Decellularizzazione e ricellularizzazione polmonare di primati non umani utilizzando un bioreattore specializzato per grandi organi

Summary

La decellularizzazione dell'intero organo produce scaffold biologici naturali che possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Viene presentata la descrizione di un modello di rigenerazione polmonare di primati non umani in cui interi polmoni vengono decellularizzati e quindi seminati con cellule staminali adulte e cellule endoteliali in un bioreattore che facilita la circolazione vascolare e la ventilazione con mezzi liquidi.

Abstract

C'è un numero insufficiente di polmoni disponibili per soddisfare le esigenze attuali e future di trapianto di organi. La rigenerazione dei tessuti bioartificiali è un'alternativa interessante al classico trapianto di organi. Questa tecnologia utilizza la matrice extracellulare biologica naturale (ECM) di un organo come impalcatura su cui le cellule autologhe o staminali/progenitrici possono essere seminate e coltivate in modo tale da facilitare la rigenerazione del tessuto originale. La MEC naturale viene isolata da un processo chiamato decellularizzazione. La decellularizzazione si ottiene trattando i tessuti con una serie di detergenti, sali ed enzimi per ottenere un'efficace rimozione del materiale cellulare lasciando intatta la MEC. Gli studi condotti utilizzando la decellularizzazione e la successiva ricellularizzazione dei polmoni dei roditori hanno dimostrato un successo marginale nella generazione di tessuto polmonare in grado di scambiare gas in vivo. Pur offrendo una prova di concetto essenziale, i modelli di roditori non sono direttamente traducibili per l'uso umano. I primati non umani (NHP) offrono un modello più adatto in cui studiare l'uso della produzione di organi bioartificiali per un eventuale uso clinico.

Vengono presentati i protocolli per ottenere la completa decellularizzazione dei polmoni acquisiti dal macaco rhesus NHP. I polmoni acellulari risultanti possono essere seminati con una varietà di cellule, tra cui cellule staminali mesenchimali e cellule endoteliali. Il manoscritto descrive anche lo sviluppo di un sistema di bioreattori in cui i polmoni di macaco seminati con cellule possono essere coltivati in condizioni di allungamento meccanico e di tensione fornite dalla ventilazione a pressione negativa e dalla perfusione pulsatile attraverso il sistema vascolare; Queste forze sono note per dirigere la differenziazione lungo le linee polmonare ed endoteliale, rispettivamente. Vengono forniti risultati rappresentativi della decellularizzazione e della semina cellulare.

Introduction

La bioingegneria dei tessuti e degli organi è un'aggiunta interessante al campo della medicina rigenerativa. La creazione di organi "cresciuti in laboratorio" adatti al trapianto nei pazienti per sostituire la funzionalità degli organi malati è altamente auspicabile al fine di soddisfare la domanda attuale e futura per le esigenze di trapianto. I principi dell'ingegneria tissutale sono incentrati sulla semina dei tipi di cellule desiderate, o dei loro progenitori, in un'impalcatura che supporta la forma del tessuto ingegnerizzato, fornendo al contempo i fattori di crescita appropriati e le condizioni di coltura necessarie per imitare i processi di sviluppo o rigenerat....

Protocol

1. Decellularizzazione polmonare di macaco intero organo

1. Preparazione delle soluzioni
   1. Autoclave 10-15 L di acqua deionizzata (dH₂O) in bottiglie da 1-2 L.
   2. Preparare la "soluzione di Tritone" (0,1% di Triton X-100 in dH₂O) mescolando 1 ml di Triton X-100 in 999 ml di dH₂O e agitando su un agitatore magnetico. Filtrare la soluzione attraverso un apparecchio filtrante da 0,22 μm. Conservare a temperatura ambiente.
   3. Preparare la "soluzione SDC" (2% di SDC in dH₂O) aggiungendo lentamente 20 g di desossicolato di sodio (SDC) a ~900 ml di dH₂O mescolando. Una volta di....

Results

I risultati mostrati di seguito rappresentano esperimenti separati in cui le vie aeree o i compartimenti vascolari sono stati seminati con cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo del macaco rhesus o cellule endoteliali microvascolari derivate dal polmone rhesus, rispettivamente, che sono state isolate e caratterizzate come precedentemente descritto^16-18.

Durante tutto il processo di decellularizzazione, i polmoni dei macachi hanno mostrato uno sbiancamento progress.......

Discussion

I tessuti possono essere decellularizzati in modo efficiente ed efficace con una serie di metodi che impiegano agenti fisici, chimici ed enzimatici^12,20. Le sfide della produzione di matrici biologiche 3D da organi di grandi dimensioni includono la necessità di grandi volumi di soluzioni di decellularizzazione, costose apparecchiature commerciali (ad esempio bioreattori) e una quantità vertiginosa di perturbazioni metodologiche necessarie per ottenere il prodotto finale derivato dal tessuto. Il nostro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitroprussiato di sodio	Sigma-Aldrich	71778-25G
Eparina sale sodico	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Desossicolato di sodio	Fisher	BP349-100
Cloruro di sodio	Fisher	7647-14-5
DNasi pancreatica bovina	Sigma-Aldrich	DN25	Preparare il brodo, aliquotare e congelare
il solfato di magnesio	Fisher	10034-99-8
Cloruro di calcio	Fisher	C614-500
PBS (no Ca/Mg)	Gibco, Life Technologies	10010-031
Antibiotico-Antimicotico	Gibco Life Technologies	15240062
Cell Culture Media
Alpha MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
Medium 199	Gibco Life Technologies	11150067
Siero fetale bovino premium	Atlanta Biologicals	S11150
L-glutammina 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS)	ScienCell	1052
Antibiotico-Antimicotico	Gibco Life Technologies	15240062
Seeding cellulare e coltura di bioreattori
Valvole di ritegno	Cole-Parmer	EW-98553-20
Connettori a Y	Cole-Parmer	ED-30614-08
Rubinetti a 3 vie	Harvard Apparatus	721664
tubi MasterFlex L/S 14	Cole-Parmer	96420-14
Tubo MasterFlex L/S 16	Cole-Parmer	96420-16
Blocco maschio Luer 1/8 in	Cole-Parmer	EW-45505-04
Luer femmina 1/8 in	Cole-Parmer	SI-45502-04
Tappo di blocco Luer maschio	Cole-Parmer	EW-45505-56
Porte di iniezione	Medi-Dose EPS	IV2004
Tubo in lattice	St. Louis Medical Suppy	HN10910
Fascetta stringitubo	Cole-Parmer	EW-06832-02
Barattolo a bocca larga da 2 L	Fisher	05-719-276
Siringhe da 60 ml	Fisher	NC9035364