In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Le superfici mucose fungono da barriere fisiche e immunologiche che forniscono protezione contro le minacce esterne pervasive^{nell'ambiente 1,2}. Questa barriera epiteliale protettiva può essere compromessa quando gli organismi patogeni invadono². Nel caso di un agente patogeno batterico, questo incontro spesso istiga un processo infiammatorio attivando il sistema immunitario innato e innescando una rapida mobilitazione dei granulociti del primo soccorritore noti come neutrofili^2-4. Gli agenti chemiotattici che facilitano il reclutamento dei neutrofili sono prodotti in parte dalle cellule epiteliali mucose che cercano di liberare l'ospite dall'agente patogeno ofa^{offendente 2-4}. Un'infiltrazione neutrofila eccessiva o irrisolta della superficie epiteliale mucosa può causare una patologia^{significativa 1,5}. Questa è una conseguenza del danno tissutale non specifico causato dall'arsenale neutrofilo antibatterico^5-7. In questi casi, la capacità di clearance batterica dei neutrofili è oscurata dalla distruzione del tessuto ospite durante un insulto infettivo.  L'interruzione della funzione protettiva di barriera epiteliale può portare a una maggiore esposizione del tessuto sottostante a microrganismi e / o tossine, esacerbando ulteriormente la patologia^{della malattia 8,9}. Queste conseguenze possono essere osservate in più sistemi di organi tra cui il polmone e il tratto^{digestivo 1,5}. Inoltre, condizioni infiammatorie non infettive come gravi attacchi di asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e malattia infiammatoria intestinale (IBD) sono contrassegnate dalla violazione patologica della barriera epiteliale mucosa da un'eccessiva risposta neutrofila^4,5,10-12.

Il complesso processo di reclutamento dei neutrofili a seguito di infezione della mucosa comporta diversi passaggi^{compartimentati 1,5,13,14}. In primo luogo, i neutrofili devono partire dalla circolazione attraverso una serie di interazioni cellula-cellula che facilitano la migrazione trans-endoteliale^1,13. I neutrofili navigano quindi nello spazio interstiziale esistente contenente matrice^{extracellulare 1,14}. Per raggiungere il lume della mucosa infetta, i neutrofili devono quindi migrare attraverso la barriera epiteliale^1,4,5. Questo intricato fenomeno multistep è spesso studiato in aggregato utilizzando modelli animali in vivo di infezione¹⁵. Tali modelli sono utili per stabilire la necessità di fattori specifici, come chemiochine, molecole di adesione o percorsi di segnalazione che partecipano al processo complessivo ma sono in gran parte inadeguati per risolvere i contributi molecolari critici per ogni fase^{compartimentata distinta 16}. I sistemi in vitro coculati che modellano la migrazione trans-endoteliale, trans-matriciale o transepiteliale dei neutrofili sono stati particolarmente utili a^{questo proposito 1,14,16,17}.

È stato sviluppato un solido sistema di dosaggio della cocoltura allo scopo di decifrare i meccanismi responsabili della migrazione transeteliale neutrofila in risposta all'infezione^{patogena 18-22}. Questo modello prevede di infettare la superficie apicale degli strati cellulari epiteliali umani polarizzati con un agente patogeno batterico seguito dall'applicazione di neutrofili umani appena isolati sulla superficie basolaterale^18-22. I neutrofili migrano attraverso la barriera epiteliale in risposta a prodotti chemiotattici derivati epiteliali secreti a seguito di infezione^{patogena 18,21-23}. Questo sistema modello è stato utilizzato utilizzando colture epiteliali intestinali e polmonari esposte a patogeni batterici specifici del tessuto appropriati e ha svelato nuovi meccanismi molecolari probabilmente importanti per il processo di reclutamento dei neutrofili durante l'infezione della^{mucosa 3,8,19,24-28}. La forza di questo modello di cocultura in vitro è che un approccio riduzionista consente allo sperimentatore di manipolare sperimentalmente l'agente patogeno, la barriera epiteliale e / o il neutrofilo in un sistema ben controllato, altamente riproducibile, abbastanza economico. Le informazioni raccolte da questo approccio possono essere efficacemente sfruttate per condurre analisi mirate degli eventi compartimentati durante il reclutamento di neutrofili utilizzando modelli di infezione in vivo ^22,29,30.

Questo articolo illustra i molteplici passaggi necessari per la corretta istituzione di questo modello riproducibile per esplorare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni. Le barriere epiteliali polmonari infettate dall'agente patogeno Pseudomonas aeruginosa sono presenti in questo articolo; tuttavia, altri epiteli tissutali e agenti patogeni possono essere sostituiti con piccole modifiche. La semina e la valutazione di strati di cellule epiteliali polmonari polarizzate su filtri transwell permeabili rivestiti di collagene invertito è dettagliata nel presente documento, così come la crescita della P. aeruginosa patogena e l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero. Come questi componenti sono combinati per osservare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni viene presentato insieme ad opportuni controlli positivi e negativi per stabilire un saggio riproducibile. La versatilità di questo approccio per esaminare vari aspetti della migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni viene discussa con riferimento a studi specifici in letteratura.

