In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Sommario

La migrazione transeteliale neutrofila in risposta all'infezione batterica della mucosa contribuisce alla lesione epiteliale e alla malattia clinica. È stato sviluppato un modello in vitro che combina agenti patogeni, neutrofili umani e strati cellulari epiteliali umani polarizzati coltivati su filtri transwell per facilitare le indagini verso lo svelamento dei meccanismi molecolari che orchestrano questo fenomeno.

Abstract

Le superfici mucose fungono da barriere protettive contro gli organismi patogeni. Le risposte immunitarie innate vengono attivate al momento del rilevamento dell'agente patogeno che porta all'infiltrazione di tessuti con cellule infiammatorie migratorie, principalmente neutrofili. Questo processo ha il potenziale per essere distruttivo per i tessuti se eccessivo o tenuto in uno stato irrisolto.  I modelli in vitro coculati possono essere utilizzati per studiare i meccanismi molecolari unici coinvolti nella migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni. Questo tipo di modello offre versatilità nella progettazione sperimentale con l'opportunità di manipolazione controllata dell'agente patogeno, della barriera epiteliale o del neutrofilo. L'infezione patogena della superficie apicale dei monostrati epiteliali polarizzati coltivati su filtri transwell permeabili istiga la migrazione basolaterale ad apicale transeteliale dei neutrofili applicata alla superficie basolaterale. Il modello in vitro descritto nel presente documento dimostra i molteplici passaggi necessari per dimostrare la migrazione neutrofila attraverso un monostrato epiteliale polmonare polarizzato che è stato infettato da P. aeruginosa patogena (PAO1). Viene descritta la semina e la 155azione di transmeabili con cellule epiteliali polmonari derivate dall'uomo, insieme all'isolamento dei neutrofili da tutto il sangue umano e alla ristrutturazione di PAO1 e K12 E. coli nonpathogenico (MC1000).  Il processo di emigrazione e l'analisi quantitativa dei neutrofili migrati con successo che sono stati mobilitati in risposta all'infezione patogena sono mostrati con dati rappresentativi, compresi i controlli positivi e negativi. Questo sistema di modelli in vitro può essere manipolato e applicato ad altre superfici mucose. Le risposte infiammatorie che comportano un'eccessiva infiltrazione di neutrofili possono essere distruttive per ospitare i tessuti e possono verificarsi in assenza di infezioni patogene. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari che promuovono la migrazione transeteliale neutrofila attraverso la manipolazione sperimentale del sistema di saggi di cocultura in vitro descritto nel presente documento ha un potenziale significativo per identificare nuovi obiettivi terapeutici per una serie di malattie infettive e infiammatorie mucose.

Introduzione

Le superfici mucose fungono da barriere fisiche e immunologiche che forniscono protezione contro le minacce esterne pervasive^{nell'ambiente 1,2}. Questa barriera epiteliale protettiva può essere compromessa quando gli organismi patogeni invadono². Nel caso di un agente patogeno batterico, questo incontro spesso istiga un processo infiammatorio attivando il sistema immunitario innato e innescando una rapida mobilitazione dei granulociti del primo soccorritore noti come neutrofili^2-4. Gli agenti chemiotattici che facilitano il reclutamento dei neutrofili sono prodotti in parte dalle cellule epiteliali mucose che cercano di liberare l'ospit....

Protocollo

I passaggi (1-3) devono essere eseguiti in un ambiente sterile sotto una cappa di flusso laminare.

1. Transwell di rivestimento di collagene

1. Fare una soluzione di collagene da 30 μg/ml. Diluire 3 mg/ml di collagene stock 1:100 in 60% di etanolo che è stato passato attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm.
2. Soluzione vortici diluita da 30 μg/ml. Nota: Non è necessario vortice la soluzione di stock di collagene da 3 mg / ml, poiché questa soluzione è abbastanza viscosa e possono essere introdotte bolle d'aria, potenzialmente diminuendo la precisione durante la pipettazione.
3. Rimuovere i traslitti dell'area....

