Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Sommario

Qui ci dettaglio un metodo per cultura germi denti in fette mandibola con un chopper tessuto. Questo metodo consente l'accesso esclusivo al dente durante lo sviluppo, fornendo un'ottima opportunità per la manipolazione e lignaggio tracing, non disponibile utilizzando metodi di coltura più tradizionali.

Abstract

Cultura espianto permette la manipolazione di sviluppare organi in punti temporali specifici ed è quindi un metodo importante per il biologo dello sviluppo. Per molti organi è difficile accedere tessuto sviluppo per consentire il controllo nelle ex vivo cultura. Il metodo di coltura fetta permette l'accesso al tessuto in modo che i movimenti morfogenetici possono essere seguiti e specifiche popolazioni cellulari possono essere oggetto di manipolazione o lineage tracing.

In questo articolo descriviamo un metodo di cultura fetta che ha avuto molto successo per la cultura di germi denti in una vasta gamma di specie. Il metodo fornisce un eccellente accesso ai germi dei denti, che si sviluppano a un ritmo simile a quello osservato in vivo, circondato da altri tessuti della mascella. Questo permette interazioni tessuto tra il dente e del tessuto circostante da monitorare. Sebbene questo documento si concentra sulla germi dei denti, lo stesso protocollo può essere applicato a seguire lo sviluppo di un numerodi altri organi, come ad esempio le ghiandole salivari, cartilagine di Meckel, ghiandole nasali, lingua e orecchie.

Introduzione

Per una serie di esperimenti è importante essere in grado di coltura di tessuti ex vivo per seguire lo sviluppo. Cultura di sviluppo del tessuto fornisce l'accesso a determinati periodi di sviluppo e permette la manipolazione dei geni con l'aggiunta di fattori al terreno di coltura, o microsfere caricate, e con l'uso di trasfezione e elettroporazione ^1. Per molti esperimenti è importante essere in grado di visualizzare il tessuto come cresce, per esempio, per seguire il destino di cellule della linea etichettato come il tessuto subisce morfogenesi. Questo può essere particolarmente problematico per i tessuti che si sviluppano in profondità all'interno dell'embrione, che non sono evidenti quando un blocco di tessuto dall'embrione è coltivato. I denti sono buoni esempi di questo, come si sviluppano all'interno del processo nasale della mandibola, mascellare e frontale. Quando tutta la mandibola viene coltivato le strutture superficiali del dente possono essere visualizzati ma cambiamenti nella morfologia possono essere analizzati solo dopo il sezionamento di tessuto fissato ^{2. Abbiamo adattato una fetta tecnica di coltura in diretta che ci permette di seguire dente sviluppo germe e l'accesso alle varie parti del dente durante lo sviluppo. Le culture tecnica le fette dente germinali all'interfaccia gas-liquido, usando un metodo Trowell modificato 3. Queste culture fetta sono state molto utili nelle seguenti direttamente morfogenesi del dente, e permettendo lineage tracing di componenti distinti, quali il nodo smalto e la papilla dentale e follicolo 1,4-7. La tecnica non è limitata agli embrioni di topo ed è stato usato con successo per coltura fette diretta di maiale e serpente 8,9 tessuto dentale. Oltre al vantaggio di essere in grado di visualizzare lo sviluppo dei denti, il metodo slice ha anche il vantaggio che le fettine di tessuto sono aumentati accesso ai nutrienti dal mezzo e aria dall'incubatore. Ciò si traduce in un miglioramento della crescita dei germi dei denti, che corrispondono sviluppo in vivo e spettacoli invasione delle cellule endoteliali nella papilla 7. Al contrario, germi da denti in intere culture mandibola sviluppano più lenti di quelli in vivo e il centro della cultura è spesso necrotico in colture a lungo termine. Nella cultura fetta, il dente si sviluppa all'interno di una fetta della mandibola, e la sua interazione con l'osso circostante e sviluppare altri tessuti può essere monitorato. Nel nostro metodo il tessuto viene tagliato subito dopo dissezione senza necessità di incorporare in un mezzo di supporto 10,11 e non necessita di alcun sistema per attaccare il tessuto per il taglio di blocco. Il metodo è quindi non invasivo e rapido, consentendo molti mandibole da sezionare in una sessione.}

Protocollo

1. Avviare

1. Affinare gli strumenti di dissezione (utilizzando una pietra per affilare lubrificato con olio minerale) e sterilizzare prima di utilizzare per la cultura d'organo con un spruzzo di etanolo al 70% e la sterilizzazione a calore secco. Contrasta gli aghi di dissezione mediante elettrolisi a 2 M di idrossido di sodio con una alimentazione a 12 V.
2. Preparare il terreno di coltura utilizzati per la dissezione e la cultura di organi embrionali, costituito Modified Eagle Medium F12 Advanced Dulbecco (DMEM F12) supplementato con 1% GlutaMAX e 1% di penicillina-streptomicina.

