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Articolo metodologico

Impianto di finestre in vetro del midollo spinale in topi adulti con encefalomielite autoimmune sperimentale

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DOI:

10.3791/50826

⸱

21 dicembre 2013

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo per impiantare e mantenere finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Queste finestre forniscono un accesso ottico cronico al midollo spinale per il monitoraggio della dinamica cellulare a livello subcellulare in animali vivi utilizzando la microscopia a due fotoni.

Abstract

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) nei roditori adulti è il modello sperimentale standard per lo studio delle malattie demielinizzanti autonomiche come la sclerosi multipla. Qui presentiamo un protocollo di impianto con finestra di vetro a basso costo e riproducibile, adatto per la microscopia intravitale e lo studio delle dinamiche della citoarchitettura del midollo spinale con risoluzione subcellulare in topi adulti vivi con EAE. In breve, esponiamo chirurgicamente le vertebre T12-L2 e costruiamo una camera attorno alle vertebre esposte utilizzando una combinazione di cianoacrilato e cemento dentale. Una laminectomia viene eseguita da T13 a L1 e un sottile strato di elastomero siliconico trasparente viene applicato sulla superficie dorsale del midollo spinale esposto. Un vetrino coprioggetti modificato viene impiantato sul midollo spinale esposto, facendo attenzione che il vetro non entri in contatto diretto con il midollo spinale. Per ridurre l'infiltrazione di cellule infiammatorie tra la finestra e il midollo spinale, il trattamento antinfiammatorio viene somministrato ogni 2 giorni (come raccomandato dal comitato etico) per i primi 10 giorni dopo l'impianto. L'EAE viene indotta solo 2-3 settimane dopo la cessazione del trattamento antinfiammatorio.

Utilizzando questo approccio abbiamo indotto con successo EAE nell'87% degli animali con finestre impiantate e, utilizzando topi Thy1-CFP-23 (assoni blu nel midollo spinale dorsale), quantificato la perdita assonale durante la progressione dell'EAE. Nel complesso, questo protocollo può essere utile per studiare il reclutamento di varie popolazioni cellulari e le loro dinamiche di interazione, con risoluzione subcellulare e per lunghi periodi di tempo. Questa modalità di imaging intravitale rappresenta uno strumento prezioso per lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento delle malattie demielinizzanti autoimmuni come l'EAE.

Introduzione

La sclerosi multipla è una malattia autoimmune del SNC che causa danni progressivi alla mielina e agli assoni. Il modello di ricerca standard per le malattie demielinizzanti autoimmuni del SNC è l'EAE nei roditori adulti. Tuttavia, gli eventi cellulari dinamici alla base della progressione dell'EAE rimangono in gran parte inesplorati. Un approccio consiste nell'utilizzare la microscopia intravitale a due fotoni per visualizzare popolazioni cellulari con marcatori fluorescenti per lunghi periodi di tempo nel midollo spinale di topi adulti con EAE.

La microscopia intravitale a due fotoni è un modo potente per studiare la fisiologia cellulare, le interazioni cellulari e la progressione dinamica della malattia negli animali viventi con risoluzione subcellulare1. Tuttavia, uno dei principali ostacoli all'approccio è che richiede l'accesso ottico alla regione di interesse. Ad esempio, le finestre di vetro cranico sono una metodologia consolidata per l'imaging ripetuto delle stesse microstrutture nel cervello per diverse settimane2,3. L'adattamento di questa metodologia all'imaging del midollo spinale non è, tuttavia, semplice e richiede diverse modifiche tecniche per immobilizzare il tessuto spinale dorsale all'interno delle vertebre articolate.

