Descriviamo un metodo per impiantare e mantenere finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Queste finestre forniscono un accesso ottico cronico al midollo spinale per il monitoraggio della dinamica cellulare a livello subcellulare in animali vivi utilizzando la microscopia a due fotoni.
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Articolo metodologico
Impianto di finestre in vetro del midollo spinale in topi adulti con encefalomielite autoimmune sperimentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nei roditori adulti è il modello sperimentale standard per lo studio delle malattie demielinizzanti autonomiche come la sclerosi multipla. Qui presentiamo un protocollo di impianto con finestra di vetro a basso costo e riproducibile, adatto per la microscopia intravitale e lo studio delle dinamiche della citoarchitettura del midollo spinale con risoluzione subcellulare in topi adulti vivi con EAE. In breve, esponiamo chirurgicamente le vertebre T12-L2 e costruiamo una camera attorno alle vertebre esposte utilizzando una combinazione di cianoacrilato e cemento dentale. Una laminectomia viene eseguita da T13 a L1 e un sottile strato di elastomero siliconico trasparente viene applicato sulla superficie dorsale del midollo spinale esposto. Un vetrino coprioggetti modificato viene impiantato sul midollo spinale esposto, facendo attenzione che il vetro non entri in contatto diretto con il midollo spinale. Per ridurre l'infiltrazione di cellule infiammatorie tra la finestra e il midollo spinale, il trattamento antinfiammatorio viene somministrato ogni 2 giorni (come raccomandato dal comitato etico) per i primi 10 giorni dopo l'impianto. L'EAE viene indotta solo 2-3 settimane dopo la cessazione del trattamento antinfiammatorio.
Utilizzando questo approccio abbiamo indotto con successo EAE nell'87% degli animali con finestre impiantate e, utilizzando topi Thy1-CFP-23 (assoni blu nel midollo spinale dorsale), quantificato la perdita assonale durante la progressione dell'EAE. Nel complesso, questo protocollo può essere utile per studiare il reclutamento di varie popolazioni cellulari e le loro dinamiche di interazione, con risoluzione subcellulare e per lunghi periodi di tempo. Questa modalità di imaging intravitale rappresenta uno strumento prezioso per lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento delle malattie demielinizzanti autoimmuni come l'EAE.
Introduzione
La sclerosi multipla è una malattia autoimmune del SNC che causa danni progressivi alla mielina e agli assoni. Il modello di ricerca standard per le malattie demielinizzanti autoimmuni del SNC è l'EAE nei roditori adulti. Tuttavia, gli eventi cellulari dinamici alla base della progressione dell'EAE rimangono in gran parte inesplorati. Un approccio consiste nell'utilizzare la microscopia intravitale a due fotoni per visualizzare popolazioni cellulari con marcatori fluorescenti per lunghi periodi di tempo nel midollo spinale di topi adulti con EAE.
La microscopia intravitale a due fotoni è un modo potente per studiare la fisiologia cellulare,....
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Protocollo
1. Preparazione della finestra e della struttura di supporto
- Preparazione della finestra - preparare diverse finestre di varie dimensioni (larghezza = 1,8-2,2 mm; lunghezza = 4,5-5,2 mm) per l'impianto.
- Realizzando la fresa modificata per tagliare il vetro di copertura - utilizzando una generosa quantità di cemento dentale, attacca una fresa per trapano a un albero (nel nostro caso, i vecchi morsetti Bulldog). Assicurarsi che la fresa sia di ~45° rispetto all'albero per una più facile manipolazione.
Nota: gli scribi diamantati funzionano bene anche per il taglio del vetro di copertura. - Realizzazione del vetrino-A - utilizzand....
- Realizzando la fresa modificata per tagliare il vetro di copertura - utilizzando una generosa quantità di cemento dentale, attacca una fresa per trapano a un albero (nel nostro caso, i vecchi morsetti Bulldog). Assicurarsi che la fresa sia di ~45° rispetto all'albero per una più facile manipolazione.
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Risultati
L'uso di finestre di vetro impiantate cronicamente in combinazione con la microscopia intravitale a due fotoni e modelli di EAE potrebbe rappresentare uno strumento utile per comprendere i meccanismi cellulari alla base della patologia delle malattie autoimmuni demielinizzanti. Utilizzando il nostro metodo di impianto, abbiamo osservato che la maggior parte delle finestre era trasparente al momento dell'induzione dell'EAE e rimaneva tale durante tutta la progressione della malattia (Figura 1c). Con quest.......
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Discussione
Abbiamo descritto un metodo per l'impianto e il mantenimento di finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare la progressione dinamica dell'EAE nel tempo. Un approccio simile all'impianto di finestre di vetro è stato utilizzato per studiare i modelli di lesione del midollo spinale13 e può anche essere utile per studiare altre patologie del midollo spinale come i glioblastomi, la meningite o la fisiologia cellulare del midollo spinale normale. Per il nostro metodo, la stabilizza.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen e S. Meijia-Gervacio per le utili discussioni; M. Hocine e C. Meunier, e il personale delle strutture di imaging degli animali e PicSIL dell'IBDML per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione istituzionale del Centre National de la Recherche Scientifique e da sovvenzioni dell'Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (a G.R. e K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (a FD). K.K.F. è stato sostenuto da una borsa di studio ARSEP. L'imaging è stato eseguito sulla strut....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trapano per rimozione ossea | World Precision Instruments | IDEAL MICRO-DRILL | Venduto anche da Harvard Apparatus. Qualsiasi trapano osseo chirurgico di alta qualità sarà sufficiente. |
| Fresa per trapano (#1/4 o 1/2 fresa rotonda in carburo) | World Precision Instruments | 501860 (#1/4) 501860 (#1/2) | Venduto anche da Harvard |
| Apparatus Staples | Lyreco | 5.002.567 | Corona = 8 mm Gamba = 4 mm |
| Graffetta | Qualsiasi graffetta standard da 25 mm | ||
| Cacciaviti ad ago | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Forbici | per tessutiStrumenti per le scienze | 14028-10 | |
| Pinze Adson | Strumenti per le scienze | 11027-12 | 1 x 2 denti |
| Pinze smussate | Strumenti per le scienze fini | 11293-00 | |
| Forcelle spinali | Apparecchio Harvard | 724813 | |
| Cemento dentale | GACD | 12-565 e 12-568 | |
| Elastomero siliconico | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Disponibile anche tramite Coherent Scientific e Fisher Scientific |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD | Cyanolit 201 | |
| Microscopio | Zeiss | 7MP | Il nostro microscopio è in configurazione verticale ed è dotato di 5 rivelatori NDD. |
| Obiettivo | Zeiss | W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm | Distanza di lavoro = 1.8 mm |
Riferimenti
- Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
- Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic sp....
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Ristampe e permessi
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