Produzione e purificazione di vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 non replicativo

Sommario

Negli ultimi 15 anni, i vettori derivati dall'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) hanno dimostrato la loro efficienza nel trasdurre cellule in vitro e in vivo e sono ampiamente utilizzati per la vaccinazione e la terapia genica. Qui descriviamo una procedura per costruire, produrre e purificare vettori CAV2, dando origine a sospensioni virali ad alto titolo.

Abstract

I vettori derivati dall'adenovirus (Ad) sono stati ampiamente utilizzati per il trasferimento genico a breve o lungo termine, sia per la terapia genica che per le applicazioni vaccinali. A causa della frequente immunità preesistente contro l'adenovirus umano di tipo 5 di uso classico, l'adenovirus canino di tipo 2 (CAV2) è stato proposto come vettore alternativo per il trasferimento genico umano. La biologia ben caratterizzata di CAV2, insieme alla sua facilità di manipolazione genetica, offre importanti vantaggi, in particolare per il trasferimento genico nel sistema nervoso centrale, o per indurre un'ampia gamma di risposte immunitarie protettive, dall'immunità umorale a quella cellulare. Al giorno d'oggi, il CAV2 rappresenta uno degli adenovirus non umani più interessanti per l'uso come vettore di vaccini. Questo protocollo descrive un metodo semplice per costruire, produrre e titolare vettori CAV2 ricombinanti. Dopo aver clonato la cassetta di espressione del gene di interesse in un plasmide navetta, il plasmide genomico ricombinante viene ottenuto per ricombinazione omologa nel ceppo batterico di E. coli BJ5183. Il plasmide genomico risultante viene quindi trasfettato in cellule renali canine che esprimono i geni complementari CAV2-E1 (DK-E1). Un'amplificazione virale consente la produzione di un ampio stock virale, che viene purificato mediante ultracentrifugazione attraverso gradienti di cloruro di cesio e desalinizzato mediante dialisi. La sospensione virale risultante ha abitualmente un titolo di oltre^10-10 particelle infettive per ml e può essere somministrata direttamente in vivo.

Introduzione

Negli ultimi decenni, i vettori derivati dagli adenovirus (Ads) hanno dimostrato la loro efficacia per la terapia genica e la vaccinazione, nonché nella viroterapia oncolitica ¹. Gli annunci sono virus icosaedrici senza involucro della famiglia degli Adenoviridae, che sono stati isolati da mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e pesci. Dalla loro scoperta nel 1953, gli AD sono stati intensamente studiati come modelli per studiare le interazioni virus/cellula e, più recentemente, come sistemi di consegna genica basati su vettori ². In effetti, i vettori basati su ADS offrono molti vantaggi, come la loro ampia gamma di ospiti e una biologia ben caratterizzata, insieme alla facilità con cui possono essere manipolati geneticamente e amplificati per la produzione su larga scala.

Al fine di superare le difficoltà cliniche legate all'immunità preesistente nelle popolazioni umane verso i vettori derivati dagli annunci umani ³, noi e altri abbiamo iniziato a derivare vettori dagli annunci non umani ⁴. Inoltre, i vettori adenovirali non umani sembrano essere più adatti alla vaccinazione di massa in medicina veterinaria rispetto all'adenovirus di tipo 5 (Ad5) di uso classico, poiché dovrebbero essere più conformi ai requisiti di sicurezza durante la valutazione del rischio da parte delle autorità nazionali di regolamentazione. Alla fine degli anni '90, abbiamo descritto il primo CAV2 ricombinante come alternativa non umana ai vettori derivati da Ad5 ⁵. Da allora, numerosi studi hanno confermato il potenziale dei vettori CAV2 per il trasferimento genico terapeutico o antigenico (per le recensioni ^6,7). Come altri AD, i vettori derivati da CAV2 sono stabili e possono essere prodotti ad alti titoli, il che ne facilita l'uso in vivo. Sono anche sicuri, poiché non sono integrativi, sebbene consentano un'espressione transgenica di lunga durata in vivo (>1 anno) ⁸. Sorprendentemente, e meglio dei sierotipi umani di AD, i vettori CAV2 hanno dimostrato di essere altamente neurotropici, con un trasporto retrogrado molto efficiente negli assoni ^9,10. Questa proprietà intrinseca ha portato all'idea di utilizzare vettori CAV2 ricombinanti per trasdurre neuroni di specifiche aree cerebrali difficilmente accessibili ai vettori lentivirali, finora comunemente utilizzati per il trasferimento genico nel sistema nervoso centrale ¹¹.