In precedenza, l'accesso ottico al midollo spinale richiedeva la riesposizione chirurgica del midollo spinale all'inizio di ogni sessione di imaging e la sutura della pelle chiusa alla fine di ogni sessione4-12. Questi interventi chirurgici ripetuti sono traumatici per l'animale, limitano il numero e la durata delle sessioni di imaging e aumentano la probabilità di artefatti correlati all'intervento chirurgico come infiammazione e danni al midollo spinale attraverso perturbazioni meccaniche. Per superare queste carenze, abbiamo recentemente sviluppato un protocollo per impiantare finestre di vetro sul midollo spinale esposto di topi transgenici fluorescenti adulti con lesioni traumatiche del midollo spinale per esperimenti di microscopia a due fotoni in vivo a lungo termine senza interventi chirurgici ripetuti13. Qui presentiamo un adattamento dettagliato del protocollo di impianto nel contesto della sua applicazione per studiare gli eventi cellulari dinamici alla base della progressione dell'EAE nei topi adulti.

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Protocollo

1. Preparazione della finestra e della struttura di supporto

  1. Preparazione della finestra - preparare diverse finestre di varie dimensioni (larghezza = 1,8-2,2 mm; lunghezza = 4,5-5,2 mm) per l'impianto.
    1. Realizzando la fresa modificata per tagliare il vetro di copertura - utilizzando una generosa quantità di cemento dentale, attacca una fresa per trapano a un albero (nel nostro caso, i vecchi morsetti Bulldog). Assicurarsi che la fresa sia di ~45° rispetto all'albero per una più facile manipolazione.
      Nota: gli scribi diamantati funzionano bene anche per il taglio del vetro di copertura.
    2. Realizzazione del vetrino-A - utilizzando un vetrino da microscopio standard, fissare con del nastro adesivo un breve pezzo di carta righello (~2 cm) sul fondo del vetrino in modo da poter vedere il righello attraverso il vetro. Quindi, posiziona un pezzo di nastro adesivo lungo il bordo del segno 0 mm del righello per fungere da fissaggio per il vetro di copertura nel passaggio successivo.
    3. Utilizzando la fresa da trapano modificata, il vetrino-A e un vetrino da microscopio non modificato (vetrino-B), posizionare un pezzo di vetro di copertura (spessore n. 1,5) sul segno di 0 mm sul vetrino-A. Utilizzare il diapositive-B per tenere in posizione il vetro di copertura e come maschera per la linea di taglio prevista. Tagliare il vetro di copertura in un rettangolo lungo di circa 5 x 22 mm. Ruotare il vetro tagliato di 90° e tagliare il rettangolo in un rettangolo più piccolo di ~2 x 5 mm.
  2. Modifiche delle graffette - verranno impiantate due graffette modificate per sostenere e fissare la camera della finestra alle vertebre (vedere paragrafo 2.7-8).
    1. Utilizzando una graffetta piccola standard (corona = 8 mm; gamba = 4 mm), piegare il centro della corona ~90° in modo che le punte delle gambe si tocchino quasi.
    2. Piegare le punte delle gambe verso l'esterno di ~45° a metà corsa, in modo che la metà distale delle gambe sia parallela.
    3. Piegare la metà distale delle gambe di ~30° verso l'alto rispetto al piano della graffetta. Mettere le graffette modificate nell'etanolo prima dell'intervento chirurgico per la sterilizzazione.
      Nota: le graffette possono anche essere sterilizzate con ossido di etilene o sterilizzate in autoclave.
  3. Modifiche delle graffette - preparare una graffetta modificata da impiantare come parte della camera (vedere paragrafi 2.9-10) e che funga da clip di tenuta per la chirurgia e l'imaging.
    1. Utilizzando una graffetta standard da 25 mm, rimuovere la piccola curva lasciando una forma a U allungata.
    2. Utilizzando pinze o cacciatori ad ago, ridurre il diametro della curva a ~2 mm mantenendo le punte parallele.
    3. Piegare le punte verso l'esterno di ~90° a circa 8-10 mm dalla curva. Apportare le modifiche necessarie in modo che sia piatto.

