Articolo metodologico

Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

DOI:

10.3791/50840

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18 dicembre 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

In questo articolo

Sommario

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Per studiare la relazione tra omeostasi proteica, stress e invecchiamento, abbiamo monitorato i cambiamenti nel ripiegamento delle proteine seguendo la disfunzione proteica, la localizzazione delle proteine nella cellula e la stabilità delle proteine a livello di organismo, cellulare e proteico, utilizzando il metazoo geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans come sistema modello.

Abstract

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Il ripiegamento e l'assemblaggio delle proteine è essenziale per la funzione delle proteine, la salute a lungo termine della cellula e la longevità dell'organismo. Storicamente, la funzione e la regolazione del ripiegamento delle proteine sono state studiate in vitro, in cellule di coltura tissutale isolate e in organismi unicellulari. Studi recenti hanno scoperto collegamenti tra l'omeostasi delle proteine (proteostasi), il metabolismo, lo sviluppo, l'invecchiamento e il rilevamento della temperatura. Questi risultati hanno portato allo sviluppo di nuovi strumenti per il monitoraggio del ripiegamento delle proteine nell'organismo metazoo modello Caenorhabditis elegans. Nel nostro laboratorio, combiniamo saggi comportamentali, imaging e approcci biochimici utilizzando proteine sensibili alla temperatura o metastabili presenti in natura come sensori dell'ambiente di ripiegamento per monitorare il misfolding delle proteine. I saggi comportamentali associati al ripiegamento errato di una proteina specifica forniscono una lettura semplice e potente per il ripiegamento delle proteine, consentendo lo screening rapido di geni e condizioni che modulano il ripiegamento. Allo stesso modo, tale misfolding può essere associato a un'errata localizzazione delle proteine nella cellula. Il monitoraggio della localizzazione proteica può, quindi, evidenziare cambiamenti nella capacità di ripiegamento cellulare che si verificano in diversi tessuti, a vari stadi di sviluppo e di fronte a condizioni mutevoli. Infine, utilizzando strumenti biochimici ex vivo, possiamo monitorare direttamente la stabilità e la conformazione delle proteine. Pertanto, combinando saggi comportamentali, imaging e tecniche biochimiche, siamo in grado di monitorare il misfolding delle proteine alla risoluzione dell'organismo, della cellula e della proteina, rispettivamente.

Introduzione

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L'interazione delle varie fasi della biosintesi proteica, come la trascrizione, l'elaborazione e la traduzione dell'mRNA, così come il ripiegamento, la traslocazione e l'assemblaggio/disassemblaggio delle proteine, determina il carico di proteine metastabili che dipendono dai meccanismi di controllo della qualità delle proteine cellulari per la loro funzione1. L'assenza o il malfunzionamento di macchinari per il controllo della qualità delle proteine può, quindi, provocare il declino funzionale di diversi tipi di macchinari cellulari e l'insorgenza di malattie da misfolding proteico2-7. Quando la capacità dei meccanismi di ripiegamento e clearance delle proteine è bilanciata con il carico di proteine metastabili, si raggiunge l'omeostasi delle proteine (proteostasi), uno stato che alla fine impedisce l'accumulo di proteine mal ripiegate e l'aggregazione all'interno delle cellule6. Si ritiene che l'accumulo di proteine mal ripiegate sia il segnale che attiva i fattori di trascrizione inducibili dallo stress, come il fattore di shock termico (HSF-1), e provoca l'attivazione di risposte citoprotettive allo stress6,8.