I passaggi (1-3) devono essere eseguiti in un ambiente sterile sotto una cappa di flusso laminare.

1. Transwell di rivestimento di collagene

1. Fare una soluzione di collagene da 30 μg/ml. Diluire 3 mg/ml di collagene stock 1:100 in 60% di etanolo che è stato passato attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm.
2. Soluzione vortici diluita da 30 μg/ml. Nota: Non è necessario vortice la soluzione di stock di collagene da 3 mg / ml, poiché questa soluzione è abbastanza viscosa e possono essere introdotte bolle d'aria, potenzialmente diminuendo la precisione durante la pipettazione.
3. Rimuovere i traslitti dell'area di^{crescita di 0,33} cm 2 con una dimensione dei pori di 3 μm dall'imballaggio esterno e posizionare la piastra da 24 po po ' contenente 12 traslitti a testa in giù all'interno del cofano.
4. Sollevare la piastra inferiore e mettere da parte. Nota: i transwell saranno ora a testa in giù appoggiati in cima al coperchio della piastra da 24 poggia
5. Accendi il bruciatore Bunsen. Emostato di fiamma per sterilità e lasciare raffreddare.
6. Con l'emostato sterile, trasferire i traslitti in una piastra di Petri da 150 mm x 25 mm, mantenendoli in posizione invertita. Nota: Assicurarsi di mantenere la sterilità della piastra vuota da 24 pozzi più coperchio da utilizzare per ospitare i transwell una volta che sono stati seminati con cellule epiteliali.
7. Pipetta 70 μl della soluzione di collagene da 30 μg/ml sulla membrana filtrante di ogni traslietto invertito. Nota: la tensione superficiale dovrebbe mantenere questo volume di soluzione in posizione in quanto non ci sono pareti intorno alla membrana filtrante quando si accede alla superficie della parte inferiore. Fare attenzione che la soluzione di collagene non goccioli lungo il lato del traswell ed evitare di spostare i traslitti durante la procedura di rivestimento.
8. Lasciare libero il coperchio della piastra di Petri per un minimo di 4 ore per consentire l'evaporazione della soluzione di etanolo. Per mantenere la sterilità durante questo processo mantenere il ventilatore del cofano e la luce ultravioletta.
9. Dopo che i transwell si sono asciugati, possono essere utilizzati immediatamente o conservati a temperatura ambiente per un massimo di una settimana a condizione che la copertura della piastra di Petri sia in posizione e che la sterilità sia mantenuta.

2. Pallone di passaggio di cellule epiteliali per la semina di transwell

(Questo protocollo descrive specificamente la manipolazione della linea cellulare epiteliale polmonare H292 per la generazione di barriere epiteliali coltivate su transwell. Altre linee cellulari epiteliali possono essere utilizzate con lievi modifiche.)

1. Preparare il terreno di coltura aggiungendo il 10% di siero bovino fetale inattivato termicamente (HI-FBS) e 1x penicillina/streptomicina all'RPMI 1640.
2. Mezzi caldi, tripside-EDTA (T-EDTA) e D-PBS in bagno d'acqua da 37 ºC.
3. Rimuovere il pallone T-75 contenente cellule dall'incubatore e valutare visivamente la confluenza con il microscopio invertito. Nota: quando si utilizzano cellule H292, i contenitori devono essere vicini o completamente confluenti.
4. Aspirare i supporti dal pallone. Ridurre il periodo di tempo in cui le cellule sono asciutte avendo la soluzione successiva nel cappuccio con cappuccio allentato.
5. Aggiungere 5 ml di D-PBS al pallone T-75 e ruotare. Evitare di creare bolle. Rimuovere PBS per aspirazione.
6. Aggiungere 3 ml di T-EDTA al pallone T-75 e ruotare per coprire il fondo.
7. Rimuovere la maggior parte del T-EDTA, lasciando circa 0,3 ml nel pallone T-75.
8. Distribuire il piccolo volume rimanente di T-EDTA sulla superficie delle cellule e posizionarsi in un incubatore umidificato in condizioni di coltura standard (37 ºC, 5% CO₂).
9. Dopo un certo periodo di tempo, rimuovere il pallone dall'incubatore. Nota: Le cellule devono staccarsi facilmente dalla superficie del pallone toccando delicatamente il pallone su un lato. Le cellule dovrebbero ora essere arrotondate e fluttuanti quando vengono visualizzate al microscopio. Il tempo medio che ciò richiederà per le cellule H292 è di 5-10 minuti.
10. Aggiungere 10 ml di mezzi di coltura al pallone per neutralizzare le cellule T-EDTA e resuspend. Redigere la soluzione cellulare in punta di pipetta ed espellere sulla superficie del pallone contenente celle circa cinque volte per rimodere tutte le cellule.
11. Trasferire le cellule rimorsi su un tubo da 15 ml per la semina di traslitti. Nota: La concentrazione di cellule H292 rimontesi preparate in questo modo deve variare tra circa 1 x 10⁶-1,8 x 10⁶ cellule/ml.