2. Impianto della finestra

Nota: Tutte le procedure chirurgiche e di cura degli animali sono state condotte in conformità con la Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee e sono state approvate dal Comitato Nazionale per gli Studi sugli Animali della Francia (autorizzazione n. 13.300).

  1. Anestetizzare il topo (Ket/Xyl; dose di induzione: 120 mg/kg, 12 mg/kg; dose supplementare, 40 mg/kg, 4 mg/kg), applicare unguento per gli occhi sugli occhi.
  2. Radere la schiena di circa ~2 cm di larghezza per ~5 cm di lunghezza, centrata sulla gobba toracica, e pulire la pelle esposta con sapone di iodio seguito da una soluzione di iodio. Pulire i guanti spruzzando con etanolo al 90%.
  3. Usando le forbici per tessuti, tagliare la pelle dorsale longitudinalmente sopra le vertebre da T11 a L1 (~2 cm). Utilizzando un bisturi, praticare incisioni longitudinali bilaterali tra i processi spinosi e trasversali da T11 a L1. Nota: se i guanti o gli strumenti toccano il pelo o la pelle dell'animale, ripulire i guanti o lo strumento utilizzando uno sterilizzatore a freddo come etanolo al 90% o Germ-X.
  4. Sospendi il mouse nella forcella spinale stereotassica - Inizia bloccando la forcella spinale in alto a destra in posizione. Afferrare il T11 usando la pinza Adson e posizionare il processo trasversale T11 sulla forcella spinale fissa. Tenendo la vertebra in posizione, fissare la forcella spinale controlaterale sotto il processo trasverso controlaterale.
  5. Utilizzando la stessa procedura del passaggio 2.4, posizionare L1 all'interno della forcella spinale.
  6. Con l'aiuto di un bisturi (n. 23), raschiare delicatamente i muscoli tra i processi spinosi e trasversali da T11 a L1 in modo che le lamine siano chiaramente visibili. Per una migliore visione dei peduncoli di T11, tagliare il tendine che sporge rostralmente dalla punta del processo trasversale.
  7. Sciacquare le graffette modificate con PBS e inserire le punte delle graffette lateralmente ai peduncoli vertebrali di T11 e L1 regolando la distanza tra le punte in modo che tocchino leggermente i peduncoli.
    Nota: utilizzare solo PBS contenente desametasone (0,1%), penicillina (1.000 U/ml) e streptomicina (1 mg/ml), per ridurre l'infiammazione post-chirurgica e migliorare la chiarezza della finestra.
  8. Incollare le graffette in posizione con una piccola goccia di cianoacrilato in ogni punto di inserimento e rimuovere il topo dalle forchette spinali.
  9. Applicare un sottile strato di cianoacrilato sui bordi tagliati della pelle e sui muscoli esposti attorno alle vertebre pulite, facendo attenzione a non incollare le vertebre. Piegare le punte della graffetta modificata in modo che entrino sotto le sezioni sporgenti delle graffette impiantate e rimangano parallele all'asse lungo della colonna vertebrale isolata e lasciare in questa posizione.
  10. Partendo dall'interfaccia pelle-muscolo, applicare diversi strati di cemento dentale per coprire l'intera apertura tranne le vertebre esposte, assicurandosi di impiantare saldamente la graffetta all'interno del cemento dentale.
  11. Una volta che il cemento dentale è indurito (5-15 minuti), attacca il mouse al "porta clip" vicino alla parte esposta della graffetta impiantata. Usando una pinza, rimuovere il muscolo e altri tessuti molli tra i processi spinosi e le lamine delle vertebre esposte.
    Nota: qualsiasi dispositivo in grado di afferrare saldamente la parte esposta della graffetta senza causare stress alla clip/camera e che può essere manovrato per riorientare il mouse durante l'intervento chirurgico può essere utilizzato come "supporto per clip".
  12. Utilizzando il trapano per la rimozione dell'osso, assottigliare bilateralmente le lamine di T12 e T13. Per rimuovere l'osso dorsale, afferrare il processo spinoso con una pinza smussata e sollevare facendo attenzione a non applicare alcuna forza verso il basso verso il midollo spinale. Se l'osso non si stacca facilmente, continuare ad assottigliare le lamine fino a quando il processo spinoso non può essere facilmente rimosso.