Risultati

Diversi studi hanno dimostrato che gli strati epiteliali infetti da agenti patogeni facilitano la migrazione transeteliale^{neutrofila 3,8,19,24-28,31,32}. Ciò avviene attraverso un'induzione specifica patogena di un gradiente chemiotattico neutrofilo derivato da cellule epiteliali^3,23. Ad esempio, la P. aeruginosa patogena che interagisce con la superficie apicale delle cellule epiteliali polmonari fa sì che un numero sostanziale di neutrofili migri attraverso lo strato epiteliale^{18,22,2.......}

Discussione

La migrazione neutrofila attraverso le superfici epiteliali mucose è una caratteristica comune nella patologia della malattia a seguito dell'infezione da agenti patogeni^{batterici 3}. La metodologia descritta nel presente documento offre un approccio rapido e diretto per isolare sperimentalmente questo evento discreto utilizzando un sistema di saggi di cocoltura in vitro derivato da cellule umane che modella una caratteristica del processo infiammatorio innescato da infezioni batteriche. Questo sistema .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule NCl-H292	ATCC	CRL-1848
RPMI-1640 medio	ATCC	30-2001<
em>Pseudomonas aeruginosa PAO1	ATCC	#47085
Escherichia coli MC1000	ATCC	#39531
D-PBS (1x) liquido	Invitrogen	14190-144	senza calcio e magnesio
Siero fetale bovino inattivato a caldo	Invitrogen	10082-147	10% aggiunto al terreno di coltura
Penicillina-streptomicina	Invitrogen	15140-122	100x: 10.000 unità di penicillina e 10.000 µ g di streptomicina per ml.
Tripsina-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300-062	50 ml aliquote sono conservate congelate a -20 °C. L'aliquota in uso può essere memorizzata a 4 º C a breve termine.
Soluzione salina bilanciata di Hank - HBSS(-)	Invitrogen	14175-079	Sterile, senza calcio e magnesio
Soluzione di tripano blu	Invitrogen	15250-061.	Azioni = 0,4%
Collagene, coda di ratto	Invitrogen	A10483-01	Può anche essere isolato in laboratorio direttamente dalle code dei ratti utilizzando protocolli standard
Acido citrico	Sigma-Aldrich	C1909-500G	Componente di 1 M di tampone citrato e soluzione di destrosio acido citrato (ACD)
Citrato di sodio	Sigma-Aldrich	S4641-500G	Componente di 1 M citrato
Destrosio anidro	Sigma-Aldrich	D8066-250G	Componente della soluzione di destrosio di citrato acido (ACD)
Cloruro di ammonio	Sigma-Aldrich	213330-500G	Componente del tampone di lisi dei globuli rossi (RBC)
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S6014-500G	Componente del tampone di lisi dei globuli rossi (RBC)
EDTA	Sigma-Aldrich	ED-100G	Componente del tampone di lisi dei globuli rossi (RBC)
HBSS(+) polvere	Sigma-Aldrich	H1387-10L	Componente chiave di HBSS+
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G	Componente di HBSS+
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	Seguire le istruzioni del fornitore per rivestire i puntali delle pipette in vetro
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
2,2'-Azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolina-6-solfonico) sale diammonico (ABTS)	Sigma-Aldrich	A9941-50TAB	Componente chiave della soluzione di substrato ABTS
Soluzione di perossido di idrogeno al 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	Componente della soluzione di substrato ABTS
N-FORMYL-MET-Leu-Phe (fMLP o fMLF)	Sigma-Aldrich	F-3506	Deve essere preparata una soluzione madre di 10 mM in DMSO e le aliquote devono essere conservate a -20 °C.
Gelatina Tipo B	Fisher Scientific	M-12026
Pseudomonas isolazione agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Segui il produttore' s istruzioni per fare le piastre PIA
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-749	Opzionale, può migliorare la purezza dei neutrofili
Piastra di migrazione a 24 pozzetti	Corning Incorporated	#3524
Piastra di lavaggio a 24 pozzetti	Falcon	35-1147	Può essere riutilizzata se imbevuta di etanolo al 70% e lavata accuratamente prima di riutilizzare la
piastra a 96 pozzetti	Fisher Scientific	#12565501
Transwell Permeable Supports	Corning Incorporated	#3415	Policarbonato; Diametro: 6,5 mm; Area di crescita: 0,33 cm2; Stile del piatto: piastra a 24 pozzetti; Dimensione dei pori: 3,0 & micro; m
Piastra di Petri	Falcon	35-1013	Ogni piastra di Petri contiene 24 Transwell invertiti da 0,33 cm2.
500 ml 0,2 μ m filtro / matraccio	Fisher Scientific	09-740-25A	Per sterilizzare la soluzione di destrosio acido citrato (ACD)
5-3/4 in pipetta di vetro	Pasteur Fisher Scientific	13-678-20A	Rivestire le punte con Sigmacote prima dell'uso
Emostatico	Fisher Scientific	13-812-14	Microscopio
invertito Invertoskop	Zeiss	#342222
Versa-Max Lettori di micropiastre	Dispositivi molecolari	#432789

curvo e seghettato