3. Semina di transessuali rivestiti di collagene con cellule epiteliali

1. Aggiungere 70 μl di soluzione cellulare rimorsinata dal tubo da 15 ml a ogni transwell rivestito di collagene invertito. Nota: Le soluzioni cellulari H292 con un intervallo di concentrazione compreso tra 1 x 10⁶-1,8 x 10^{6 cellule/ml} produrranno circa 70.000-120.000 cellule/traslici.
2. Mescolare periodicamente la sospensione cellulare invertendo delicatamente il tubo per evitare che le cellule si sistemino sul fondo del tubo da 15 ml durante la semina dei transwell. Nota: non vortici e fai attenzione che la punta della pipetta non venga a contatto diretto con il filtro a membrana rivestito di collagene.
3. Una volta che tutti i transwell invertiti sono stati seminati con cellule epiteliali, sostituire la copertura della piastra di Petri e posizionare con cura nell'incubatrice di coltura tissutale, umidificata, 37 ºC, 5% CO₂. Fare attenzione a evitare di disturbare la sospensione cellulare che è stata aggiunta alla membrana filtrante rivestita di collagene.
4. Mantenere i transwell invertiti nell'incubatore di coltura tissutale, umidificato, 37 ºC, 5% CO_{2 durante la} notte. Nota: La bolla di cellule contenenti liquido deve rimanere associata alla membrana filtrante permeabile del transwell durante l'incubazione notturna. Se la membrana filtrante si asciuga a causa dell'evaporazione del liquido o perché il liquido gocciola lungo il lato dei transwell, gli strati epiteliali potrebbero non crescere correttamente.
5. Il giorno seguente, aggiungere 1 ml di supporto nella piastra sterile originale da 24 porcili e capovolgere ogni transetto invertito utilizzando un emostato sterilizzato in ogni pozzo contenente 1 ml di mezzo.
6. Aggiungere 0,2 ml di mezzi nella camera superiore di ogni transwell e tornare all'incubatore di coltura tissutale, umidificato,   37 ºC, 5% CO₂.
7. I traslitti invertiti H292 possono essere utilizzati da 8 giorni fino a 1 mese dopo la semina. Nota: Si consiglia di attendere almeno 8 giorni dopo la semina dei transwell per garantire che i monostrati epiteliali si siano completamente formati e mostrino una barriera funzionale. Si può testare la barriera epiteliale H292 determinando se il monostrato è in grado di limitare il flusso transepidelio della proteina perossidasi del ravanello del cavallo (HRP) in seguito all'aggiunta alla superficie basolaterale¹⁸.

4. Preparazione di batteri per l'infezione di strati epiteliali su transwell

1. Un giorno prima dell'esperimento, estrarre una colonia di P. aeruginosa PAO1 da una piastra di Agar di isolamento Pseudomonas e una colonia di K12 E. coli MC1000 da una piastra di Agar Luria-Bertani (LB) e posizionare in tubi separati contenenti 3 ml di brodo LB. ATTENZIONE: P. aeruginosa è un agente patogeno umano, le misure di sicurezza standard BSL2 devono essere adottate durante la manipolazione di questo organismo.
2. Agitare durante la notte a 225 giri/min in un ambiente a 37 ° C.
3. Il giorno successivo, rimuovere 1 ml dalle dense colture batteriche e posizionare in tubi Eppendorf da 1,5 ml.
4. Girare in microfugo a 15.800 x g per 5 minuti e quindi rimuovere il supernatante.
5. Preparare in anticipo la soluzione di sale bilanciato di Hanks con calcio e magnesio (HBSS+). Aggiungere 23,8 g di HEPES e 97,5 g di polvere HBSS+ a 9,5 L di acqua distillata. Aggiungere piccole quantità di NaOH da 10 M alla soluzione, monitorando il pH fino a raggiungere un pH stabile di 7,4. Portare il volume fino a 10 L e conservare a 4 ºC.
6. Resuspend ogni pellet batterico con 1 ml HBSS+. Vortice per essere sicuri che si ottiene una sospensione batterica uniforme.
7. Ruotare di nuovo a 15.800 x g per 5 minuti e rimuovere il supernatante.
8. Resuspend il pellet PAO1 con 0,6 ml DI HBSS+ e il pellet MC1000 con HBSS+ da 0,5 ml. Vortice le sospensioni batteriche.
9. Diluire ulteriormente i pellet rimorsi di PAO1 e MC1000 1:100 in HBSS+. Ad esempio, aggiungere 50 μl del pellet rimosorsi PAO1 da 0,6 ml a 5 ml DI HBSS+. Nota: utilizzando misurazioni della densità ottica (OD) per determinare la densità di coltura e la metodologia di placcatura della diluizione CFU (Standard Colony Forming Unit), le soluzioni PAO1 e MC1000 preparate in questo modo producono costantemente tra 3 x 10⁷-6 x 10⁷ CFU/ml. La densità di una coltura batterica è positivamente correlata con la misurazione OD della coltura a 600 nm e questa correlazione può essere utilizzata per stimare la concentrazione di cellule batteriche. Per confermare la concentrazione di cellule batteriche, la coltura può essere diluita a una concentrazione stimata molto bassa e placcata su una piastra di agar in modo tale che ci si aspetterebbe che sul piatto siano presenti tra le 30 e le 200 cellule batteriche. Le cellule vengono diffuse attraverso la piastra e incubate durante la notte a 37 ° C in modo tale che ogni cellula forma una singola colonia di cellule abbastanza grande da essere visibile e le colonie possono quindi essere contate.