  13. Utilizzando il trapano per la rimozione dell'osso, continuare a modellare i bordi laterali delle vertebre per formare una struttura di supporto per la finestra. Rimuovere delicatamente tutti i piccoli frammenti ossei che toccano la dura madre utilizzando una pinza smussata. Assicurati di mantenere l'umidità della dura madre usando PBS.
  14. Scegli una delle finestre preparate che sia leggermente più larga dell'apertura della laminectomia e verifica quanto bene poggia sull'osso esposto. Idealmente, la finestra poggerà bilateralmente su entrambe le vertebre in modo che il centro della finestra tocchi la dura madre (Figura 1a). La finestra, tuttavia, non deve comprimere il midollo spinale anche quando si spinge la finestra verso il midollo spinale. Se la finestra è sbilanciata o poggia sopra la dura, ripetere il passaggio 2.13.
  15. Una volta soddisfatti della laminectomia, posizionare un pezzettino di carta velina autoclavata imbevuta di PBS sul midollo spinale per evitare l'essiccazione della dura madre e mettere da parte il topo.
  16. Pulizia della finestra: immergere la finestra in una soluzione di detergente per vetri per alcuni secondi. Usando un pezzo di tessuto per lenti da microscopio, asciuga la finestra. Con il microscopio operatorio verificare che la finestra sia pulita e, in caso contrario, ripetere il processo di pulizia. Posizionare la finestra in un'area pulita con facile accesso per un rapido recupero e posizionamento della finestra nel passaggio 2.19.
  17. Recupera il mouse e rimuovi la carta velina. Rimuovere delicatamente eventuali detriti dalla dura madre utilizzando una pinza smussata e lasciare asciugare la dura madre fino a renderla leggermente appiccicosa.
  18. Riempire rapidamente il tubo del miscelatore in silicone (Kwik-sil) ed estrudere il silicone su un vetrino pulito fino a quando non fuoriescono bolle dalla punta. Somministrare immediatamente una piccola perlina di silicone lungo la linea mediana del midollo spinale esposto.
  19. Recupera le finestre pulite usando una pinza smussata e posizionale immediatamente sopra il silicone. Usando la pinza smussata, applicare una piccola quantità di pressione sulla finestra per stendere il silicone sui bordi della finestra e tenerlo in posizione per ~1 min.
    Nota: prima della miscelazione, il silicone deve essere conservato a una temperatura inferiore a 27 °C, altrimenti il tempo di polimerizzazione può aumentare in modo significativo e non aderirà alla finestra o alla dura madre, con conseguente riduzione della chiarezza ottica.
  20. Rilasciare lentamente la pressione dalla finestra. Se la finestra non si muove, procedere immediatamente al passaggio 2.21. Se, tuttavia, la finestra si solleva quando la pressione viene rilasciata (cioè le vertebre si muovono), procedere al passaggio 2.21 mantenendo la pressione sulla finestra per tenerla in posizione.
  21. Applicare cianoacrilato rostrale e caudale della finestra. Se il cianoacrilato non copre i bordi rostrale e caudale della finestra, usa uno stuzzicadenti per guidare un po' di cianoacrilato liquido su questi bordi. Quindi, guida la colla lungo i bordi laterali della finestra (Figura 1a) per coprire tutti i muscoli circostanti. Nota: il cianoacrilato dovrebbe coprire la superficie dei bordi esterni della finestra. Troppo cianoacrilato può compromettere la chiarezza ottica, non abbastanza cianoacrilato provocherà bolle d'aria tra il silicone e la finestra.
  22. Per proteggere il cianoacrilato e aumentare l'integrità strutturale della camera, applicare il cemento dentale su tutte le regioni ricoperte di cianoacrilato (Figura 1a). Come con il cianoacrilato, inizia dai bordi rostrale e caudale e usa un piccolo bastoncino di legno per guidare il cemento dentale lungo i bordi della finestra.

