La decellularizzazione dell'intero organo produce scaffold biologici naturali che possono essere utilizzati per la medicina rigenerativa. Viene presentata la descrizione di un modello di rigenerazione polmonare di primati non umani in cui interi polmoni vengono decellularizzati e quindi seminati con cellule staminali adulte e cellule endoteliali in un bioreattore che facilita la circolazione vascolare e la ventilazione con mezzi liquidi.
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Articolo metodologico
Decellularizzazione e ricellularizzazione polmonare di primati non umani utilizzando un bioreattore specializzato per grandi organi
In questo articolo
Sommario
Abstract
C'è un numero insufficiente di polmoni disponibili per soddisfare le esigenze attuali e future di trapianto di organi. La rigenerazione dei tessuti bioartificiali è un'alternativa interessante al classico trapianto di organi. Questa tecnologia utilizza la matrice extracellulare biologica naturale (ECM) di un organo come impalcatura su cui le cellule autologhe o staminali/progenitrici possono essere seminate e coltivate in modo tale da facilitare la rigenerazione del tessuto originale. La MEC naturale viene isolata da un processo chiamato decellularizzazione. La decellularizzazione si ottiene trattando i tessuti con una serie di detergenti, sali ed enzimi per ottenere un'efficace rimozione del materiale cellulare lasciando intatta la MEC. Gli studi condotti utilizzando la decellularizzazione e la successiva ricellularizzazione dei polmoni dei roditori hanno dimostrato un successo marginale nella generazione di tessuto polmonare in grado di scambiare gas in vivo. Pur offrendo una prova di concetto essenziale, i modelli di roditori non sono direttamente traducibili per l'uso umano. I primati non umani (NHP) offrono un modello più adatto in cui studiare l'uso della produzione di organi bioartificiali per un eventuale uso clinico.
Vengono presentati i protocolli per ottenere la completa decellularizzazione dei polmoni acquisiti dal macaco rhesus NHP. I polmoni acellulari risultanti possono essere seminati con una varietà di cellule, tra cui cellule staminali mesenchimali e cellule endoteliali. Il manoscritto descrive anche lo sviluppo di un sistema di bioreattori in cui i polmoni di macaco seminati con cellule possono essere coltivati in condizioni di allungamento meccanico e di tensione fornite dalla ventilazione a pressione negativa e dalla perfusione pulsatile attraverso il sistema vascolare; Queste forze sono note per dirigere la differenziazione lungo le linee polmonare ed endoteliale, rispettivamente. Vengono forniti risultati rappresentativi della decellularizzazione e della semina cellulare.
Introduzione
La bioingegneria dei tessuti e degli organi è un'aggiunta interessante al campo della medicina rigenerativa. La creazione di organi "cresciuti in laboratorio" adatti al trapianto nei pazienti per sostituire la funzionalità degli organi malati è altamente auspicabile al fine di soddisfare la domanda attuale e futura per le esigenze di trapianto. I principi dell'ingegneria tissutale sono incentrati sulla semina dei tipi di cellule desiderate, o dei loro progenitori, in un'impalcatura che supporta la forma del tessuto ingegnerizzato, fornendo al contempo i fattori di crescita appropriati e le condizioni di coltura necessarie per imitare i processi di sviluppo o rigenerativi. Mentre gli scaffold sintetici sono stati utilizzati per l'ingegneria tissutale, la matrice extracellulare naturale (ECM) può essere la migliore fonte di scaffold organo-specifici per questo scopo. La decellularizzazione dell'intero organo è un processo che consente la rimozione delle cellule lasciando intatti gli aspetti chimici e strutturali della ECM nativa. L'impalcatura della matrice acellulare risultante può essere utilizzata come piattaforma su cui le cellule rigenerative possono essere seminate e coltivate in vitro1,2.