5. Isolamento dei neutrofili dal sangue intero

1. La soluzione acida di destrosio citrato (ACD) viene utilizzata come anticoagulante e preparata aggiungendo 6,9 g di acido citrico, 12,5 g di citrato di sodio e 10 g di destrosio a 500 ml di acqua distillata. Una volta sciolti tutti i componenti, la soluzione ACD viene sterilizzata passando attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm. Conservare la soluzione ACD a 4 ºC.
2. Prima di preere il sangue, aggiungere 5 ml di ACD alla siringa da 50 ml e attaccare 21 x 3/4 G di ago a farfalla con 12 in tubi.
3. Applicare il laccio emostatico, pulire la vena con alcol e inserire l'ago. Nota: qualsiasi protocollo di ricerca che coinvolga soggetti umani deve essere approvato da un comitato di revisione istituzionale e deve essere fornito il consenso informato scritto da ogni donatore di sangue. Ad esempio, gli esperimenti condotti utilizzando questo protocollo sono stati approvati dal Massachusetts General Hospital Institutional Review Board e assegnati al protocollo #1999-P-007782.
4. Preeni lentamente 45 ml di sangue assicurando che il sangue si mescoli con l'ACD una volta nella siringa.
5. Quando sono stati prelevati 45 ml (50 ml di volume totale), slegare il laccio emostatico prima di rimuovere l'ago. Applicare immediatamente la pressione sulla ferita con garza sterile quando l'ago viene rimosso.
6. Trasferire lentamente il sangue lungo il lato di un tubo da 50 ml su circa 5-10 secondi.
7. Ruota in centrifuga a 1.000 x g con il freno disattivato per 20 minuti a temperatura ambiente. Nota: Un ulteriore passo che comporta la diluizione del sangue intero nel PBS e un'attenta sovrapposizione di sangue diluito su Ficoll-Paque prima della centrifugazione può essere impiegato per raggiungere un livello leggermente più elevato di purezza neutrofila separando in modo più efficiente il mantello di buffy dai granulociti⁸. Omettere questo passaggio serve a risparmiare tempo senza influire drasticamente sulla resa o sulla purezza ai fini di questo saggio, e quindi favoriamo di non includere la sovrapposizione di sangue sul passo Ficoll-Paque.
8. Mentre il sangue gira, aggiungere molto lentamente 1 g di gelatina nella soluzione di sale bilanciato di Hanks riscaldata da 50 ml senza calcio e magnesio (HBSS(-)) per preparare una soluzione di gelatina al 2%. Mantenere la soluzione a 37 ºC.
9. Aspirare e scartare il plasma dal tubo di sangue da 50 ml utilizzando una punta di pipetta di vetro che è stata trattata con Sigmacote.
10. Continuare ad aspirare con molta attenzione per rimuovere il mantello di buffy, che contiene globuli bianchi, compresi i linfociti.
11. Mentre il mantello buffy viene lentamente rimosso, il materiale nuvoloso giallo biancastro sopra lo strato di globuli rossi (RBC) scomparirà. Interrompere l'aspirazione una volta rimosso il cappotto buffy e visualizzare chiaramente lo strato RBC durante la visualizzazione dall'alto del tubo.
12. Cerca di non disturbare lo strato RBC poiché i granulociti, per lo più neutrofili, sono vicini alla superficie dello strato RBC, ma non sono visibili.
13. A un volume di 15 ml di strato di RBC, aggiungere 30 ml di soluzione calda di gelatina al 2% (2 volte il volume dello strato RBC).
14. Invertire delicatamente il tubo per mescolare, facendo attenzione a ridurre al minimo la formazione di bolle.
15. Incubare a 37   ºC per 25 min. Nota: gli RBC devono aggregarsi e depositarsi sul fondo. In alternativa alla gelatina, è possibile utilizzare un grande dextrans a peso molecolare per sedimentare gli RBC⁸.
16. Dopo l'incubazione, trasferire la soluzione rossastra leggera dello strato superiore che contiene granulociti in un nuovo tubo da 50 ml con pipetta, facendo attenzione a non disturbare lo strato RBC scuro stabilizzato durante il trasferimento. Una volta separato, scartare il livello RBC scuro.
17. Spin ha trasferito una soluzione rossastra leggera contenente granulociti e alcuni RBC in centrifuga a 1.000 x g con freno attivato per 10 minuti a temperatura ambiente al fine di pelletare le celle.
18. Versare o aspirare attentamente il supernatante, poiché il pellet di cellule rossastre che si formerà dopo la centrifugazione è generalmente sciolto.
19. Preparare il tampone di lisi RBC in anticipo e conservare a 4 ºC aggiungendo 8,29 g di cloruro di ammonio (NH₄Cl), 1 g di bicarbonato di sodio (NaHCO₃₎e 0,038 g di EDTA a 1 L di acqua distillata in un bicchiere. Conservare il buffer di lysis RBC a 4 ºC.
20. Resuspend e rompere il pellet di cellule rossastre con un piccolo volume di tampone di lysis RBC freddo. Una volta che il pellet di cella è in soluzione, riempire il tubo a 50 ml con tampone di lysis RBC. Nota: A questo punto e andando avanti, tenere le cellule sul ghiaccio o a 4 ºC.
21. Girare in centrifuga a 300 x g per 10 min a 4   ºC e quindi versare o aspirare il supernatante. Nota: il supernatante sarà un po 'rossastro contenente RBC lisci. Il pellet dovrebbe essere bianco giallastro a questo punto. Se nel pellet rimangono RBC significativi come indicato da un pellet rossastro, è possibile ripetere il passaggio 5.20-5.21. Nel pellet cellulare rimangono RBC significativi se il pellet rossastro del passaggio 5.20 non viene scomposto a sufficienza.
22. Resuspend e rompere il pellet biancastro con un piccolo volume di HBSS(-) e quindi riempire il tubo a 50 ml con HBSS(-). Nota: HBSS(-) e non HBSS+ devono essere utilizzati per rimostrare il pellet di cellule biancastre. HBSS(-) manca di calcio e magnesio.
23. Ruotare di nuovo in centrifuga a 300 x g per 10 minuti a 4   ºC.
24. Versare il supernatante e resuspend il pellet ad un volume finale di 1 ml di HBSS(-).
25. Aggiungere 5 μl della sospensione cellulare da 1 ml a 250 μl HBSS(-) in un tubo Eppendorf da 1,5 ml e mescolare delicatamente su e giù per pipetta.
26. Aggiungere 25 μl di sospensione cellulare diluita a 25 μl 0,4% trypan blu.
27. Aggiungere 12 μl di miscela su ciascun lato di un emocitometro standard.
28. Contare il numero di cellule viventi che hanno escluso il colorante blu di Trypan e sono presenti nel quadrato centrale di entrambi i lati dell'emocitometro.
29. Per calcolare la concentrazione cellulare, moltiplicare la media dei 2 quadrati per 100 (fattore diluzionale) e quindi moltiplicare per 10⁴ per dare il numero di cellule /ml.
30. Regolare la concentrazione finale a 5 x 10⁷ cellule/ml. Se superiore a 5 x 10⁷ celle/ml, regolare aggiungendo HBSS(-). Se inferiore, pelletare le cellule e ripreposistere al volume appropriato.
31. Tenere le cellule sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per il test di migrazione. Nota: Queste cellule rappresentano la popolazione di granulociti dei globuli bianchi. La maggior parte dei granulociti isolati dal sangue umano intero sono neutrofili. Le cellule sono tenute sul ghiaccio sospeso in HBSS(-) fino ad aggiunta al saggio di migrazione al fine di mantenere le cellule in uno stato quiescente.