3. Cure postoperatorie, induzione EAE e manutenzione delle finestre

  1. Iniettare desametasone (0,2 mg/kg) e Rimadyl (5 mg/kg) s.q. attraverso le regioni pelviche. Trasferire il mouse in una gabbia calda (~26 °C) con materiale di nidificazione. I topi dovrebbero essere completamente mobili, esplorare la loro gabbia e pulirsi dopo che gli effetti dell'anestetico si sono completamente attenuati (di solito 2-3 ore). Allestite gli animali individualmente e assicuratevi che abbiano facile accesso al cibo e all'acqua per i primi 1-2 giorni. Una volta che il topo inizia a riprendersi dall'anestesia, iniettare buprenorfina (0,05 mg/kg) s.q. Dopo il completo recupero dall'anestesia, il topo non dovrebbe mostrare segni di dolore. Nota: una volta completamente recuperato dall'anestesia, qualsiasi segno di dolore o attività motoria anormale indica che la finestra non è stata impiantata correttamente.
  2. Iniettare desametasone (0,2 mg/kg) e rimadil (5 mg/kg) ogni 2 giorni per i primi 10 giorni dopo l'intervento chirurgico (Figura 1a). Per iniettare nei topi le finestre, sedare leggermente l'animale con isoflurano in una camera di induzione (~1,75% di isoflurano in aria per 1-2 minuti). Rimuovere il topo dalla camera e iniettare immediatamente i farmaci. Il mouse dovrebbe essere completamente sveglio in <1 min.
    Nota: non fare la collottola ai topi con finestre impiantate poiché ciò può causare la separazione della pelle dall'impianto. È possibile iniettare topi i.p. senza sedazione consentendo loro di afferrare il coperchio di una gabbia con le zampe anteriori e sollevando delicatamente gli arti posteriori. Tuttavia, in questa posizione il mouse a volte si allontana causando stress alla finestra impiantata. Questo può portare a sanguinamento tra la finestra e il midollo spinale, compromettendo così la chiarezza ottica.
  3. L'EAE può essere indotta a 2-3 settimane dopo la cessazione del trattamento antinfiammatorio (~3-4 settimane dopo l'intervento chirurgico). Sedare leggermente il mouse come descritto nel passaggio 3.2. Rimuovere il topo dalla camera di induzione e mantenere la sedazione con una maschera di isoflurano posta sul naso.
  4. Iniettare il peptide MOG35-55 (75 μg nell'adiuvante di Freund contenente 800 μg di mycobacterium tuberculosis) in 3 diverse posizioni s.q. (bilateralmente sopra il femore e alla base della coda) e la tossina della pertosse (400 ng) i.p.14,15
    Nota: i mouse con EAE richiedono cure supplementari rispetto ai mouse con solo Windows. Pesa i topi EAE ogni giorno e assicurati che abbiano sempre un facile accesso a cibo e acqua. Integratore con una gelatina di agarosio al 3% contenente per mantenere l'idratazione e il peso dell'animale. Il glucosio (1-3%) può anche essere aggiunto alla gelatina per aggiungere calorie.
  5. Due giorni dopo l'induzione dell'EAE, ripetere il protocollo di sedazione descritto al punto 3.2 e iniettare una seconda dose di tossina della pertosse (400 ng) i.p.
  6. Per visualizzare il midollo spinale, sedare prima l'animale come descritto al punto 3.2 e anestetizzarlo leggermente con ketamina/xilazina (100 mg/kg; 10 mg/kg) i.p. Ciò fornirà ~ 1 ora di imaging.
  7. Per le sessioni di imaging della durata di <2 ore, l'anestesia leggera può essere mantenuta con iniezioni supplementari di ketamina/xilazina (50 mg/kg; 5 mg/kg) ogni 45-60 minuti. In alternativa, per sessioni di imaging più lunghe, i topi possono essere sedati continuamente con isoflurano (isoflurano 0,75-1,25% in aria umidificata).
    Nota: le finestre possono essere pulite con un microscopio operatorio rimuovendo delicatamente i detriti con l'angolo di un fazzoletto o un batuffolo di cotone. Non usare alcol per pulire la finestra perché può degradare alcuni tipi di cemento dentale e può raffreddare il midollo spinale.
  8. Una volta leggermente anestetizzato, il topo viene fissato saldamente a un supporto per clip dalla parte esposta della graffetta impiantata (Figura 1b).
  9. Il midollo spinale è allineato perpendicolarmente alla lente dell'obiettivo regolando il posizionamento della clip all'interno del supporto, regolando la posizione del supporto e regolando la posizione del tavolino. La superficie dorsale del midollo spinale viene rapidamente ripresa e la vascolarizzazione dorsale viene utilizzata per determinare l'orientamento del midollo spinale.