La nostra comprensione delle funzioni delle reti di proteostasi nei metazoi è derivata principalmente da studi di ricostituzione in vitro e da osservazioni fatte con cellule di coltura tissutale e organismi unicellulari9. Ad esempio, la ricerca sugli chaperoni molecolari che prevengono e risolvono il danno proteico si è concentrata su studi biochimici e di biologia cellulare sui meccanismi di ripiegamento, disaggregazione e traslocazione delle proteine mediati da chaperone10-13. In confronto, sono disponibili solo informazioni limitate sulla funzione integrata di vari componenti della proteostasi nelle diverse cellule e tessuti dei metazoi in condizioni di crescita "normali" e in risposta allo stress11. La scoperta che in C. elegans il controllo della qualità delle proteine cellulari può essere regolato anche in modo non autonomo a livello cellulare, come dimostrato da esperimenti che dimostrano che le mutazioni nei due neuroni che percepiscono la temperatura possono bloccare l'attivazione della risposta allo shock termico e ridurre la termotolleranza, ha dimostrato la necessità di studiare la regolazione della proteostasi negli organismi multicellulari14-17. Ciò che manca, tuttavia, è un quadro coerente di come le reti di proteostasi, come le varie famiglie di chaperoni molecolari, funzionino nei tessuti di un metazoo intatto e quanto siano dinamiche queste reti durante lo sviluppo e l'invecchiamento. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari sensori affidabili per il monitoraggio del mantenimento del proteoma negli animali viventi per determinare la capacità proteostatica di diverse cellule in un organismo multicellulare durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento.

Affinché una data proteina funzioni come sensore di proteostasi cellulare, deve rispondere ai cambiamenti nell'ambiente di ripiegamento cellulare interferendo solo minimamente con il ripiegamento di proteine non correlate nella cellula. Per esplorare il mantenimento e il recupero della proteostasi cellulare in un organismo vivente, è possibile adottare due approcci complementari che dipendono dai sensori di ripiegamento. Il primo si basa su sensori di ripiegamento progettati, basati su proteine metastabili identificate sperimentalmente che sono note per dipendere da macchinari di proteostasi, come la luciferasi18-20 della lucciola o la GFP marcata con un degron21-24. Nel secondo approccio, le proteine metastabili endogene, come le proteine aggreganti sensibili alla temperatura o quelle dipendenti dall'età che rispondono a cambiamenti incrementali nell'ambiente cellulare, sono tracciate25-27. I sensori pieghevoli progettati non svolgono alcuna funzione biologica essenziale, ma offrono il vantaggio di essere rilevabili da potenti saggi di refertazione, come le proteine marcate con GFP, e possono essere impiegati con molti modelli cellulari e animali diversi18. Tuttavia, poiché l'introduzione di una singola proteina estranea può influenzare l'ambiente di ripiegamento27, tali polipeptidi possono sovraccaricare il meccanismo della proteostasi cellulare. In alternativa, i sensori di ripiegamento progettati che non sono nativi della cellula su cui riportano potrebbero non essere influenzati dai cambiamenti nella capacità di proteostasi della cellula. Ad esempio, un substrato reporter del proteasoma marcato con GFP richiedeva l'inibizione di ~90% del proteasoma prima che un fenotipo potesse essere rilevato23. Al contrario, le proteine metastabili endogene che si basano sui meccanismi di proteostasi della cellula offrono il vantaggio di essere all'interno dell'intervallo di sensibilità cellulare. Tuttavia, la perdita di funzione associata al misfolding di tali proteine può anche influire sulla funzione cellulare e sulla vitalità dell'organismo. Qui, ci concentreremo sull'uso di sensori di ripiegamento endogeni di C. elegans.

C. elegans è un modello metazoo ben consolidato per lo studio sia dello sviluppo che dell'invecchiamento che utilizza molti percorsi biologici conservati e può essere utilizzato per seguire il ripiegamento delle proteine nella cellula, utilizzando una combinazione di approcci di biologia cellulare, biochimica e genetica. Abbiamo impiegato proteine metastabili come sonde della capacità proteostatica monitorando i cambiamenti nel loro fenotipo, localizzazione e stabilità. Una varietà di funzioni proteiche può, inoltre, essere studiata con una semplice analisi comportamentale. Allo stesso modo, si verifica una sostanziale errata localizzazione delle proteine quando le reti di controllo della qualità delle proteine cellulari non riescono ad adattarsi alle richieste cellulari. Le proteine possono essere facilmente visualizzate nelle cellule di animali viventi utilizzando proteine marcate in fluorescenza o tramite immunocolorazione. Infine, utilizzando metodi ex vivo, è possibile monitorare l'espressione e la stabilità delle proteine. Ciò consente uno screening rapido e semplice dei cambiamenti comportamentali e fisiologici, insieme a un'analisi approfondita della localizzazione e della stabilità delle proteine, consentendo il monitoraggio dei modificatori della proteostasi. Combinando questi diversi metodi, è possibile ottenere un'ampia visione dell'ambiente di ripiegamento delle proteine di una cellula. Infatti, questa strategia è stata utilizzata con successo per monitorare la perturbazione della proteostasi in C. elegans, lievito, colture tissutali e batteri15,25-35.

