Abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per test di suscettibilità agli antibiotici rapidi. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti possono sopravvivere a queste condizioni stressanti.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Test di suscettibilità agli antibiotici indotti dallo stress su un chip
In questo articolo
Sommario
Abstract
Abbiamo sviluppato un metodo microfluidico rapido per i test di suscettibilità agli antibiotici in un ambiente basato sullo stress. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti sopravvivono a queste condizioni stressanti. L'ipotesi alla base di questo metodo è nuova: l'attivazione dello stress delle vie biochimiche, che sono obiettivi di antibiotici, può accelerare i test di suscettibilità agli antibiotici. Rispetto ai metodi standard di test di suscettibilità agli antibiotici, il passaggio di limitazione del tasso - crescita batterica - viene omesso durante l'applicazione di antibiotici. L'implementazione tecnica del metodo è in una combinazione di tecniche standard e approcci innovativi. Le parti standard del metodo includono protocolli di coltura batterica, definendo canali microfluidici in polidimetilsassano (PDMS), monitoraggio della vitalità cellulare con fluorescenza e elaborazione delle immagini batch per il conteggio dei batteri. Parti innovative del metodo sono nell'uso del flusso dei mezzi di coltura per l'applicazione di sollecitazioni meccaniche, nell'uso di enzimi per danneggiare ma non uccidere i batteri e nell'uso di substrati microarray per l'attacco batterico. La piattaforma sviluppata può essere utilizzata nello sviluppo e nei test di farmaci correlati agli antibiotici e non antibiotici. Rispetto agli esperimenti standard di sospensione batterica, l'effetto del farmaco può essere acceso e disattivato ripetutamente durante i periodi di tempo controllati. L'osservazione ripetitiva della stessa popolazione batterica è possibile nel corso dello stesso esperimento.
Introduzione
L'aumento della resistenza batterica intensifica la necessità di test di suscettibilità agli antibiotici a base di fenotipo veloce al fine di salvaguardare i nostri farmaci di ultima istanza. I test di suscettibilità standard si basano sull'inibizione della crescita batterica in presenza di antibiotici che prendono più (8-24) ore per essere completati. Abbiamo sviluppato un nuovo test di suscettibilità agli antibiotici su una piattaforma microfluidica che si basa sull'attivazione dello stress delle vie biosintetiche per accelerare l'azione degli antibiotici.
I test di suscettibilità agli antibiotici su scala microfluidico comportano il vant....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Creare il livello PDMS (Figura 1)
- Mescolare vigorosamente PDMS e agente polimerizzante in un rapporto 10:1. Per rimuovere le bolle, degasare la miscela viscosa in una camera a vuoto per 1 ora a temperatura ambiente.
- Su una scala, versare lentamente il PDMS sullo stampo in alluminio. Versare dal centro e mantenere livellato lo stampo. Assicurati di lasciare i perni scoperti. Smettere di versare una volta raggiunto il peso target.
Il nostro stampo richiede 4 g di PDMS e 0,4 g di reagente di polimerizzazione. - Livellare lo stampo all'interno di un forno e polimerigliare a 37 °C durante la notte.
I tempi di polimerizzazi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I dati presentati nella figura 4 mostrano la risposta di un ceppo di Staphylococcus aureus sensibile nel tempo in un canale microfluidico contenente antibiotici. Le immagini di contrasto di fase acquisite a 1 minuto e alla fine dell'esperimento di 1 ora sono mostrate nelle figure 4A e B. I dati analizzati di 1 ora sono mostrati nella figura 4C con i batteri evidenziati in rosso (5.828 totali). Le corrispondenti immagini a fluorescenza .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo presentato è stato convalidato e ottimizzato in una serie di esperimenti con ceppi stafilococco aureo sensibili alla meticillina e resistenti alla meticillina10. Pertanto, questo protocollo senza modifiche dovrebbe essere direttamente applicabile ad altri ceppi di S. aureus e altri antibiotici con meccanismi d'azione che influenzano la biosintesi della parete cellulare batterica. Tipi di batteri diversi da S. aureus possono richiedere variazioni nei parametri di solleci.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Il metodo microfluidico è in attesa di brevetto: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, inventori; Metodo e dispositivo per il rilevamento rapido del brevetto di resistenza/suscettibilità agli antibiotici batterici PCT/US10/33523.