6. Preparazione di strati cellulari epiteliali per il test di migrazione

(Questipassaggi non devono essere eseguiti all'interno di una cappa sterile.)

1. Rimuovere dall'incubatrice una piastra a 24 pozzi che supporta strati epiteliali che sono stati coltivati sul lato inferiore delle membrane filtranti transwell per almeno otto giorni.
2. Afferrare il bordo di ogni traliabile con un emostato, sollevare dalla piastra a 24 po 'e invertire il traswell su un secchio di scarto per scartare i supporti di coltura dalla camera interna del transwell. Immergere ogni traslitto in un becher di lavaggio contenente HBSS+ per riempire la camera interna del transwell con HBSS+. Scartare il fluido dalla camera interna in un secchio di rifiuti.
3. Ripetere il passaggio 6.2 per un secondo lavaggio in HBSS+. Dopo due lavaggi, posizionare i traslitti in una nuova piastra da 24 pozzetti contenente 1 ml di HBSS+ in ogni pozzo. Nota: Tutti i lavaggi devono essere eseguiti con HBSS+ riscaldato a 37 ºC.
4. Osservare la camera superiore di ogni transwell per valutare l'integrità dello strato cellulare epiteliale. Nota: HBSS+ non deve fuoriuscire e riempire la camera superiore del tralietto quando viene posizionato nel pozzo di una piastra da 24 po porsi contenente 1 ml di HBSS+.
5. Dopo aver osservato attentamente ogni traslietto, aggiungere 0,2 ml di HBSS+ nella camera superiore.
6. Mettere in incubatrice a 37   ºC, 5% CO₂ in una camera umidificata per 30-60 min per equilibrare gli strati cellulari epiteliali.

