Articolo metodologico

Stabilire la concentrazione battericida minima di un agente antimicrobico per cellule planctoniche (MBC-P) e cellule biofilm (MBC-B)

DOI:

10.3791/50854

⸱

2 gennaio 2014

1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico che può formare un biofilm in vitro utilizzando una piastra microtitere a 96 pozzoli. I batteri planctonici o biofilm sono esposti a diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. La vitalità è dimostrata dalla crescita sulle piastre di agar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico in grado di formare un biofilm in vitro. I batteri vengono inoculati nei pozzi di una piastra di microtitolo da 96 po '. Nel caso del saggio planctonico, alle sospensioni batteriche vengono aggiunte diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. Nel saggio del biofilm, una volta inoculato, i batteri vengono lasciati a formare un biofilm per un determinato periodo di tempo. Le cellule non attaccate vengono rimosse dai pozzi, il supporto viene rifornito e vengono aggiunte diluizioni seriali dell'agente antimicrobico di scelta. Dopo l'esposizione all'agente antimicrobico, le cellule planctoniche vengono studiate per la crescita. Per il saggio del biofilm, il supporto viene rinfrescato con nuovi mezzi privi dell'agente antimicrobico e le cellule del biofilm vengono lasciate recuperare. La vitalità delle cellule biofilm viene saggiata dopo il periodo di recupero. L'MBC-P per l'agente antimicrobico è definito come la più bassa concentrazione di farmaco che uccide le cellule nella coltura planctonica.  Al contrario, l'MBC-B per un ceppo è determinato esponendo biofilm preformati ad concentrazioni crescenti di agente antimicrobico per 24 ore. L'MBC-B è definito come la più bassa concentrazione di agente antimicrobico che uccide le cellule nel biofilm.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I test di resistenza agli antibiotici sono stati inizialmente sviluppati per saggiare la resistenza delle colture planctoniche (a nuoto libero) dei batteri. Poiché molte infezioni batteriche coinvolgono biofilm (cellule attaccate alla superficie), eravamo interessati a sviluppare un metodo per saggiare la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm. Tuttavia, la maggior parte dei test di resistenza agli antibiotici sono poco adatti per misurare la resistenza dei biofilm. Ad esempio, determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) è il gold standard per determinare la resistenza agli antibiotici delle colture batteriche planctoniche 1. Questo saggio comporta la miscelazione di una coltura planctonica diluita con una serie di diluizione di antibiotici.  La concentrazione di antibiotico che inibisce la crescita visibile delle cellule planctoniche è il MIC. Poiché questo saggio si basa sull'inibizione della crescita, per definizione, non può funzionare con colture di biofilm, il che richiede l'esame della sensibilità antibiotica delle cellule in un biofilm precarato. Invece di misurare l'inibizione della crescita, il saggio MBC-B qui descritto determina la concentrazione di antibiotici che uccide le cellule già esistenti in un biofilm. Pertanto, questo test mira a imitare i trattamenti antibiotici delle infezioni da biofilm accertate e fornire una visione più pertinente della resistenza agli antibiotici batterici in vivo.

Poiché i biofilm sono generalmente più resistenti agli antibiotici rispetto alle colture planctoniche 2-4 , è stato necessario escogitare un metodo che mette direttamente in relazione la resistenza antibiotica di un biofilm a quella di una coltura planctonica. Quindi un altro obiettivo di questo metodo è quello di essere in grado di confrontare direttamente il livello di resistenza agli antibiotici tra cellule planctoniche e biofilm. I test MBC-P e MBC-B qui descritti lo rendono possibile perché le cellule sono coltivate in condizioni simili. Abbiamo utilizzato questo metodo per studiare diversi geni che sono importanti per la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm 5-8 .