2. Embrione dissezione

1. Abbattere una donna incinta a tempo accoppiato con un metodo programma uno come approvato dal Ministero degli Interni o di altro organo di governo. Sezionare via la pelle intorno al basso ventre, e tagliare aprire l'addome con le forbici. Individuare i due corni uterini, che collegano insieme alla linea mediana inferiore.
2. Sezionare l'utero e posto in un tubo riempito con il mezzo sul ghiaccio. When su ghiaccio, il tessuto può essere lasciato per diverse ore.
3. Rimuovere l'utero e posto in una capsula di Petri in mezzo al microscopio. Ove possibile dissezioni embrionali dovrebbero essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione.
4. Sezionare gli embrioni dall'utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali.
5. Decapitare gli embrioni usando un ago di tungsteno e trasferire le teste in un fresco piatto di mezzo.
6. Isolare le mandibole dalle teste inserendo un ago nella cavità orale e tagliare verso la parte posteriore della testa (Figure 1A e 1B). Isolato mandibole possono essere memorizzati temporaneamente in mezzo su ghiaccio durante l'attesa per tritare.
7. Per intere fette mandibola stadi E11.5-E15.5 sono ideali per la cultura dente germe. Dopo E15.5 l'osso nella mandibola di sviluppo è troppo difficile per tritare. Fette dente può ancora essere apportate ma l'osso (dentario e formare l'osso alveolare) devono prima essere rimossila dissezione prima tagliare ^{il 9.} Rimuovere accuratamente osseo con aghi di tungsteno e pinze.

3. Embrione affettare

1. Preparare le fette di tessuto mandibola con un chopper tessuto tabella standard (Figura 1C). Utilizzare una lama fresca dopo circa 200 mandibole, e assicurarsi che si trova a filo con il disco di montaggio quando cade.
2. Pulire il disco di montaggio e lama con il 70% di etanolo prima dell'uso. Bisogna fare attenzione quando si utilizza la macchina, in quanto la lama è molto tagliente.
3. Impostare il chopper ad una distanza di taglio tra 200-400 micron a seconda dell'età del campione, ea seconda se è necessaria l'intero germe dente. Impostare la pressione della lama al massimo.
4. Trasferire una mandibola al disco di montaggio in plastica con una pipetta o pinze. Disporre la mandibola sulla realizzazione del disco che l'orientamento è ancora chiaro. La linguetta di sviluppo può essere utilizzato come punto di riferimento utile per determinare l'orientamento. Per molari uso afRontal / orientamento trasversale (vedi piano di taglio in Figura 1B), mentre per incisivi utilizzare una fetta sagittale attraverso la mandibola per riflettere il diverso orientamento di questi denti crescono (vedi piano di taglio nella Figura 2A).
5. Rimuovere l'eccesso di terreno da tutto il tessuto su carta da filtro in modo da asciugare leggermente la mandibola sul disco di montaggio.
6. Subito dopo l'essiccazione, posizionare il disco sul tavolo in acciaio inox circolare del chopper. Accendere la macchina e premere start. La tabella attraversa automaticamente da sinistra a destra, mentre allo stesso tempo il braccio taglio portando la lama è sollevato e lasciato cadere fino a 200 colpi / min.
7. Spegnere la macchina una volta che il tessuto è stato completamente tranciato. Assicurarsi che il braccio lama è in posizione sollevata e rimuovere il disco. Non mettere le dita sotto il braccio lama o lasciare la macchina incustodita quando tagliare.
8. Prendete il disco di montaggio e aggiungere immediatamente medie to le fette sul disco al fine di evitare un eccessivo essiccamento. Rimuovere accuratamente il tessuto tranciato dal fondo del disco utilizzando un ago di tungsteno e poi pipetta in una piccola capsula di Petri di media (Figura 2A).
9. Separare le fette usando un ago e quindi selezionare le fette di tessuto contenenti il tessuto di interesse allo stereomicroscopio (Figure 1D, 1E, e 2B). Mettere le fette selezionati in piatti di coltura fresco con il mezzo.