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Risultati

L'uso di finestre di vetro impiantate cronicamente in combinazione con la microscopia intravitale a due fotoni e modelli di EAE potrebbe rappresentare uno strumento utile per comprendere i meccanismi cellulari alla base della patologia delle malattie autoimmuni demielinizzanti. Utilizzando il nostro metodo di impianto, abbiamo osservato che la maggior parte delle finestre era trasparente al momento dell'induzione dell'EAE e rimaneva tale durante tutta la progressione della malattia (Figura 1c). Con quest...

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Discussione

Abbiamo descritto un metodo per l'impianto e il mantenimento di finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare la progressione dinamica dell'EAE nel tempo. Un approccio simile all'impianto di finestre di vetro è stato utilizzato per studiare i modelli di lesione del midollo spinale13 e può anche essere utile per studiare altre patologie del midollo spinale come i glioblastomi, la meningite o la fisiologia cellulare del midollo spinale normale. Per il nostro metodo, la stabilizza...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen e S. Meijia-Gervacio per le utili discussioni; M. Hocine e C. Meunier, e il personale delle strutture di imaging degli animali e PicSIL dell'IBDML per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione istituzionale del Centre National de la Recherche Scientifique e da sovvenzioni dell'Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (a G.R. e K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (a FD). K.K.F. è stato sostenuto da una borsa di studio ARSEP. L'imaging è stato eseguito sulla struttura di imaging PIcSIL dell'IBDML.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Trapano per rimozione osseaWorld Precision InstrumentsIDEAL MICRO-DRILLVenduto anche da Harvard Apparatus.
Qualsiasi trapano osseo chirurgico di alta qualità sarà sufficiente.
Fresa per trapano (#1/4 o 1/2 fresa rotonda in carburo)World Precision Instruments501860 (#1/4)
501860 (#1/2)		Venduto anche da Harvard
Apparatus StaplesLyreco5.002.567Corona = 8 mm
Gamba = 4 mm
GraffettaQualsiasi graffetta standard da 25 mm
Cacciaviti ad agoFine Science Tools12003-15
Forbiciper tessutiStrumenti per le scienze14028-10
Pinze AdsonStrumenti per le scienze11027-121 x 2 denti
Pinze smussateStrumenti per le scienze fini11293-00
Forcelle spinaliApparecchio Harvard724813
Cemento dentaleGACD12-565 e 12-568
Elastomero siliconicoWorld Precision InstrumentsKWIK-SILDisponibile anche tramite Coherent Scientific e Fisher Scientific
CyanoacrylateEleco-EFDCyanolit 201
MicroscopioZeiss7MPIl nostro microscopio è in configurazione verticale ed è dotato di 5 rivelatori NDD.
ObiettivoZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mmDistanza di lavoro = 1.8 mm

Riferimenti

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