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Protocollo

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Utilizzo di saggi comportamentali per monitorare il ripiegamento delle proteine in un organismo vivente

1. Sincronizzare gli animali per i saggi comportamentali

  1. Seguire i metodi standard per il mantenimento di C. elegans36, compresa la preparazione di terreni e piastre, la preparazione del cibo e le condizioni di crescita degli animali. Controllare attentamente le condizioni di coltivazione, tra cui la temperatura (15-25 °C), le dimensioni della popolazione e la disponibilità di cibo. Eliminare qualsiasi piastra che mostri contaminazione batterica o fungina.
  2. Prelevare 15-30 embrioni, trasferirli su nuove piastre e farli crescere alla temperatura desiderata (15-25 °C) per tutta la durata dell'esperimento. In alternativa, mettete 10-20 adulti gravidi su un piatto, lasciateli deporre le uova per 30-60 minuti e poi rimuoveteli dal piatto. Sia il prelievo diretto degli embrioni che l'impostazione di adulti gravidi daranno una certa variabilità nell'età (±6 ore). Per ridurre questa variabilità, è necessario prelevare gli embrioni in una fase specifica, ad esempio la virgola, o impostare 10-20 adulti che stanno appena iniziando a deporre le uova (giorno 2 dell'età adulta). Evitare la sincronizzazione con lo sbiancamento quando possibile, dato che questo trattamento è stressante e può influire sulla proteostasi.
  3. Prelevare gli animali sincronizzati, trasferirli su una piastra di analisi per il punteggio e poi scartarli.

2. Saggio del movimento

Scegli gli animali sincronizzati e trasferiscili su una piastra pulita alla temperatura desiderata per il punteggio del movimento (15-25 °C). Per ogni replica biologica, assegnare un punteggio >20 animali e ripetere il test almeno 3 volte per condizione sperimentale. Utilizzare il test della somma dei ranghi di Wilcoxon Mann-Whitney per confrontare due condizioni sperimentali indipendenti.

  1. Per rilevare eventuali lievi disturbi del movimento, posizionare 5-7 animali al centro di un prato batterico pulito e lasciare che gli animali si muovano sulla piastra per 2 minuti. Questo intervallo di tempo è stato determinato in base al tempo impiegato dal 90% degli animali selvatici per liberare un cerchio di 1 cm.
  2. Conta il numero di animali che non hanno superato un cerchio di 1 cm (ad esempio che sono rimasti entro un raggio di 1 cm dal punto in cui erano stati posizionati) entro 2 minuti come non coordinati.
  3. Per verificare la presenza di gravi disturbi del movimento, posizionare gli animali su un prato batterico pulito.
  4. Fotografare diversi animali al tempo zero (t=0) e di nuovo 5 minuti dopo (t=5). Segna gli animali che non si sono mossi di una lunghezza del corpo dopo 5 minuti come paralizzati.

3. Resistenza termica

  1. Prelevare >20 animali sincronizzati e trasferirli in una piastra a 24 pozzetti contenente 450 μl di tampone per shock termico (HS) (Tabella 1). Per ogni replica biologica, assegnare un punteggio >20 animali e ripetere il test almeno 4 volte per condizione sperimentale.
  2. Trasferire la piastra a 24 pozzetti in un bagno riscaldato. La temperatura e la durata dell'HS dipendono fortemente dalle condizioni di crescita, in particolare dalla temperatura di coltivazione.
  3. Integrare il tampone HS con 9 μl di SYTOX orange.
  4. Valutare la sopravvivenza degli animali monitorando l'assorbimento del colorante, utilizzando uno stereoscopio fluorescente con filtro TXR. Gli animali che hanno assorbito il colorante sono morti. Utilizzare il test della somma dei ranghi di Wilcoxon Mann-Whitney per confrontare due condizioni sperimentali indipendenti.

