Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per<em&gt; In situ</em&gt; Mappatura 3D di biofilm batterici Proprietà fisiche

Sommario

Questo documento mostra un metodo originale basato sul comando a distanza di particelle magnetiche seminate in un biofilm batterico e lo sviluppo di pinzette magnetiche dedicate per misurare in situ le proprietà meccaniche locali del materiale vivente complesso costruito dai microrganismi alle interfacce.

Abstract

Adesione batterica e crescita su interfacce portano alla formazione di strutture tridimensionali eterogenei cosiddetti biofilm. Le cellule vive in queste strutture sono tenute insieme da interazioni fisiche mediate da una rete di sostanze polimeriche extracellulari. Biofilm batterici impatto molte attività umane e la comprensione delle loro proprietà è fondamentale per un migliore controllo del loro sviluppo - mantenimento o l'eradicazione - a seconda del loro esito avverso o benefico. Questo documento descrive una nuova metodologia che mira a misurare in situ le proprietà fisiche locali del biofilm che era stato finora esaminato solo dal punto di vista macroscopico e materiale omogeneo. L'esperimento qui descritto comporta l'introduzione di particelle magnetiche in un biofilm cresce a seme sonde locali che possono essere azionati a distanza senza disturbare le proprietà strutturali del biofilm. Pinzette magnetiche dedicati sono stati svipato per esercitare una forza definita su ciascuna particella incorporato nel biofilm. La configurazione è montato sulla scena di un microscopio per consentire la registrazione di immagini intervallati di periodo particella tirando. Le traiettorie delle particelle vengono estratti dalla sequenza e tirando i parametri viscoelastici locali sono derivati ​​da ciascuna curva spostamento particella, fornendo così la distribuzione 3D-spaziale dei parametri. Acquisendo informazioni sul profilo meccanico biofilm è essenziale dal punto di vista di un ingegnere per scopi di controllo biofilm ma anche dal punto di vista fondamentale per chiarire la relazione tra le proprietà architettoniche e la biologia specifica di queste strutture.

Introduzione

Biofilm batterici sono comunità di batteri associati con superfici biologiche o artificiali ^1-3. Essi formano da un meccanismo di adesione crescita accoppiato con la produzione di matrice extracellulare ricca di polisaccaride che protegge e stabilizza l'edificio ^4,5. Questi biofilm non sono assemblaggi semplicemente passivi di cellule attaccati alle superfici, ma organizzati e complessi sistemi biologici dinamici. Quando i batteri passano da planctoniche allo stile di vita biofilm, cambiamenti nell'espressione genica e fisiologia cellulare sono stati osservati, nonché una maggiore resistenza agli antimicrobici e ospitare le difese immuni....

Protocollo

1. Batteri, Cultura e sospensione Preparazione

1. Scegliere la colonia appena cresciuta da una piastra di agar lisogenia Broth (LB), inoculare in 5 ml di terreno LB liquido contenente 100 μ g / ml ampicillina e 7,5 μ g / ml di tetraciclina e incubare per 5 a 6 ore a 37 ° C su una piattaforma di agitazione.
2. Poi, aggiungere 100 μ l di coltura batterica in 5 ml di terreno minimo (M63B1) supplementato con 0,4% di glucosio e le stesse concentrazioni di antibiotico. Incubare questa coltura durante la notte appena diluito a 37 ° C su una piattaforma di agitazione.
3. Dopo 16 ore di incubazione, aggiungere 100 microlitri de....

Risultati

Un'analisi tipica fornirà la distribuzione spaziale dei parametri viscoelastici in scala micron su un biofilm vivere senza disturbare l'arrangiamento originale. I risultati tipici sono mostrati in figura 7 dove i valori di J ₀ - la cedevolezza elastica - sono date in funzione del l'asse z lungo la profondità e l'asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a una sfera che l'analisi della curva di creep ha fornito un valore di J _0. I d.......

Discussione

Questa particella magnetica semina e tirando attivato in situ mappatura 3D dei parametri viscoelastici di un biofilm cresce nel suo stato originale esperimento. Questo approccio ha rivelato l'eterogeneità meccanica del E. coli biofilm cresciuto qui e ha dato indizi per precisare le componenti del biofilm che sostengono i biofilm proprietà fisiche, suggerendo fortemente una implicazione fondamentale della matrice extracellulare e più precisamente il grado di reticolazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tabella 1: Reagenti e cellule
Particelle magnetiche Life	technologies	14307D	Particella magnetica micrometrica, 2.8 &; m diametro
Ampicillina (Antibiotico)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetraciclina (Antibiotico)	Sigma-Aldrich	87128
Ceppo batterico MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, Francia		Produce F pili sulla sua superficie, resistente all'ampicillina e alla tetraciclina.
Tabella 2: Capillari e tubi
Filtri per perfusione pediatrica	Prodimed-Plastimed	6932002
Capillari quadrati cavi	Metallo composito Scientific	8280-100	Prodotto in vetro borosilicato. Quadrato 0,8 mm x 0,8 mm
Perossido di silicone	per tubi VWR international	228-0512	Diametro 1 mm
Perossido di silicone	per tubi VWR international	228-0700	Diametro 3 mm
Tabella 3: Crescita del biofilm
Soluzione di brodo di lisogenesi (LB)	Amresco-VWR	J106-10PK	Terreno standard utilizzato per la crescita di batteri.
Soluzione M63B1	Terreno minimo standard fatto		in casa utilizzato per far crescere i batteri.
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Utilizzato per produrre M63B1 medio con lo 0,4% di glucosio.
Tabella 4: Fotocamera Elettronica
EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Controllore riscaldatore	Strumenti di precisione mondiali	300354
Generatore di funzioni	Agilent technologies	33210A
Amplificatore di potenza	Fatto in		Fornisce un segnale di corrente con ampiezze fino a 4 A.
Pompe a siringa	Kd Scientific	KDS-220
Otturatore	Vincent Associates	Uniblitz T132
Pinzette magnetiche	Fatto		Due poli elettromagnetici, ciascuno costituito da una bobina di rame con 2.120 spire di filo di rame di 0,56 mm di diametro e nuclei in lega magnetica morbida (Supra50-Arcelor Mittal, Francia) di forma quadrata secondo il progetto mostrato in Figura 10. I due nuclei sono montati al polo nord rivolto verso il polo sud, in modo da generare una forza magnetica in una direzione lungo la lunghezza del capillare. Vedere i dettagli del cablaggio della bobina in Figura 11.
Tabella 5: Microscopio
invertito ottico	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Obiettivo (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		Questo è un obiettivo a lunga distanza di lavoro che consente l'osservazione del biofilm in profondità.
Filtri per epifluorescenza: 1) per fluorescenza verde: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) per la fluorescenza rossa: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Lo spostamento delle particelle dopo l'applicazione della forza viene registrato utilizzando il blocco del filtro rosso per la fluoresecenza.
Tabella 6: Analisi delle immagini
ImageJ	NIH - plugin

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