Diversi modelli di decellularizzazione polmonare e successiva ricellularizzazione di roditori sono stati sviluppati per studiare la fattibilità di questa tecnologia3-6. Pur offrendo una prova di concetto essenziale, i modelli di roditori non sono direttamente traducibili in base alle esigenze cliniche umane. Uno studio recente ha sottolineato che le risposte genomiche alle lesioni traumatiche (e all'infiammazione correlata) non si correlano bene tra topi e esseri umani; Questi risultati sollevano interrogativi sulla validità dell'uso dei topi come modelli per processi biochimici così complessi nell'uomo7. I modelli di primati non umani (NHP) offrono il vantaggio di assomigliare molto alla biologia degli esseri umani a livello genomico, anatomico e fisiologico e consentono una manipolazione più flessibile per una maggiore estrapolazione all'uso umano. Il macaco rhesus è stato utilizzato in una varietà di applicazioni precliniche ed è un modello eccellente in cui studiare l'ingegneria tissutale8-11. Recentemente abbiamo descritto la decellularizzazione dei polmoni del macaco rhesus (Macacca mulatta) utilizzando una procedura che ha un impatto minimo sulla ECM12 polmonare. La decellularizzazione polmonare si ottiene trattando il tessuto consecutivamente con quattro soluzioni di decellularizzazione composte da detergenti, sali ed enzimi con lavaggio intermittente con acqua deionizzata (dH2O) e PBS. Abbiamo ottimizzato questa procedura modificando un protocollo originariamente descritto da Price et al.4 Una varietà di tecniche istologiche e analitiche proteiche sono state utilizzate per caratterizzare i componenti delle matrici acellulari risultanti rispetto ai polmoni nativi dei macachi.
In questo rapporto, dimostriamo un protocollo dettagliato per la decellularizzazione dei polmoni di primati non umani e la ricellularizzazione degli scaffold polmonari acellulari risultanti in un bioreattore di grandi organi originariamente dimostrato da Calle et al. 13 in JoVE. Modificando il loro protocollo originale per soddisfare i requisiti di dimensioni, ventilazione e perfusione per i polmoni di animali di grandi dimensioni, la tecnologia è stata spostata con successo dal modello di roditore al modello di macaco rhesus. Tutti gli studi presentati in questo rapporto sono stati eseguiti in conformità con le politiche del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (IBC) in vigore presso il Tulane National Primate Research Center. La dimostrazione di questa tecnica è essenziale perché l'identificazione delle strutture anatomiche e la manipolazione fisica di organi più grandi è a volte difficile senza visualizzare le fasi del protocollo. Gli studi resi possibili da questi metodi forniscono una base per studi preclinici essenziali nei polmoni decellularizzati del macaco rhesus in cui è possibile valutare la ricellularizzazione con cellule staminali della linea mesenchimale rhesus e cellule endoteliali microvascolari rhesus. La nostra versione di questo bioreattore simula l'ambiente di sviluppo e applica le forze di allungamento meccanico e di deformazione nei polmoni di animali di grandi dimensioni e consente lo studio della ricellularizzazione polmonare in condizioni note per facilitare lo sviluppo polmonare ed endoteliale13-15.
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Protocollo
1. Decellularizzazione polmonare di macaco intero organo
- Preparazione delle soluzioni
- Autoclave 10-15 L di acqua deionizzata (dH2O) in bottiglie da 1-2 L.
- Preparare la "soluzione di Tritone" (0,1% di Triton X-100 in dH2O) mescolando 1 ml di Triton X-100 in 999 ml di dH2O e agitando su un agitatore magnetico. Filtrare la soluzione attraverso un apparecchio filtrante da 0,22 μm. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la "soluzione SDC" (2% di SDC in dH2O) aggiungendo lentamente 20 g di desossicolato di sodio (SDC) a ~900 ml di dH2O mescolando. Una volta disciolto l'SDC, trasferire la soluzione in un cilindro graduato e portare il volume a 1 ml con dH2O. Filtrare la soluzione attraverso un apparecchio filtrante da 0,22 μm. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la "soluzione di NaCl" aggiungendo 58 g di NaCl a ~900 ml di dH2O e mescolare fino a completa dissoluzione. Aggiungere dH2O fino a un volume finale di 1 L, filtrare e conservare a temperatura ambiente.
- Preparazione dell'organo
- È necessario prestare la massima attenzione per prevenire incidenti di esposizione infettiva quando si lavora con tessuti di macaco. Prima di maneggiare tessuti di primati non umani, indossare i seguenti dispositivi di protezione individuale (DPI): mascherina chirurgica, visiera, guanti chirurgici, camice monouso e un secondo strato di guanti chirurgici.
- Raccogliere blocchi cuore-polmone intatti dalla necroscopia animale in PBS contenente 50 U/ml di eparina per prevenire la coagulazione del sangue esterno.
- Con i polmoni distesi in un vassoio da dissezione, incannulare l'arteria polmonare utilizzando un connettore Luer femmina con una punta di dimensioni adeguate. Fissare la cannula in posizione con una fascetta sterilizzata con alcol.
- Infilare una fascetta sterile attorno alla trachea, inserire un connettore Luer femmina da 0,250 pollici nell'apertura tracheale e stringere la fascetta attorno all'aletta del connettore per tenere la trachea in posizione attorno all'aletta .