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MBC-B

  1. Coltivare un biofilm (adattato da O'Toole9).
    1. Coltiva una cultura del ceppo di interesse di tipo selvaggio e del ceppo mutante per 16 ore in un mezzo ricco a 37 °C.
    2. Diluire le colture notturne sature 1:100 in mezzo fresco per i test di resistenza agli antibiotici. Un mezzo standard per P. aeruginosa è il mezzo minimo M63 integrato con solfato di magnesio e arginina (vedi tabella 1). Questo mezzo stimola la formazione di un biofilm più robusto.
    3. Aggiungere 100 μl di diluizione per pozzo in un piatto di microtitolo da 96 po' (vedi tabella 1). Poiché questi saggi vengono in genere eseguiti in triplice copia per ogni ceppo, dovrebbero esserci 24 pozzi di ogni ceppo.
    4. Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
  2. Esposizione del biofilm preformato a un gradiente di concentrazione di antibiotici
    1. Preparare una serie di diluizione 10x di antibiotico per 7 pozzi. Esempio: per la tobramicina antibiotica, le concentrazioni finali nei pozzi sono 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,006 mg/ml 5-8 . Da uno stock di 25 mg/ml, preparare 10 diluizioni di 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,06 mg/ml. Lascia sul ghiaccio.
    2. Rimuovere il supernatante speso (contenente celle planctoniche) utilizzando una pipetta multicanale (vedere tabella 1).
    3. Aggiungere 90 μl M63 (Mg/Arg) a tutti i pozzi.
    4. Aggiungere 10 μl di ogni concentrazione antibiotica 10x per ottenere le concentrazioni finali desiderate. Aggiungere 10 μl di acqua (nessun controllo antibiotico) al pozzo finale per ogni replica e ceppo.
    5. Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
  3. Rinfrescare il supporto e consentire il distacco di cellule vive.
    1. Rimuovere il supernatante speso (contenente celle planctoniche) utilizzando una pipetta multicanale.
    2. Aggiungere 115 μl M63 (Mg/Arg) a tutti i pozzi.
    3. Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
  4. Saggio per cellule vive.
    1. Etichettare due piastre di agar LB per piastra microtiter a 96 pozzo.
    2. Sterilizzare il dispositivo multiprong (vedi tabella 1) immergere i prong in etanolo al 100% e passare le sporgenze attraverso la fiamma aperta di un bruciatore Bunsen. ripetere. Lascia raffreddare leggermente le sporgenze. Utilizzando il dispositivo multiprong, trasferire ~3 μl (quantità che viene tipicamente trattenuta sulle punte delle punte) della coltura planctonica da ogni pozzo della piastra del microtitolo alla superficie di una piastra di agar LB.
    3. Incubare le piastre di agar LB per 16 ore a 37 °C.
    4. Determinare la concentrazione battericida minima dell'antibiotico identificando, a occhio, il taglio per la crescita batterica (Figura 1).

2. MBC-P

  1. Preparazione di ceppi batterici
    1. Coltiva una cultura del ceppo di interesse di tipo selvaggio e del ceppo mutante per 16 ore in un mezzo ricco a 37 °C.
    2. Diluire le colture notturne sature 1:100 in mezzo fresco per i test di resistenza agli antibiotici. Un mezzo standard per P. aeruginosa è il mezzo minimo M63 integrato con solfato di magnesio e arginina (vedi tabella 1).
    3. Aggiungere 90 μl di diluizione per pozzo in un piatto di microtitolo da 96 po' (vedi tabella 1). Poiché questi saggi vengono in genere eseguiti in triplice copia per ogni ceppo, dovrebbero esserci 24 pozzi di ogni ceppo.
  2. Esposizione delle cellule planctoniche a un gradiente di concentrazione di antibiotici
    1. Preparare una serie di diluizione 10x di antibiotico per 7 pozzi. Esempio: per la tobramicina antibiotica, le concentrazioni finali nei pozzi sono 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 e 0,0005 mg/ml. Da uno stock di 25 mg/ml, preparare diluizioni di 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 e 0,005 mg/ml. Lascia sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 10 μl di ogni concentrazione antibiotica 10x per ottenere le concentrazioni finali desiderate. Aggiungere 10 μl di acqua (nessun controllo antibiotico) al pozzo finale per ogni replica e ceppo.
    3. Incubare la piastra del microtitoro per 24 ore a 37 °C.
  3. Saggio per cellule vive.
    1. Etichettare due piastre di agar LB per piastra microtiter a 96 pozzo.
    2. Sterilizzare il dispositivo multiprong (vedi tabella 1) immergere i prong in etanolo al 100% e passare le sporgenze attraverso la fiamma aperta di un bruciatore Bunsen. ripetere. Lascia raffreddare leggermente le sporgenze. Utilizzando il dispositivo multiprong, trasferire ~3 μl (quantità che viene tipicamente trattenuta sulle punte delle punte) della coltura planctonica da ogni pozzo della piastra del microtitolo alla superficie di una piastra di agar LB.
    3. Incubare le piastre di agar LB per 16 ore a 37 °C.
    4. Determinare la concentrazione battericida minima dell'antibiotico identificando, a occhio, il taglio per la crescita batterica (Figura 2).