Qui, descriviamo un protocollo semplice e classico per costruire, produrre e purificare vettori CAV2 non replicativi derivati dal ceppo Manhattan. I genomi ricombinanti di CAV2 sono costruiti clonando il gene di interesse desiderato (GOI) in una cassetta a valle del promotore precoce del citomegalovirus (CMV), che fornisce un'espressione ubiquitaria. I vettori CAV2 hanno una capacità di clonazione di ~4,2 kbp, che consente di esprimere cDNA di grandi dimensioni. In una seconda fase, questa cassetta di espressione viene inserita per ricombinazione omologa al posto della regione E1 del genoma CAV2, portando a un virus non replicativo (dlE1), come descritto inizialmente da Chartier et al. ¹² Infine, le particelle virali vengono prodotte dopo la trasfezione del plasmide genomico in una linea cellulare di rene canino che esprime CAV2-E1 (DK-E1) e vengono amplificate in serie prima della concentrazione e della purificazione delle scorte virali. Il metodo qui descritto utilizza un'ultracentrifugazione in due fasi in gradienti di cloruro di cesio (CsCl), che consente l'arricchimento di particelle infettive con un alto titolo finale (di solito oltre^10-10 particelle infettive per ml). La sospensione virale viene quindi desalinizzata mediante cromatografia attraverso colonne monouso Sephadex G-25 in modo che sia in definitiva sufficientemente pura da poter essere utilizzata direttamente in vivo.

Protocollo

1. Costruzione di un plasmide genomico CAV2 non replicativo

Nota: tutti i plasmidi descritti in questo protocollo sono stati descritti in precedenza⁷ e sono disponibili su richiesta.

1. Clonare il GOI nel plasmide pShuttle, utilizzando enzimi di restrizione appropriati, per generare pShuttle-GOI (Figura 1A).
2. Digerire 2 μg di pShuttle-GOI mediante AscI/PacI. La digestione rilascia il frammento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + sequenza ORF GOI) dalla spina dorsale plasmidica (2,8 kbp).
3. Purificare il frammento Shuttle-GOI dopo l'elettroforesi su gel di agarosio, utilizzando il gel NucleoSpin e il kit di pulizia PCR.
4. Parallelamente, digerire 1 μg di plasmide genomico pCAV2 mediante SwaI. Il plasmide pCAV2 contiene un sito SwaI unico situato all'interno della regione E1 (Figura 1B). Inattivare termicamente questo enzima di restrizione a 65 °C per 20 minuti.
5. Trasformare i batteri competenti E. coli BJ5183 con 500 ng di frammento Shuttle-GOI purificato e 100 ng di plasmide pCAV2 linearizzato per la ricombinazione omologa (Figure 1B). Stendere su piastre LB-Amp. Incubare le piastre a 37 °C per almeno 20 ore.
6. Eseguire l'analisi PCR direttamente sulle colonie batteriche utilizzando la master mix EmeraldAmp con primer in avanti (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e inverso (5'-GCGGTAGTTTATCAGTTAAATTGC-3'), nelle seguenti condizioni cicliche: 10 min a 95 °C (per un ciclo), 95 °C per 1 min; 58 °C per 1 min; 72 °C per 1 min/kbp (per 39 cicli), e infine 5 min a 72 °C. Un prodotto di 1 kbp + sequenza ORF GOI viene amplificato da cloni positivi per pCAV-GOI, mentre nessun prodotto di PCR può essere rilevato con cloni negativi.
7. Inoculare almeno due colonie positive per una notte ciascuna in 5 ml di LB-amp di terreno a 37 °C in uno shaker (220 giri/min).
8. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando il kit plasmidico Nucleospin. Trasformare i batteri E. coli DH5α competenti con un'aliquota di ciascun preparato di DNA. Stendere la sospensione batterica su piastre LB-Amp e incubare per una notte a 37 °C.
9. Inoculare due colonie di ciascun clone positivo per una notte in 3 ml di terreno LB-amp a 37 °C in un agitatore (220 giri/min). Estrai il DNA plasmidico utilizzando il kit plasmidico Nucleospin.
10. Digerire il DNA risultante e il plasmide pCAV2 parentale (come controllo) con NdeI. Il modello di restrizione del pCAV2 parentale è 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp e 1,6 kbp. La cassetta di espressione GOI è inserita all'interno del frammento di 7,9 kbp e contiene almeno un sito NdeI, cioè uno nella cassetta e i siti potenziali presenti nel GOI.
11. Seleziona le costruzioni positive e procedi al passaggio 2 con almeno 2 cloni indipendenti.