- Rimuovere l'aria intrappolata dai polmoni instillando PBS contenente 30 U/ml di eparina e 5 μg/ml di nitroprussiato sodico (SNP). Lasciare che la soluzione venga espulsa con rinculo naturale e ripetere l'instillazione altre due volte. Dopo la terza instillazione, tappare la cannula tracheale Luer con un tappo Luer per trattenere la soluzione nei polmoni.
- Tagliare l'apice del cuore e irrigare i ventricoli interni con PBS-eparina-SNP per rimuovere il sangue residuo. Lacera entrambi gli atri per facilitare il drenaggio dei circuiti polmonari in caso di perfusione.
- Immergere il blocco cuore-polmone in dH2O. Riempire una siringa da 60 ml con la soluzione PBS-eparina-SNP. Usando una pinza, immergere la cannula arteriosa in modo che tutte le bolle d'aria fuoriescano dall'apertura vascolare. Collegare la siringa e rimuovere con cautela lo stantuffo e lasciare che il liquido fluisca nel sistema vascolare.
- Rimuovere il tappo dalla cannula tracheale e consentire l'espulsione del fluido nelle vie aeree per rinculo naturale. Continuare ad aggiungere la soluzione di PBS-eparina-SNP alla siringa collegata alla cannula vascolare per mantenere una pressione di ~15-20 cm H2O sopra l'arteria. Continuare la perfusione fino a rimuovere quanto più sangue possibile dal sistema vascolare polmonare.
- Decellularizzazione
- Giorno 1: Immergere il blocco cuore-polmone in dH2O. Gonfiare e perfondere il polmone con dH2O utilizzando siringhe da 60 ml attaccate rispettivamente alle cannule tracheali e arteriose sommerse. Ripetere i lavaggi delle vie aeree e vascolari con dH2O 4x in più per un totale di cinque risciacqui.
- Togliere i polmoni dall'acqua e immergere il blocco nella soluzione di Triton. Gonfiare e perfondere i polmoni con la soluzione di Triton come prima. Ripetere l'instillazione una seconda volta e incubare gli organi sommersi in soluzione di Triton per una notte a 4 °C.
- GIORNO 2: Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il blocco polmonare dalla soluzione di Triton, lavare esternamente con dH2O, quindi immergere il blocco in dH2O fresco. Ripetere i lavaggi con dH2O 5 volte come al punto 1.3.1.
- Rimuovere i polmoni da dH2O e immergerli nella soluzione SDC. Gonfiare e perfondere con la soluzione SDC nello stesso modo del passaggio 1.3.2. Incubare immerso in soluzione SDC per una notte a 4 °C.
- GIORNO 3: Lavare nuovamente il fazzoletto con dH2O come al punto 1.3.1.
- Rimuovere il fazzoletto da dH2O e immergerlo nella soluzione di NaCl. Gonfiare e perfondere con la soluzione di NaCl nello stesso modo del punto 1.3.2. Incubare immerso in una soluzione di NaCl per 1 ora a temperatura ambiente.
- Pulire i polmoni dalla soluzione di NaCl con dH2O come al punto 1.3.1.
- Preparare una nuova "soluzione di DNasi" (30 μg/ml di DNasi, 1,3 mM di MgSO4, 2,0 mM di CaCl2 in dH2O) Immergere i polmoni in questa soluzione e instillarla nelle vie aeree e nel sistema vascolare come al punto 1.3.2. Incubare i polmoni in soluzione di DNasi per 1 ora a temperatura ambiente.
- Preparare una nuova "soluzione PBS" (1x PBS + 5x antibiotico/antimicotico). Rimuovere i polmoni dalla soluzione di DNasi e lavare esternamente con la soluzione di PBS. Immergere i polmoni in una soluzione di PBS e lavare con questa soluzione cinque volte come al punto 1.3.1.
- Conservare i polmoni in soluzione di PBS in un contenitore sigillato per una notte a 4 °C. Il giorno successivo (GIORNO 4), lavare i polmoni in una soluzione di PBS fresca e ghiacciata cinque volte come al punto 1.3.1 e conservare in soluzione di PBS in un contenitore sterile e sigillato a 4 °C fino all'uso.
2. Bioreattore per grandi organi
- Assemblaggio e installazione dei tessuti
- Assemblare in anticipo le strutture dell'ansa respiratoria e dell'ansa vascolare, nonché gli adattatori delle cannule tracheali e vascolari (Figura 1). Ad eccezione dei filtri dell'aria in confezione sterile e delle porte per siringhe, sterilizzare in autoclave tutti i componenti del bioreattore.