Ringraziamenti
Ringraziamo gli ingegneri e gli studenti del Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Per aver contribuito alla progettazione, lavorazione e automazione del sistema sperimentale, ringraziamo Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin e il Dr. Sudong Shu. Ringraziamo Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu e Katarzyna Kuliga per l'aiuto nel test dei protocolli sperimentali e nella raccolta dei dati. Prendiamo atto della dott.ssa Anne E. Carpenter e di Mark-Anthony Bray della piattaforma di imaging presso il Broad Institute di Harvard e il MIT per l'aiuto nello sviluppo della routine di analisi delle immagini in Cell....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Colorazione a fluorescenza a cellule morte |
| Siero bovino Albumina (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Utilizzato per la conservazione della lisostafina |
| Acetato di sodio | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G Utilizzato | per la conservazione della lisostafina |
| Lisostafina | Cell Sciences | CRL309A | Arriva come 1 mg solido. Per la conservazione: Sciogliere in 20 mM di acetato di sodio. Miscelare con la soluzione BSA fino alla concentrazione finale di 1% BSA e 100 µ g/ml lisostafina per la conservazione |
| Sale di oxacillina | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotico |
| Mueller Hinton Brodo | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% aggiunto al brodo Mueller-Hilton prima della sterilizzazione in autoclave |
| 1 ml, siringa Luer-lock | BD (Beckton, Dickinson e Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, siringa Luer-lock | BD (Beckton, Dickinson e Comp.) | 309653 - Da 60 mL | di overfill a ~65 ml |
| Microscopio | |||
| Microscopio a fluorescenza invertita Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Obiettivo a fluorescenza/contrasto di fase | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga Telecamera CCD monocromatica a 12 bit | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Automazione | |||
| Otturatori Contrasto di fase/fluorescenza | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | H107AENN | ||
| PRIOR Scientific | Joystick H122 | ||
| per il controllo XYZ | CS152EF | PRIOR Scientific | |
| H3-XY2 | |||
| Software di acquisizione | Fraunhofer CMI | ||
| Cell Assembly e PDMS | |||
| Cella di flusso | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | I disegni tecnici sono stati prodotti da Fraunhofer CMI |
| Finestra di vetro | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | La finestra di vetro è stata tagliata alla dimensione corretta presso Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Finestra 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Piastra di tenuta | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Vetrino in vetro epossidico | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master lavorato in alluminio o ottone con UPM-0005 (macchina per il taglio al volo ultrapresicion) |
| Design della guida PDMS | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Dado per tubi | |||
| , Super flangeless Tinytight, senza testa, 1/16 in, PEEK, verde | IDEX Health Science | M-644-03 | sono maschiati per questa ghiera |
| Ghiera, Tinytight, 1/16 pollici, 6-40, .030 pollici TH, PEEK con anello di bloccaggio SS, nero | Dado IDEX Health Science | M-657 | |
| , Super flangeless Tinytight, senza testa, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, naturale | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ghiera, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), giallo | IDEX Health Science | P-259 | Adatto a tubi adattatori Luer-lock |
| , Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 piedi, verde | Adattatore IDEX Health Science | 1520G | |
| , connessione rapida femmina Luer a femmina 1/4-28, PEEK, rosso | IDEX Scienze della salute | P-658 |
Riferimenti
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Suscettibilità agli antibiotici microfluidicaImmobilizzazione battericaStress da alta velocità di flussoMonitoraggio della vitalità tramite fluorescenzaImaging a contrasto di faseAssemblaggio di celle a flusso in PDMSSubstrati per l'adesione battericaCalcolo della morte cellulare normalizzataTest rapido della suscettibilità agli antibioticiVie biochimiche attivate dallo stress