2. Trasfezione del plasmide del genoma CAV2 ricombinante in cellule DK-E1

Nota: i vettori non replicativi derivati da CAV2 sono organismi geneticamente modificati classificati come Livello di Biosicurezza 2 (BSL-2), mentre il loro uso su modelli animali è classificato come BSL-1. Si prega di utilizzare adeguate misure di contenimento e gestione dei rifiuti, compresi i dispositivi di protezione individuale, e di lavorare sotto cappe a flusso laminare BSL-2.

1. Un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule DK-E1 su una piastra a 6 pozzetti. Far crescere le cellule a 37 °C e 5% di CO₂, nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio, contenente il 7% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS), 1 mM di piruvato di sodio e 100 U/ml di penicillina/100 μg/ml di streptomicina. Le cellule dovrebbero essere confluenti al 70-80% per la trasfezione.
2. Digerire 2 μg di plasmide pCAV-GOI con AscI, per rilasciare la sequenza non virale del plasmide. Controllare il modello di restrizione risultante mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. La digestione dovrebbe produrre un frammento di ~31 kbp contenente il genoma ricombinante e un frammento di 2 kbp corrispondente alla spina dorsale del plasmide.
3. Mescolare il DNA digerito con 200 μl di Jet Prime Buffer agitando per 10 secondi. Aggiungere 4 μl di Jet Prime e mescolare agitando per 10 secondi. Centrifugare brevemente per rimuovere le goccioline e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la miscela e incubare a 37 °C.

3. Propagazione del CAV2 ricombinante

1. Una settimana dopo la trasfezione, raccogliere le cellule e il terreno di coltura in una provetta di polipropilene da 15 ml. Disgregare le cellule mediante tre cicli di congelamento-scongelamento (-80 °C/37 °C) ed eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 x g.
2. Raccogliere il surnatante e conservare a -20 °C per la successiva propagazione del virus.
3. Infettare un monostrato confluente all'80-90% di cellule DK-E1 coltivate in un pozzetto di piastra a 6 pozzetti con 0,5 ml di surnatante contenente virus. Incubare a 37 °C per 1 ora, agitando leggermente. Rimuovere l'inoculo e sostituirlo con 1,5 ml di DMEM completo contenente il 5% di FCS inattivato a caldo.
4. Incubare le cellule a 37 °C per 3-4 giorni. Le cellule devono essere monitorate quotidianamente per la comparsa di un effetto citopatico (CPE, Figure 2A-B). Se non è visibile alcun CPE chiaro, prelevare le cellule dopo 4 giorni di coltura e ripetere i passaggi 3.1-3.4.
5. Quando un CPE chiaro colpisce la maggior parte delle cellule, di solito dopo 2-4 cicli di amplificazione virale, raccogliere le cellule con il terreno di coltura e congelare-scongelare 3 volte come descritto sopra. Infettare l'80-90% di cellule DK-E1 confluenti coltivate in tre piastre di coltura tissutale di 10 cm di diametro, utilizzando ogni volta 0,5 ml di surnatante contenente virus.
6. Dopo 3-4 giorni (quando il CPE è completo), prelevare le cellule da queste piastre da 10 cm, disgregarle nuovamente con tre cicli di congelamento-scongelamento, eliminare il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 1.800 x g, raccogliere il surnatante e conservarlo a -20 °C per l'amplificazione CAV2 su larga scala.