- Assemblare i componenti del bioreattore sotto una cappa a flusso laminare secondo lo schema della Figura 2. Riempire la camera principale con un terreno di coltura che è stato bilanciato all'atmosfera di CO2 al 5% di un incubatore per colture cellulari immediatamente prima dell'uso nel bioreattore.
- Applicare gli adattatori per cannule tracheali e vascolari alle cannule polmonari e installare gli organi nella camera principale del bioreattore immergendo i polmoni nel terreno di coltura e collegando gli adattatori per cannule alle porte appropriate nel coperchio modificato. Una volta collegato, fissare il coperchio in modo sicuro e saldo; La camera non verrà riaperta per tutta la durata della ricellularizzazione.
- Riempire il serbatoio tracheale per circa metà con terreno di coltura e applicare il tappo modificato.
- Applicare filtri per siringa sterili da 0,22 μm, tappi Luer e porte per siringa a tutte le camere come indicato.
- Collegare il serbatoio della trachea alla camera principale tramite l'apparecchio ad anello di respirazione. Collegare il tubo dell'anello di respirazione come indicato.
- Aspirare l'aria dal tubo utilizzando le porte della siringa e una siringa da 60 ml dotata di ago da 18 G; spostare la direzionalità dei rubinetti a 3 vie per dirigere il flusso di liquido nella siringa.
- Spostare le camere del bioreattore sigillate e collegate in modo contiguo con gli organi installati in un incubatore per colture tissutali per bilanciare la temperatura e il gas. Ventilare i polmoni utilizzando una pompa a siringa collegata alla camera principale a ~1 "respiro" completo ogni 2 minuti e perfondere il sistema vascolare tramite la pompa peristaltica a circa 10 ml/min per un totale di ~30 minuti.
- Inseminazione delle vie aeree
- Preparare le sospensioni di cellule da seminare nelle vie aeree alla densità cellulare desiderata (il volume dipenderà dalle dimensioni dell'organo).
- Gonfiare i polmoni con la sospensione cellulare iniettando delicatamente attraverso la porta della siringa collegata al rubinetto a tre vie nell'ansa respiratoria.
- Tenere i polmoni staticamente a 37 °C, 5% CO2 durante la notte senza vie aeree o perfusione vascolare per consentire alle cellule di attaccarsi alla matrice polmonare decellularizzata.
- Dopo l'incubazione notturna, riavviare il programma standard di ventilazione delle vie aeree e coltivare gli organi per 3-7 giorni (o altra durata desiderata).
- Semina vascolare
- Preparare le sospensioni di colture cellulari endoteliali come sopra per la semina delle cellule delle vie aeree.
- Trasferire la sospensione cellulare nel serbatoio di semina endoteliale che contiene una piccola ancoretta magnetica.
- Modificare la direzionalità del percorso del flusso dalla camera principale al serbatoio di semina endoteliale ruotando la valvola sul rubinetto posizionato nel tubo che collega questi due compartimenti e seminare gradualmente le cellule endoteliali mescolando delicatamente utilizzando la pompa peristaltica.
- Quando la semina è completa (cioè il volume della sospensione di cellule endoteliali è esaurito nel serbatoio di semina endoteliale), interrompere la perfusione e incubare staticamente per ~4-6 ore. Ricominciare la perfusione vascolare con il terreno della camera principale a una velocità di ~10 ml/min (o pressione desiderata se monitorata).
- Coltura per 3-7 giorni con perfusione vascolare continua.
3. Risoluzione dei problemi e approcci alternativi
- Incannulamento tracheale: le suture possono essere utilizzate al posto di una fascetta per tenere in posizione la cannula Luer se la trachea è troppo piccola. Una connessione Luer femmina da 1/4 di pollice funge da cannula sufficiente per un'ampia gamma di diametri della trachea.
- Rimozione del sangue mediante perfusione dell'arteria polmonare: poiché i tessuti vengono raccolti da animali cadaveri, i microtrombi sono comuni e impediscono che alcune aree del letto capillare polmonare vengano completamente ripulite dal sangue residuo. Durante la decellularizzazione, tuttavia, questi piccoli vasi diventano permeabili e i reagenti di decellularizzazione lisano e degradano efficacemente questi coaguli. La perfusione predecellularizzante deve essere eseguita per eliminare quanto più sangue possibile, ma non è necessario rimuovere tutte le tracce di sangue dal parenchima.