7. Saggio di migrazione transeteliale neutrofilo

1. Rimuovere dall'incubatore una piastra a 24 pozzi di transevieni lavati equilibranti in HBSS+.
2. Afferrare ogni transwell con un emostato e scartare il fluido in alto bene in un secchio di rifiuti.
3. Posizionare ogni traliggino capovolto in una piastra di Petri da 150 mm x 25 mm.
4. A sei dei Transwell rovesciati, aggiungere 25 μl di HBSS+. A tre dei traslitti invertiti, infettare con 25 μl P. aeruginosa (PAO1) diluito in HBSS+ preparato come descritto nella fase 4. Agli ultimi tre trasversalmente, infettare con 25 μl E. coli K12 (MC1000) diluito in HBSS+ preparato come descritto al passaggio 4. Si tratta di circa 0,8 x 10⁶-1,5 x 10^{6 CFU/strato} epiteliale per ciascuna specie batterica poiché la concentrazione delle soluzioni batteriche preparate nella fase 4 è di circa 3 x 10⁷-6 x 10⁷ CFU/ml.
5. Incubare a 37   ºC, 5% DI CO₂ in una camera umidificata per 60 min.
6. Preparare fMLP come controllo positivo per la migrazione dei neutrofili aggiungendo 5 μl di 10 mM di stock fMLP a 5 ml HBSS+ dando una soluzione da 10 μM.
7. Lavare i tralitti afferrando con un emostato e capovolgendo di nuovo in una piastra di lavaggio da 24 po 'che contiene 1 ml di HBSS + nelle camere inferiori. Aggiungere 0,2 ml di HBSS+ alle camere superiori.
8. Afferrare il tralietto con un emostato e rimuovere dal primo piatto di lavaggio. Prima di posizionare i traslitti in una seconda piastra di lavaggio da 24 porsi contenente 1 ml di HBSS+, scartare il fluido dalla camera superiore in un secchio di scarto. Aggiungere 0,2 ml di HBSS+ alla camera superiore.
9. Ripetere i passaggi 7.8 un'altra volta per un totale di 3 lavaggi. Nota: Tutti i transwell devono essere sottoposti allo stesso regime di manipolazione e lavaggio, indipendentemente dal fatto che siano stati infettati o meno da batteri, per garantire che tutti i transwell che vengono saggiati siano stati manipolati allo stesso modo. Un'infezione da 60 minuti con PAO1 o MC1000 non riduce la vitalità o altera le proprietà barriera del monostrato H292 valutate da un saggio tossicologico a base di lattato deidrogenasi e dal saggio di flusso HRP,^{rispettivamente 18,22}.
10. Preparare la piastra di migrazione a 24 porvili aggiungendo 1 ml di HBSS+ in 12 pozzali della piastra da 24 pozza. Nota: questa piastra può essere preparata in anticipo.
11. Dopo il terzo lavaggio, scartare il fluido dalle camere superiori dei traslitti in un secchio di scarto utilizzando un emostato e posizionare tre dei traslitti non infetti in tre pozzi della piastra di migrazione a 24 porsi contenente 1 ml di HBSS+, che rappresenta il controllo negativo.
12. Pipetta 10 μl di una soluzione da 10 μM di fMLP in ciascuno dei tre pozzi della piastra di migrazione da 24 porci contenenti 1 ml di HBSS+ (100 nM).
13. Posizionare tre dei transevi infette in tre pozzi della piastra di migrazione a 24 porsi contenente 100 nM fMLP, che rappresenta un controllo positivo per la capacità dei neutrofili isolati di migrare.
14. Posizionare tre transessuni infetti da PAO1 e tre transessuni infetti da MC1000 in tre pozzi ciascuno rispettivamente della piastra di migrazione da 24 porci contenenti 1 ml di HBSS+. Aggiungere 0,1 ml di HBSS+ alla camera superiore di ogni transwell.
15. Oltre allo HBSS+ da 0,1 ml in ogni transwell, aggiungere con cura 20 μl della sospensione neutrofila (5 x 10⁷ cellule/ml) preparata come descritto al passaggio 5. Nota: Questo rappresenta circa 1 x 10⁶ neutrofili/ transwell.
16. Incubare a 37 ºC, 5% CO₂ in una camera umidificata per 2 ore per consentire la migrazione transeteliale dei neutrofili.
17. Preparare una curva standard per determinare il numero di neutrofili migrati dopo 2 ore. Aggiungere 40 μl della sospensione neutrofila (5 x 10⁷ cellule/ml) in 2 ml di HBSS(+) e trasferire 1 ml in 1 ml di HBSS(+) ed eseguire diluizioni seriali 2 volte per un totale di 10 standard che vanno da circa 2.000 cellule/ml a 1 x 10⁶ celle/ml. Includere 1 ml di HBSS(+) per il bianco.
18. Dopo 2 ore di migrazione, sollevare i transwell afferrando con un emostato e toccare delicatamente contro le pareti interne della piastra di migrazione a 24 pozzi. Scartare i transwell.
19. Valutare la migrazione dei neutrofili in modo grossolano nei pozzi visualizzando i pozzi della piastra di migrazione a 24 pozzi sotto un microscopio invertito utilizzando l'obiettivo 10X (vedere la figura 1 per le immagini dei neutrofili migrati in ogni condizione).
20. Aggiungere 50 μl di tritone X-100 al 10% a ciascun pozzo utilizzato nella piastra di migrazione a 24 pozzi, ogni standard e il vuoto.
21. Ruotare la piastra di migrazione a 24 pozzi, gli standard e il vuoto a bassa velocità per 20 minuti a 4   ºC.
22. Preparare 1 M tampone di citrato in anticipo. Aggiungere 52,5 g di acido citrico e 73,5 g di citrato di sodio a 400 mi di acqua distillata in un bicchiere. Porta il pH a 4,2. Aggiungere acqua distillata per la soluzione finale di 500 ml. Conservare la soluzione a 4 ºC.
23. Preparare la soluzione di substrato ABTS fresca quel giorno. Aggiungere 3 compresse di ABTS (10 mg ciascuna) e 5 ml di tampone di citrato da 1 M a 45 ml di acqua distillata. Lasciare che le compresse si dissolvano completamente in soluzione. Trattenere l'aggiunta di 50 μl di perossido di idrogeno al 30% fino a quando non è necessaria la soluzione del substrato ABTS (vedere fase 7.27).
24. Aggiungere 50 μl di tampone di citrato a ogni pozzo utilizzato nella piastra di migrazione a 24 pozzi, ogni standard e il vuoto.
25. Trasferire 100 μl di ogni campione bene in duplicato su una piastra da 96 po' . Nota: È molto importante mescolare accuratamente il contenuto in ogni campione ben prima di passare alla piastra da 96 pozzi. Pipettare la soluzione su e giù almeno cinque volte prima del trasferimento.
26. Trasferire 100 μl di ogni norma e il bianco sulla piastra a 96 pozzi dopo la miscelazione (vuoto in duplicato).
27. Aggiungere 50 μl di perossido di idrogeno al 30% alla soluzione e al vortice ABTS.
28. Aggiungere 100 μl di soluzione di substrato ABTS a ciascun campione sulla piastra da 96 pozzi.
29. Lasciare sviluppare la piastra per 5-10 minuti al buio. Nota: Un colore verde dovrebbe svilupparsi in alcuni pozzi, correlando con il numero di neutrofili presenti in ogni pozzo.
30. Leggere a lunghezza d'onda di 405 nm utilizzando un lettore di micropiatta.
31. Calcolare il numero di neutrofili migrati attraverso lo strato epiteliale utilizzando gli standard in base ai quali esiste una correlazione positiva lineare tra il numero noto di neutrofili preparati come standard e la quantità di attività perossidasi misurata dalla densità ottica a 405 nm (vedi figure 2 e 3 per i dati rappresentativi). Nota: Questo metodo di quantificazione dei neutrofili sfrutta la grande quantità di attività perossidasi esibita dai neutrofili a causa dell'espressione mieloperossidasi. Possono essere presi in considerazione approcci alternativi per quantificare i neutrofili, come i metodi che coinvolgono la preetichettatura dei neutrofili con radioattività o composti a fluorescenza.

