontale ritagliando i tubuli tra le punte di due forcep e tirando le forcep orizzontalmente. Continuare con questo passaggio per circa 10-20 secondi.
8. Mescolare la sospensione tubazione utilizzando una pipetta P20.
9. Trasferire la sospensione su un tubo di microcentrifugo, diluire con PBS a circa 1,3 ml. Applicare 100 μl di sospensione su ciascuna delle 12 camere di citospino (1,2 ml totali). In questo passaggio, la concentrazione di cellule non ha bisogno di essere determinata.
10. Citospin i campioni a 2.000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la citospinizzazione, scivoli asciutti sul banco di laboratorio per alcuni minuti a temperatura ambiente. Dopo che le diapositive sono state autorizzate ad asciugarsi completamente per alcuni minuti, passare al passaggio successivo.
11. Utilizzando un barattolo coplin contenente PBS, lavare gli scivoli per 5 minuti a temperatura ambiente.
12. Trasferire le diapositive in un barattolo di Coplin contenente il 70% di etanolo e attendere almeno 2 minuti prima dell'inizio dell'RNA FISH. Le diapositive sono stabili per alcune settimane con 70% di etanolo a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, disidratare le diapositive utilizzando il trattamento seriale con 80% e 100% di etanolo in barattoli Coplin per 2 minuti ciascuno e asciugare all'aria completamente disidratare le diapositive. Conservare a -80 °C in una slide box.

2. Preparazione della sonda del DNA Cot-1 mediante priming casuale

1. Preparare i seguenti reagenti:
   1. Buffer di ibridazione: Mescolare i componenti in corso per preparare 900 ml di scorta stabilizzatrice di ibridazione; questa soluzione verrà utilizzata per rifornire le sonde. Questa scorta stabilizzatrice di ibridazione consente l'aggiunta del 10% del volume della soluzione inibitore della RNasi (Ribonucleoside Vanadyl Complex) prima dell'ibridazione.

      componente	Importo (μl)	Concentrazione finale
      Formamide	500	50% (v/v)
      50% di Dextran	200	10% (con)
      20x SSC	100	2x
      1% BSA	100	0.1%

      Prima dell'ibridazione, aggiungere 1/10 vol di 200 mM ribonucleoside Vanadyl Complex o acqua alla scorta stabilizzatrice di ibridazione per abbinare la concentrazione finale. A -20 °C, questa miscela è stabile per più di un anno.
   2. 20x SSC: Sciogliere 88,2 g di citrato di sodio e 175,3 g di NaCl in circa 800 ml di acqua. Regolare il pH a 7.0 utilizzando alcune gocce di 1 M HCl. Aggiungere acqua per regolare il volume finale a 1 L. Sterilizzare mediante autoclave. Dopo la preparazione, 20x SSC possono essere conservati a temperatura ambiente.
   3. 50% (w/v) Dextran: Mescolare l'acqua e aggiungere lentamente 50 g di solfato di dextran. Continuare a mescolare durante la notte a temperatura ambiente. Aggiungere acqua per regolare il volume finale a 100 ml. Conservare a temperatura ambiente.
2. Aggiungere i seguenti componenti elencati di seguito a un tubo PCR. Utilizzando una macchina PCR, mescolare e incubare la soluzione per 5 minuti a 95 °C.

   componente	Quantità per reazione (μl)	finale
   DNA Cot-1: 1 mg/ml	1	1 μg
   Primer random 9mer (dal kit)	10
   Acqua	27

3. Centrifugare brevemente e posizionare sul ghiaccio.
4. Aggiungere i componenti seguenti. Mescolare e incubare per 30 min a 37 °C utilizzando una macchina PCR. (Per i dettagli del kit utilizzato si veda la tabella dei reagenti e delle attrezzature).

   componente	Quantità per reazione (μl)	Concentrazione finale
   Miscela preparata a partire dal passaggio 2.2	38
   Tampone nucleotidico 5x (dal kit)	9.2
   Cy3-dUTP (1 mM)	0.8	16 μM
   Klenow (dal kit)	2

5. Aggiungere 2 μl di tampone di arresto (dal kit) per interrompere la reazione.
6. Purificare la reazione interrotta utilizzando colonne di microspin.
7. Aggiungere 50 μg (5 μl) di DNA dello sperma di aringa (50 volte superiore al DNA del modello Cot-1) alla frazione purificata.
8. Misurare il volume totale utilizzando una pipetta. Aggiungere 0,7x volume di etanolo al 100% e volume 0,1x di acetato di sodio 3 M (pH 5.2), mescolare bene e centrifugare per 15 minuti alla velocità massima (17.000 x g) utilizzando un microcentrifugo a 4 °C.
9. Rimuovere il liquido e aggiungere 200 μl di etanolo al 70%, mescolare bene e centrifugare per 5 minuti alla velocità massima a 4 °C.
10. Rimuovere il liquido in eccesso. Asciugare il precipitato per 10-30 minuti a temperatura ambiente.
11. Sciogliere il pellet in 20 μl di scorta stabilizzatrice di ibridazione. Poiché il pellet è spesso difficile da sciogliere, pipettare ripetutamente. Come opzione alternativa, un miscelatore a vortice può anche essere utilizzato per sciogliere in modo efficiente il pellet. Le sonde possono essere mantenute a -20 °C fino all'uso.