Utilizzo di immunocolorazione e proteine marcate per monitorare il ripiegamento delle proteine in cellule specifiche

4. Monitorare la localizzazione delle proteine mediante immunocolorazione

  1. Nella fase richiesta, trasferire almeno 30 animali in una provetta Eppendorf contenente il tampone M936.
  2. Lavare gli animali alcune volte con il tampone M9 eseguendo una breve fase di centrifugazione a bassa velocità (3.000 giri/min/900 x g, 2 min) e risuspendando.
  3. Mettere i tubi sul ghiaccio per qualche minuto per farli raffreddare.
  4. Rimuovere il liquido in eccesso e incubare con 500 μl di soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% (Tabella 2). Il tempo di incubazione deve essere calibrato per ogni proteina esaminata e dovrebbe essere di circa 5-30 minuti a temperatura ambiente. Può essere eseguita anche un'incubazione prolungata a 4 °C, ma ciò può compromettere la permeabilizzazione del campione.
  5. Lavare gli animali fissi 3 volte con tampone PBS-Tween (pH 7,2) mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min). Gli animali possono essere conservati in questa fase a 4 °C per alcune settimane.
  6. Raccogliere gli animali mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min).
  7. Nella cappa, rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di soluzione di β-mercaptoetanolo (β-ME) (Tabella 2).
  8. Incubare a 37 °C per una notte con un leggero dondolio su un nutatore.
  9. Nella cappa, lavare gli animali 3 volte con tampone PBS-Tween (pH 7,2).
  10. Risospendere gli animali in 50-100 μl di PBS-Tween (pH 7,2). Gli animali possono essere conservati in questa fase a 4 °C per alcune settimane.
  11. Raccogliere gli animali mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min) e rimuovere la maggior parte del tampone PBS-Tween.
  12. Aggiungere 100-150 μl di soluzione di collagenasi in ciascuna provetta e incubare a 37 °C con una forte agitazione (utilizzando un termomiscelatore o un incubatore ad agitazione).
  13. Esaminare frequentemente gli animali allo stereomicroscopio, iniziando dopo 5 minuti di incubazione. Quando il 20% degli animali è rotto, fermare la reazione posizionando il tubo sul ghiaccio. Questo passaggio è molto delicato! La durata del trattamento dipende dalle condizioni di fissazione e può variare notevolmente tra i ceppi. Un'incubazione prolungata potrebbe comportare la completa degradazione degli animali. Le condizioni devono essere calibrate per ogni lotto di enzimi utilizzato e la degradazione deve essere monitorata attentamente.
  14. Lavare gli animali due volte in PBS-Tween (pH 7,2) e poi raccogliere gli animali mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min) e rimuovere la maggior parte del tampone PBS-Tween.
  15. Aggiungere 1 ml di soluzione di AbA (Tabella 2) e incubare con un leggero dondolio per 1 ora a temperatura ambiente. Gli animali possono essere conservati in questa fase a 4 °C per alcune settimane.
  16. Raccogliere gli animali mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min) e risospendere in 200 μl di AbA.
  17. Aggiungere l'anticorpo primario diluito a 1:100-1:1.000 in soluzione di AbA e incubare con un leggero oscillamento. La temperatura e la durata dell'incubazione possono variare tra gli anticorpi e devono essere calibrate per ogni proteina esaminata. Iniziamo con un'incubazione notturna a temperatura ambiente.
  18. Lavare gli animali mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 min).
  19. Aggiungere il tampone AbA (1 ml) e incubare mescolando delicatamente per 15-60 minuti a temperatura ambiente. Gli animali possono essere conservati in questa fase a 4 °C per alcune settimane.
  20. Opzionale: il campione può anche essere colorato con coloranti fluorescenti. A tal fine, aggiungere il colorante (ad es. DAPI (2 mg/ml) o falloidina (1:100)) a 200 μl di AbA e incubare con un leggero oscillazione per un massimo di 1 ora. Questo passaggio può essere eseguito durante uno dei passaggi per il lavaggio dell'anticorpo secondario.
  21. Lavare gli animali 3 volte ripetendo i passaggi 4.18-4.19.
  22. Aggiungere 100 μl di AbA con l'anticorpo secondario appropriato marcato in fluorescenza, diluito 1:100.
  23. Mantenere i campioni coperti (o in una provetta scura) e incubare con oscillazione per diverse ore a temperatura ambiente.
  24. Lavare gli animali 3 volte incubandoli in tampone AbA (1 ml) mescolando delicatamente per 15-60 minuti a temperatura ambiente seguiti da centrifugazione (3.000 giri/min, 1-2 minuti). Gli animali possono essere conservati in questa fase a 4 °C per alcune settimane.
  25. Per montare gli animali sui vetrini, rimuovere tutto il liquido e risospendere in 10 μl dello stesso tampone.
  26. Tagliare l'estremità della punta della pipetta per evitare che gli animali si sporgano e trasferire 1-2 μl del campione su un vetrino.
  27. Aggiungere il mezzo di montaggio in un rapporto 1:1.
  28. Coprire delicatamente il vetrino con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie. Se il vetrino non viene monitorato immediatamente, i vetrini possono essere conservati a -20 °C per un periodo di tempo prolungato.