Diversi studi hanno dimostrato che gli strati epiteliali infetti da agenti patogeni facilitano la migrazione transetelialeneutrofila 3,8,19,24-28,31,32. Ciò avviene attraverso un'induzione specifica patogena di un gradiente chemiotattico neutrofilo derivato da cellule epiteliali3,23. Ad esempio, la P. aeruginosa patogena che interagisce con la superficie apicale delle cellule epiteliali polmonari fa sì che un numero sostanziale di neutrofili migri attraverso lo strato epiteliale18,22,25,26,33,34. Questo sistema di saggi clinicamente rilevante può essere manipolato in numerosi modi per svelare i principali agenti patogeni e ospitare collaboratori molecolari se abbinato a controlli appropriati.

I neutrofili aggiunti agli strati cellulari epiteliali polarizzati che non sono stati preinfetti non riescono a migrare in numero apprezzabile. Tuttavia, l'applicazione di un gradiente chemio-attrattore attraverso uno strato epiteliale non infetto guiderà un numero significativo di neutrofili attraverso. È importante includere entrambi questi controlli negativi e positivi rispettivamente all'interno di ogni saggio quando si studia la migrazione dei neutrofili attraverso strati epiteliali infetti da agenti patogeni. Il controllo negativo stabilisce il numero di fondo dei neutrofili che attraversano lo strato epiteliale in assenza di segnale. Questo numero dovrebbe essere molto basso quando le cellule epiteliali coltivate hanno stabilito una barriera funzionale. L'elevata migrazione di fondo complica l'interpretazione dei risultati ottenuti con l'epitelio infettato da agenti patogeni. Il controllo positivo comporta l'applicazione di un gradiente di un chemio-attrattore neutrofilo come fMLP attraverso lo strato epiteliale e serve a confermare che i neutrofili isolati sono funzionali. Inoltre, nel caso in cui gli strati epiteliali siano pretrattati con alcuni reagenti per valutare i loro impatti sulla migrazione transepideliale indotta da agenti patogeni, il gradiente fMLP serve a controllare per tutti gli effetti che il reagente può avere sulla capacità dei neutrofili di navigare nello strato epiteliale indipendentemente dagli effetti mediati dall'agente patogeno. Un ulteriore controllo spesso impiegato all'interno di questo sistema di dosaggio comporta l'infezione di strati epiteliali con batteri non patogeni in parallelo con agenti patogeni. Questo controllo può essere sfruttato per distinguere le risposte epiteliali rilevanti dopo l'interazione con i batteri e aiutare con l'identificazione dei fattori patogeni necessari per stimolare la migrazione transeteliale neutrofila.