4. Purificazione CAV2 su larga scala

1. Infettare l'80-90% di monostrati confluenti di cellule DK-E1 coltivate in piastre di coltura tissutale di quaranta 10 cm di diametro. Per ogni piatto, utilizzare 0,1 ml di surnatante contenente virus diluito in 1 ml di DMEM completo senza FCS. Incubare le cellule a 37 °C per 3-4 ore in leggera agitazione. Aggiungere 5 ml di DMEM completo integrato con il 5% di FCS.
2. Incubare per 3 giorni. Raccogliere le cellule infette dalle piastre da quaranta cm in provette di polipropilene da 50 ml. Pellettare le celle a 1.200 x g per 10 minuti a 4 °C e risospenderle in 15 ml di terreno DMEM.
3. Disgregare le cellule mediante tre cicli di congelamento-disgelo (-80 °C/37 °C). Rimuovere i detriti cellulari centrifugando a 1.800 x g per 10 minuti e conservare il surnatante a -20 °C prima della purificazione delle particelle virali.
4. Preparare un gradiente discontinuo di CsCl in una provetta Ultra-Clear da 14 ml. Per prima cosa, versare 2 ml di soluzione di CsCl (1,40 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato) sul fondo della provetta. Quindi, aggiungere lentamente 2 ml di soluzione di CsCl (1,25 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato) sopra la prima soluzione.
5. Caricare con cura il surnatante virale sopra il gradiente di CsCl. Riempire il tubo con olio minerale fino a 2-3 mm dall'alto. Centrifugare per 1,5 ore a 130.000 x g e 18 °C in un rotore SW40 oscillante.
6. Dopo la centrifugazione, due bande bianche sono chiaramente visibili all'interfaccia tra i 2 strati di soluzione di CsCl (Figura 2C). Utilizzando un ago da 21 G e una siringa, raccogliere con una puntura laterale la fascia inferiore contenente particelle mature di CAV2. Cerca il più possibile di evitare di raccogliere la banda superiore, che corrisponde a particelle virali vuote.
7. Preparare un gradiente continuo di CsCl in una provetta trasparente da 14 ml mescolando le particelle virali raccolte con una soluzione di CsCl (1,34 g/ml in soluzione salina tamponata con fosfato). Riempire il tubo con olio minerale fino a 2-3 mm dall'alto. Centrifugare per 18 ore a 130.000 x g e 18 °C in un rotore SW40 oscillante.
8. Dopo la centrifugazione, raccogliere la fascia bianca contenente CAV2 pungendola lateralmente con una siringa come descritto sopra. Ancora una volta, cerca di evitare di raccogliere la banda superiore rimanente. Questo dovrebbe essere più facile in questo gradiente continuo, che separa meglio le due bande. Il volume totale della sospensione raccolta non deve superare i 2 ml.
9. Equilibrare una colonna Sephadex G-25 PD-10 con 30 ml di PBS.
10. Caricare la sospensione virale ed eliminare il flusso.
11. Eluire con frazioni di 500 μl di PBS. Raccogliere le frazioni 5-7, che di solito contengono le particelle CAV2 dissalate. Le frazioni contenenti virus possono essere facilmente identificate perché sono opalescenti. Aggiungere 150 μl di glicerolo a 1,5 ml di sospensione di CAV2 e conservare in aliquote a -80 °C.

5. Titolazione di CAV2 mediante diluizione end-point

1. Scongelare un'aliquota di virus purificato su ghiaccio ed eseguire diluizioni seriali di 10 volte (da 10-2-10-12) in DMEM privo di siero.
2. Aggiungere 50 μl di ciascuna diluizione virale in 5 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 1,5 x 10⁴ celle DK-E1 in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ per 5 giorni.
3. Al 5° giorno dopo l'infezione, monitorare l'aspetto della CPE mediante osservazione microscopica (Figure 2A-B). I titoli infettivi sono determinati come dosi infettive mediane di coltura tissutale (TCID₅₀), utilizzando il metodo statistico di Reed e Muench¹³.

Risultati

La produzione di vettori CAV2 ricombinanti si basa su tecniche fondamentali ma importanti di biologia molecolare. Prima della produzione dei vettori virali, è infatti necessario costruire un genoma CAV2 ricombinante contenente una cassetta di espressione per il transgene. Questa costruzione prevede due passaggi: innanzitutto, il gene di interesse (GOI) viene clonato in un plasmide shuttle sotto forma di cassetta di espressione (ovvero con promotore e segnale di poliadenilazione). Questo elemento funzionale ...

Discussione

Il semplice metodo qui descritto, adattato dalla ben documentata tecnologia Ad5, consente la produzione efficiente di vettori CAV2 non replicativi con una capacità di clonazione tipica di ~4,2 kbp. Per quanto riguarda le considerazioni temporali, un genoma CAV2 ricombinante viene solitamente generato in due settimane, mentre ci vorranno altre 5 settimane per amplificare, purificare e titolare le sospensioni virali.

Sebbene la produzione del primo lotto di vettori derivati da CAV2 possa sembrar...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Enzimi di restrizione	New England Biolabs	Vari
kit di trasfezione Jet Prime	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli batteri BJ5183	Agilent	200154
PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp polimerasi	Takara	RR320A
Kit di plasmidi nucleospin	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
Provette da 14 ml, Ultra Clear	Beckman	344060