5. Monitora la Localizzazione delle Proteine Etichettate

  1. Nella fase richiesta, raccogliere almeno 15 animali in una goccia da 10 ml di tampone M9 su un vetrino.
  2. Usando un "vermiform", spostare gli animali in una goccia da 10 ml di soluzione di paraformaldeide (4%) (Tabella 2) e attendere che tutti gli animali smettano di muoversi (circa 5 minuti).
  3. Usando un "plettro a vite senza fine", spostare gli animali in una goccia da 2 ml di tampone M9 e mezzo di montaggio (1:1) (Tabella 2).
  4. Coprire delicatamente gli animali con un vetrino coprioggetti e sigillare con smalto per unghie.

Utilizzo di saggi ex vivo per monitorare il ripiegamento e la stabilità delle proteine

6. Digestione parziale

  1. Lavare gli animali da 15 piastre (60 mm) utilizzando 1-2 ml di tampone M9 in una provetta per microfuge. Si prega di notare che gli animali non devono essere affollati e che deve essere disponibile cibo sufficiente per tutta la durata dell'esperimento.
  2. Lavare gli animali alcune volte con il tampone M9 mediante centrifugazione (3.000 giri/min, 2 min) e risospendere gli animali.
  3. Dopo la centrifuga finale, risospendere gli animali in 100 μl di tampone M9.
  4. Congelare nel liquido N2. I campioni possono essere conservati a -80 °C.
  5. Utilizzando un pestello refrigerato e un trapano motorizzato (è possibile utilizzare anche un trapano manuale per coltura tissutale), macinare il campione. Conservare il campione sul ghiaccio ed evitare il surriscaldamento.
  6. Esamina frequentemente gli animali con uno stereomicroscopio per determinare se la macinazione è completa. Se rimangono animali intatti, ripetere la procedura.
  7. Stimare il volume pipettando l'estratto di verme.
  8. Aggiungere un rapporto 1:1 di (2x) soluzione di lisi di vermi (Tabella 3). Non utilizzare inibitori della proteasi di alcun tipo.
  9. Incubare con ghiaccio per 15 min.
  10. Rimuovere i detriti mediante centrifugazione (1.000 x g per 2 min) in una centrifuga preraffreddata (4 °C).
  11. Trasferire il surnatante in una provetta per microfuge pulita. I campioni possono essere utilizzati direttamente o conservati a -80 °C.
  12. Preparare la soluzione di chimotripsina (Tabella 3) e mantenerla in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  13. Determinare la concentrazione proteica totale utilizzando il test di Bradford.
  14. Se necessario, diluire il campione in modo che la concentrazione proteica totale sia di 3-3,5 mg/ml.
  15. Aggiungere la soluzione di chimotripsina al lisato proteico totale (1:1,200).
  16. Per determinare il tempo di incubazione, incubare il campione con chimotripsina per 60 minuti. Rimuovere 20 μl di aliquote dal campione in diversi punti temporali (ad es. 0, 5, 20, 40 e 60 minuti), mescolare immediatamente con il tampone per campioni SDS e far bollire per 5 minuti a 96 °C. *In alternativa, incubare il campione con diverse concentrazioni di chimotripsina e interrompere la reazione dopo un tempo specifico aggiungendo il tampone per campioni SDS e facendo bollire per 5 minuti a 96 °C.
  17. Esegui i campioni su un gel SDS-PAGE.
  18. Eseguire l'analisi western blot utilizzando anticorpi appropriati per determinare la stabilità relativa della proteina.
  19. Determinare le condizioni ottimali (concentrazione di chimotripsina e tempo di digestione) che mostrano cambiamenti significativi tra i campioni e utilizzare queste condizioni per esperimenti futuri.
  20. Determinare l'intensità di diversi prodotti digestivi (frammenti a basso peso molecolare) utilizzando un software di densitometria, come il modulo NIH image gel.