La migrazione transeteliale neutrofila può essere valutata sia qualitativamente che quantitativamente. Al completamento dell'incubazione di 2 ore a seguito dell'aggiunta di neutrofili alla superficie basolaterale, i transwell vengono rimossi e i neutrofili che sono migrati completamente attraverso lo strato epiteliale alla camera apicale possono essere visti nel pozzo inferiore della piastra di migrazione a 24 pozzi. Un'immagine rappresentativa di ogni condizione viene visualizzata nella figura 1, visualizzata utilizzando un microscopio a luce invertita. Sono stati osservati pochissimi neutrofili migrare attraverso uno strato epiteliale non infetto senza un gradiente chemiotattico imposto (HBSS+) e rappresentare i livelli di fondo nel saggio (Figura 1A). Al contrario, un'abbondanza di neutrofili trasmigrati era evidente quando viene fornito un gradiente fMLP (Figura 1B). L'infezione dell'epitelio con E. coli MC1000 non patogeno ha portato a pochi neutrofili trasmigrati visibili, mentre molti neutrofili trasmigrati erano osservabili quando gli strati epiteliali sono stati infettati dalla patogena polmonare P. aeruginosa (PAO1) (Figure 1C e 1D).

I neutrofili migrati nell'esperimento vengono quantificati misurando la loro attività mieloperossidasi. Una curva standard viene utilizzata per consentire una stima del numero di neutrofili trasmigrati. Il numero di neutrofili è positivamente correlato con la quantità di attività perossidasi misurata in seguito alla llisi dei neutrofili con valori che presentano una relazione lineare nell'intervallo dei numeri neutrofili selezionati per la curva standard (2 x 103-1 x 106 cellule/ml)(Figura 2). Un numero significativo di neutrofili migra attraverso strati epiteliali in risposta a un gradiente fMLP fornito o in risposta a uno strato epiteliale infettato da PAO1 (Figura 3). Il numero di neutrofili che migrano in assenza di stimoli (HBSS+) o a seguito di infezione epiteliale apicale con E. coli MC1000 nonpathogenico è inferiore al limite di rivelazione per il saggio (Figura 3). I dati presentati nella figura 3 rappresentano il numero medio di neutrofili trasmigrati con barre di errore che rappresentano la deviazione standard di tre pozzi / condizioni indipendenti. I dati quantitativi illustrati nella figura 3 sono coerenti con le immagini rappresentative dei pozzi visualizzate nella figura 1.

Figura 1. Immagine di neutrofili dopo la migrazione transeteliale. Le immagini sono state visualizzate con un microscopio a luce invertita con ingrandimento 10X del pozzo inferiore (camera apicale) della piastra di migrazione a 24 pozzi dopo il periodo di incubazione di 2 ore con neutrofili aggiunti al pozzo superiore (camera basolaterale). (A) Controllo negativo HBSS+. (B) Controllo positivo imposto fMLP gradiente chemiotattico. (C) Strati cellulari epiteliali infetti da E. coli K12 (MC1000) nonpathogenico. (D) Strati cellulari epiteliali infetti da P. aeruginosa patogena (PAO1). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figura 2. I neutrofili ad una concentrazione iniziale di 1 x 106 sono stati sottoposti a nove diluizioni di 2 volte. Dopo la llisi, è stata determinata la quantità di attività perossidasi e il numero di neutrofili è stato grafato sull'asse x con attività di perossidasi sull'asse y. L'equazione raffigurata può essere usata per determinare il numero di neutrofili presenti in ogni pozzo successivo alla trasmigrazione in base alla quantità di attività perossidasi misurata in ogni pozzo. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figura 3. Quantificazione dei neutrofili trasmigrati. Il numero di neutrofili trasmigrati è quantificato dall'attività relativa della mieloperossidasi ad una curva standard lineare di numeri noti di neutrofili. Un numero considerevole di neutrofili trasmigrati è stato osservato a seguito dell'infezione epiteliale cellulare con P. aeruginosa patogena (PAO1) o della creazione di un gradiente apicale-basolaterale di fMLP chemio-attrattore neutrofilo. Un numero non rilevabile di neutrofili trasmigrati è stato osservato a seguito di infezione cellulare epiteliale con trattamento nonpathogenico E. coli K12 (MC1000) o solo tampone di controllo negativo (HBSS+). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.