4. Fetta Cultura

1. Preparare organo coltura piatti centrali pozzetti pronti per cultura aggiungendo circa 2 ml di acqua autoclavato per pozzetto esterno per prevenire la disidratazione, e posizionando una griglia metallica attraverso il centro del piatto (Figure 3A e 3B).
2. Preparare le griglie metalliche tagliando strisce di circa 4 cm x 1.5 cm da fogli di maglia di acciaio inossidabile. Utilizzare un pugno buco per fare un buco al centro e piegarei lati per creare un fine sfalsata. La griglia dovrebbe adattarsi perfettamente sulle pozzetto centrale, situata parallelamente al fondo del piatto (Figure 3A e 3B). Autoclave le griglie per la sterilizzazione prima dell'uso.
3. Tagliare un pezzo di polietilene tereftalato trasparente (PET) membrana (dimensione dei pori 0,4 micron) sufficiente a coprire il foro nella griglia. Posizionare la membrana tagliata nel piatto con la fetta selezionata.
4. Posizionare la fetta in cima alla membrana e poi sollevare con cura la membrana fuori del mezzo, con fetta appiattita nel centro.
5. Posizionare il filtro sulla griglia sopra il foro circolare al centro, e aggiungere circa 1 ml di terreno di coltura al pozzo, fino al livello della membrana.
6. Per manipolazioni aggiungere proteine ​​o piccole molecole inibitrici al mezzo (ad esempio ^8).
7. Fotografare la fetta per un record di morfologia al giorno 0 della cultura.
8. Porre le capsule in atmosfera umidificata al 5% CO _{2 a 37 ° C in un incubatore.}
9. Fotografare le culture a intervalli regolari per in media 7 giorni. Modificare il terreno di coltura ogni 48-72 ore. Per photography visualizzare le fette con una sorgente di luce da sotto (Figure 2C-E).

5. Lineage Tracing

Se è necessario lignaggio tracing, coloranti lipofili come DII o DiO possono essere iniettati nel germe del dente prima del punto 4, della cultura fetta.

1. Tirare aghi capillari di vetro con un estrattore ago.
2. Rompere la punta dell'ago con pinze e inserire la punta verso il basso nella soluzione colorante. Lasciare agire per qualche minuto, mentre il colorante riempie la punta per azione capillare.
3. Posizionare l'ago riempito in un supporto e collegare tramite tubi ad un iniettore o alla bocca di aspirazione.
4. Posizionare la punta dell'ago nel mezzo di coltura di toccare la superficie della fetta a causa di etichettatura. Applicare una pressione dell'aria di spostare una piccola quantità di colorante fuori un agoD sul tessuto.
5. Rimuovere l'ago e controllare l'etichettatura in fluorescenza.
6. Fette etichettati correttamente possono essere trasferiti ai filtri e coltivate come descritto nel passaggio 4.

Risultati

Al fine di seguire il movimento del primo follicolo dentale molare, 250 micron fette frontali sono stati prelevati attraverso una mandibola con il metodo sopra descritto. Il follicolo dentale è lo strato di mesenchima che circonda lo smalto epitelio esterno (OEE) del dente di sviluppo, ed è stato già dimostrato di partecipare alla formazione di tessuto del periodonto ^6. Mandibole sono stati sezionati a E14.5, nella fase tappo dello sviluppo dei denti. Nella fetta il contorno dell'epitelio dentale era chiaro, ...

Discussione

Questo metodo di coltura dente ha il vantaggio che l'accesso al germe dente è eccellente, consentendo lignaggio accurato tracciamento e posizionamento di perline all'interno dell'epitelio o mesenchima. Regioni definite del dente di sviluppo germe possono quindi essere specificamente mirati. Durante la coltura morfologia mutevole del germe dente può essere seguito, e l'effetto di manipolazioni valutato rapidamente.

Il metodo, tuttavia, è adatto solo per giovani germi dente pri...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo	VWR	101077Y	100% etanolo è stato diluito in H2O distillato al 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicillina-streptomicina	Sigma	P0781
DiI (sonde molecolari)	Vybrant	V-22885	Soluzione
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Sonde molecolari)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Sterilizzazione a calore secco
Tritatessuti McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180	da tavolo standard
(piatto per coltura di organi Center-Well)	Membrane per	353037
(inserti per colture cellulari, 0,4 μ BD	Falcon	353090	Membrana incisa su pista in PET, formato a 6 pozzetti
Griglie metalliche (Acciaio Inox - AISI 304 - Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubatore	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Picospritzer a canale singolo III
Capillare in vetro con filamento 1 mm	WPI	TW100F-4
Filo di tungsteno 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Filo di tungsteno 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Tubi aspiratore	Sigma	A5177	Utilizzato per traccianti di linea di aspirazione della bocca