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Risultati

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Un ambiente di ripiegamento compromesso può portare a un misfolding e aggregazione delle proteine. Il ripiegamento errato delle proteine è associato a un'alterata conformazione e provoca una perdita della funzione proteica. Utilizziamo approcci complementari per monitorare il ripiegamento e la funzione delle proteine in animali intatti, cellule specifiche ed estratti proteici. Una scelta intelligente di sensori di ripiegamento, basata su forti fenotipi comportamentali e cellulari associati a una mutazione destabilizzante...

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Discussione

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Le sonde della capacità di proteostasi cellulare devono essere altamente sensibili ai cambiamenti nell'ambiente di ripiegamento ed essere facilmente monitorate in modo da fornire una valutazione in tempo reale delle capacità di controllo della qualità del ripiegamento delle proteine. Utilizzando proteine metastabili come sonde della capacità di proteostasi, abbiamo monitorato i cambiamenti nel fenotipo, nella localizzazione subcellulare delle proteine e nella conformazione delle proteine. I protocolli qui presentati si c...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Tutti i ceppi di nematodi utilizzati in questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, che è finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR). Gli anticorpi monoclonali sviluppati da H.F. Epstein sono stati ottenuti dalla Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppata sotto l'egida del NICHD e gestita dal Dipartimento di Biologia dell'Università dell'Iowa. N. Shemesh è stato sostenuto dal premio Fay e Bert Harbour. A.B.-Z. è stato sostenuto da una borsa di studio Alon del Consiglio israeliano per l'istruzione superiore, da una sovvenzione Marie Curie International Reintegration e da sovvenzioni della Binational Science Foundation e della Israeli Science Foundation (sovvenzione n. 91/11).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo staning e fiaxtionparaformaldeideMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
CollagenaseSigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
β -MESigma8057400250
BSA Di Cam000-40-100
  Digest parziale ChimotripsinaSigmaC4129-250MG
Termo-resistenzaSYTOX ArancioneInvitrogenS11368
ColesteroloAmaresco0433-250G
ATTREZZATURA M165
FC stereoscopio fluorescenteTXR filtroEXi
Blue Fluorescenza Microscopia FotocameraQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META microscopio confocaleZeiss
Pestelli a pelletSigmaZ359947-100EA
Pestello a pellet Motore a batteriaKontesK749540-0000
MicroCL 17 Serie di microcentrifugheThermo75002455Refrigerato, 230 V 50/60 Hz, include 24 rotori da 1,5/2,0 ml con coperchio di biocontenimento ClickSeal
Leica

Riferimenti

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