- Espulsione di liquidi dai polmoni: i polmoni di macaco conservano un forte rinculo naturale ex vivo, anche se gonfiati con liquidi. Durante la decellularizzazione, tuttavia, le cellule vengono lisate e rilasciano materiali (incluso il DNA) che aumentano la viscosità dei fluidi instillati, rendendoli così più difficili da espellere. L'incubazione notturna a 4 °C mentre si è immersi nel liquido instillato è solitamente sufficiente per consentire ai polmoni di espellere completamente il fluido viscoso. In alternativa, lasciare espellere quanto più liquido possibile dai polmoni e poi procedere con l'instillazione delle soluzioni successive; L'aggiunta di detergenti e lavaggi con acqua deionizzata di solito facilita la rimozione dei fluidi viscosi e consente alla decellularizzazione di procedere in modo efficiente.
- Aggiunta di antibiotici alle soluzioni detergenti: antibiotici e antimicotici possono essere aggiunti alle soluzioni di lavaggio con acqua deionizzata e alle soluzioni detergenti; tuttavia, la penicillina/streptomicina precipita in presenza di desossicolato di sodio e questi precipitati possono interferire con i processi di decellularizzazione e lavaggio. Inoltre, la presenza di antibiotici/antimicotici non è necessaria durante la decellularizzazione in quanto i detergenti utilizzati a queste concentrazioni sono in grado di lisare e uccidere i microbi. Dopo la decellularizzazione, il risciacquo e la conservazione con una soluzione di PBS (contenente 5x penicillina/streptomicina/amfotericina B) sono sufficienti per prevenire la maggior parte della contaminazione.
- Rimozione dell'aria dal tubo del bioreattore: l'aria viene aspirata in modo efficiente dal tubo del bioreattore utilizzando una siringa con un ago inserito nelle porte dell'ago nei rubinetti a tre vie. In alternativa, 1x PBS o terreno di coltura può essere lavato attraverso il tubo prima di installare gli organi utilizzando una siringa collegata allo stesso modo.
- Ventilazione e perfusione dei polmoni durante e dopo la ricellularizzazione: sebbene le velocità e i tempi di flusso elencati in questo rapporto fossero sufficienti per l'attacco cellulare, nonché per la ventilazione del liquido delle vie aeree e la perfusione vascolare, questi valori dovrebbero essere determinati empiricamente dall'utente. I tempi di coltura possono anche essere regolati in base ai tassi di crescita delle cellule instillate.
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Risultati
I risultati mostrati di seguito rappresentano esperimenti separati in cui i compartimenti delle vie aeree o vascolari sono stati seminati rispettivamente con cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo di macaco reso o con cellule endoteliali microvascolari derivate dal polmone di macaco reso, isolate e caratterizzate come descritto in precedenza16-18.
Durante tutto il processo di descellularizzazione, i polmoni di macaco hanno mostrato un progressivo schiarimento, cul...
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Discussione
I tessuti possono essere decellularizzati in modo efficiente ed efficace con una serie di metodi che impiegano agenti fisici, chimici ed enzimatici12,20. Le sfide della produzione di matrici biologiche 3D da organi di grandi dimensioni includono la necessità di grandi volumi di soluzioni di decellularizzazione, costose apparecchiature commerciali (ad esempio bioreattori) e una quantità vertiginosa di perturbazioni metodologiche necessarie per ottenere il prodotto finale derivato dal tessuto. Il nostro...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare gli editori di Tissue Engineering per aver permesso l'utilizzo di immagini di una pubblicazione precedente in questo rapporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nitroprussiato di sodio | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Eparina sale sodico | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Desossicolato di sodio | Fisher | BP349-100 | |
| Cloruro di sodio | Fisher | 7647-14-5 | |
| DNasi pancreatica bovina | Sigma-Aldrich | DN25 | Preparare il brodo, aliquotare e congelare |
| il solfato di magnesio | Fisher | 10034-99-8 | |
| Cloruro di calcio | Fisher | C614-500 | |
| PBS (no Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiotico-Antimicotico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Cell Culture Media | |||
| Alpha MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Medium 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Siero fetale bovino premium | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-glutammina 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiotico-Antimicotico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Seeding cellulare e coltura di bioreattori | |||
| Valvole di ritegno | Cole-Parmer | EW-98553-20 | |
| Connettori a Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| Rubinetti a 3 vie | Harvard Apparatus | 721664 | |
| tubi MasterFlex L/S 14 | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| Tubo MasterFlex L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Blocco maschio Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Luer femmina 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Tappo di blocco Luer maschio | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Porte di iniezione | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Tubo in lattice | St. Louis Medical Suppy | HN10910 | |
| Fascetta stringitubo | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| Barattolo a bocca larga da 2 L | Fisher | 05-719-276 | |
| Siringhe da 60 ml | Fisher | NC9035364 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