3. Cot-1 RNA FISH

1. Aggiungere i componenti elencati di seguito a un tubo PCR. Utilizzando una macchina PCR, incubare per 10 min a 80 °C, seguito da una fase di preannealizzazione di circa 10-30 min a 42 °C. Conservare a 42 °C fino all'ibridazione. Ribonucleoside Vanadyl Complex è facoltativo; può essere sostituito con acqua.

   componente	Quantità per reazione (μl)	finale
   Sonda A DNA Cot-1 (50 ng/μl)	2	100 ng
   Complesso Di Vanadyl Ribonucleoside (200 mM)	2	20 mM
   Buffer di ibridazione	aggiunto a 20

2. Vetrini disidratati in un barattolo di Coplin contenente 80% di etanolo per 2 min, seguiti da un barattolo di Coplin contenente 100% di etanolo per 2 min. Scivoli asciutti completamente sulla panchina del laboratorio a temperatura ambiente.
3. Preriscaldare in anticipo una camera a punta (riempita con 2-3 cm di acqua) in un incubatore a 42 °C. Posizionare la diapositiva sulla camera della casella di punta. Centrifugare brevemente le sonde preannealate e la pipetta direttamente sugli scivoli disidratati. Evitare di fare bolle. Coprire delicatamente lo scivolo con un foglietto di copertura.
4. Ibridare per 6 ore fino a durante la notte (14-15 ore) a 42 °C.
5. Preparare soluzioni di lavaggio in vasetti Coplin (due vasetti con 2x SSC e 50% formamide, e due vasetti con 2x SSC). Preriscaldare a 42 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua.
6. Utilizzare una lama per rimuovere lo slittamento del coperchio dal bordo dello scivolo. Evitare di graffiare i campioni. Lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente 2x SSC e 50% formamide per 5 min a 45 °C. Ripetere questo passaggio una volta.
7. Lavare gli scivoli in un barattolo coplin contenente 2x SSC per 5 minuti a 45 °C. Ripetere questo passaggio una volta.
8. Aggiungere 20 μl di supporti di montaggio DAPI alle diapositive e coprire con uno slittamento di copertura. Premere delicatamente il vetro di copertura per rimuovere i supporti di montaggio aggiuntivi. Blot supporti di montaggio extra con tessuto detergente. Le diapositive sono pronte per la valutazione della microscopia.

Risultati

Un risultato rappresentativo di una diapositiva 3D è mostrato nella figura 2. In questo esperimento, Cot-1 RNA FISH è stato eseguito per rilevare la trascrizione nascente insieme all'immunostaining usando anticorpi anti CBX1 e γH2AX. Per combinare RNA FISH e immunostaining, l'immunostaining è stato eseguito per primo, seguito da RNA FISH come descritto in³. La CBX1 è una proteina eterocromatina che si localizza in eterocromatina pericentromerica e cromosomi sessuali silenziosi in meiosi chiama...

Discussione

Nella preparazione della diapositiva 3D, la fase di permeabilizzazione precede la fase di fissazione. Questi passaggi vengono eseguiti direttamente su tubuli seminiferi, preservando così la struttura tridimensionale della cromatina. Un'opzione alternativa per preservare la struttura della cromatina per RNA / DNA FISH è eseguire contemporaneamente la fase di permeabilizzazione e la fase di fissazione. Questa tecnica alternativa è stata eseguita nelle cellule germinali marsupiali e negli embrioni di preimpianto del^top...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Kit di etichettatura a fluorescenza fluorescente	Agilent	300380
Soluzione di DNA spermatozoi di aringhe	Invitrogen	15634-017
Etanolo. 200 proof (assoluto)	Pharmco-aaper	111000200
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Formamide deionizzato	American Bioanalytical	AB00600-00500
Citrato di sodio tribasico diidrato	Sigma-Aldrich	C8532
Albumina sierica bovina	Lifeblood Medical	77110-100
Destrano solfato sale sodico da Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
TUBI	Sigma-Aldrich	P6757
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	76240
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	221465
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Mezzo di montaggio con DAPI	Vector Laboratories	H1200
Complesso ribonucleoside-vanadile	New England Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Colonne	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrifuga	Eppendorf	5424
Pinze	VWR	300-050
Provette per microcentrifuga	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Vetrini per microscopio	Fisher	12-550-15
Piatto a 4 pozzetti	Fisher	12-566-301
Vetro di copertura	Fisher	12-544-G
Incubatore ad aria	Scienza rivoluzionaria	RS-IF-203