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati eseguiti saggi MBC-P e MBC-B, confrontando la sensibilità del tipo selvaggio PA14 con PA14 ∆ndvB. La tobramicina è stata usata come antibiotico. Vengono presentati i risultati corrispondenti al passaggio 1.4.4 (Figura 1) e al passaggio 2.3.4 (Figura 2). PA14 e ∆ndvB sono stati inoculati nei saggi MBC-P e MBC-B in triplice copia. Dopo aver completato i passaggi 1.0-1.4 del protocollo MBC-B e i passaggi 2.0-2.3 del protocollo MBC-P, le celle vitali sono state p...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resistenza agli antibiotici nelle cellule planctoniche è definita come un aumento della concentrazione inibitoria minima (MIC) di un antibiotico a causa di un cambiamento permanente nelle cellule(ad esempio una mutazione). I meccanismi di resistenza o tolleranza specifici del biofilm che sono stati identificati fino ad oggi sono il risultato dell'espressione di geni di tipo selvatico all'interno dei biofilm. Pertanto, la definizione classica di resistenza non si applica ai biofilm. Tuttavia, è stata presentat...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'autrice dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'autore desidera ringraziare Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz e Clayton Hall per l'aiuto editoriale con questo manoscritto. Questo saggio è stato inizialmente sviluppato nel laboratorio di George O'Toole, Geisel School of Medicine al Dartmouth. La ricerca nel laboratorio del Dr. Mah è supportata da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e della Cistica Fibrosis Canada.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti

1x  M63

Prepare as a 5x  Stock M63 sciogliendo 15 g di KH2PO4, 35 g di K2HPO4 e 10 g (NH4)2SO4 in 1 L di acqua. Questo brodo non deve essere sterilizzato in autoclave e può essere conservato a temperatura ambiente. Diluire 5x  magazzino 1:5, autoclave, raffreddare, quindi aggiungere i componenti desiderati.

KH2PO4

Fisher

P285-500

K2HPO4

Fisher

P288-500

(NH4)2SO4

Sigma

A5132

Solfato di magnesio

Fisher

M63-500

Aggiungi alla concentrazione finale di 1 mM.  Preparare come brodo da 1 M in acqua e autoclave.

Tobramicina

Sigma

Preparare 50 mg/m  ceppo. Aliquot e memorizza su -20°C.

Arginina

Sigma

A5131

Aggiungi alla concentrazione finale dello 0,4%.  Preparare come una scorta al 20% in acqua e filtrare sterilizzare. Questa fonte alternativa di carbonio/energia può sostituire il glucosio e gli acidi casammino

piastre per microtitolazione a 96 pozzetti

Corning

3595

Sterile, fondo piatto, bassa evaporazione

Tranferpette (pipetta multicanale)

BrandTech

2703610

8-channel, 20-200 μ l

Dispositivo multipunta

Dan-Kar

MC48

48 si inseriscono in ½ di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
  2. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  5. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  6. Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
  7. Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
  8. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  9. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  10. Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
  11. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
  12. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
  13. Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).

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Diluizione serialePiastra microtiter a 96 pozzettiPiastre di agar LBDispositivo a pi punteSaggio della tobramicinaVitalit batterica

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