Approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APD) in Caenorhabditis elegans sono dimostrati. I dosaggi sono descritti per testare gli effetti della droga sullo sviluppo e la redditività e sulla faringe velocità di pompaggio. Questi metodi sono applicabili per esperimenti di farmacogenetica con classi di farmaci diversi da APD anche.
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Articolo metodologico
Metodi per studiare i meccanismi d'azione di farmaci antipsicotici in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di larga scala in avanti e retromarcia schermi genetici e schermi genetici chimici. La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica. L'esposizione APD produce ritardo di sviluppo e / o letalità in nematodi in modo concentrazione-dipendente. Questi fenotipi sono causati, in parte, mediante inibizione APD-indotta faringeo pompaggio 1,2. Così, il fenotipo di sviluppo ha una base neuromuscolare, rendendolo utile per studi di farmacogenetica dei neurolettici. Qui mostriamo le procedure dettagliate per testare gli effetti APD sullo sviluppo nematode e della faringe pompaggio. Per il saggio di sviluppo, gli embrioni sincronizzati sono immessi sul (NGM) piastre contenenti APD nematode mezzo di crescita, e le fasi di sviluppo di animali vengono quindi segnati giornalmente. Per il saggio faringeo tasso di pompaggio, in scena giovani animali adulti sono testati su piastre NGM contenenti APD. Il numero di pompe faringei per unità di tempo viene registrato, e la velocità di pompaggio è calcolato. Questi saggi possono essere utilizzati per studiare molti altri tipi di piccole molecole o anche grandi molecole.
Introduzione
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di grandi schermi genetiche in avanti e all'indietro e schermi genetici chimici. C. elegans è sensibile ad un ampio spettro di composti bioattivi e pertanto è stato usato con successo per definire i meccanismi di azione di una varietà di tali composti. Ad esempio, i composti bioattivi studiate usando farmacogenetica vermi sono agonisti del recettore dell'acetilcolina (ad esempio Levamisolo, nicotina, morantel, e Pyrantel), anestetici (es. alotano), la caffeina, gli inibitori della colinesterasi (ad esempio aldicarb, Lannate, e triclorfon), fluoruro, GABA-correlate composti (ad esempio GABA e muscimolo), ivermectina, paraquat, esteri del forbolo, e farmaci serotonina legati (es. serotonina e imiprimine) 3. Inoltre, C. elegans è stato usato per grandi schermi piccole molecole, permettendo scoperta di nuovi composti bioattivis e identificazione di nuovi bersagli genetici 4.
La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica 5. Così, C. elegans neurogenetica e offrono neurobiologia metodi per la scoperta di nuovi meccanismi molecolari d'azione di APD. In nematodi, l'esposizione APD precoce dello sviluppo produce ritardo dello sviluppo, e a concentrazioni più elevate, letalità 2,6. L'esposizione APD durante l'età adulta produce fenotipi comportamentali. Ad esempio, l'esposizione clozapina inibisce la locomozione e faringea pompaggio e migliora la deposizione delle uova 1,2,7.
APD-indotta ritardo e letalità dello sviluppo sono fenotipi potenti per grandi schermi genetici chimici. Questi fenotipi sono complesse nella misura in cui probabilmente hanno più di un BASI cellulari e geneticis. Pertanto, tali schermi genetici dovrebbero produrre una varietà di bersagli indiretti droga. Tuttavia, il nostro laboratorio ha condotto candidati schermi di geni e uno schermo RNAi genome-wide per soppressori di APD indotta ritardi e letalità dello sviluppo e ha recuperato con successo geni che codificano probabili bersagli diretti, tra cui la dopamina, l'insulina, e recettori nicotinici 2,8. Schermi genetici basati sui comportamenti APD-indotte nel adulti hanno portato anche all'identificazione di nuovi bersagli APD, e ora stiamo convalida bersagli dagli schermi sia sviluppo e comportamentali nei mammiferi 7. Così, un approccio invertebrato chimica genetica per scoprire i meccanismi molecolari d'azione delle APD sembra essere fattibile 5,8.
La C. elegans faringe è un organo che include 20 neuroni, cellule muscolari, 20 e 20 cellule accessorie, avvolto da una membrana basale. Simile al cuore dei mammiferi, la faringe è un autonomond pompe costantemente cibo dall'ambiente esterno 9. L'inibizione del tasso di pompaggio faringeo compromette l'assorbimento di cibo, e quindi le mutazioni o farmaci che inibiscono faringeo pompaggio causa ritardo nello sviluppo o arresto 9. APD inibiscono il tasso faringeo di pompaggio, che rappresentano in parte per i loro effetti sullo sviluppo e la redditività 1,2. Qui, usiamo il atipico APD clozapina come esempio per dimostrare saggi di droga per lo sviluppo nematode e della faringe pompaggio.
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Protocollo
1. Developmental Delay / letalità saggio: The Wild-Type (N2) e due Mutant (Mut1 e Mut2) ceppi sono stati testati in tre Clozapina concentrazioni in un 12-pozzetti
- Il giorno 1, versare 2 ml NGM medio 10 in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti (ogni pozzetto con un diametro di 2 cm) e lasciare indurire sul banco a temperatura ambiente (RT) per una notte. Lo stesso giorno, scegliere una colonia di batteri Escherichia coli OP50, infettare un flacone di 50 ml di soluzione LB, e la cultura in uno shaker 37 ° C a 220 giri al minuto di rotazione durante la notte.
- Il giorno 2, trasferire 20 microlitri coltura batterica OP50 sul centro di ogni NGM bene. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C o lasciarli a temperatura ambiente nella notte per consentire il prato batterica di crescere più spessa.
- Fare un clozapina soluzione stock 80 mM sciogliendo clozapina in DMSO (dimetilsolfossido) solvente. Poi fare una soluzione operativa 80 microlitri di soluzione madre diluita in 1.7 mM acido acetico based nella Tabella 1.
Nota: La soluzione di lavoro per un particolare farmaco di interesse deve essere determinato effettuando una serie di prove preliminari di concentrazione per determinare la concentrazione più adeguato per distinguere il tipo selvaggio dai mutanti. - Trasferimento 80 microlitri clozapina soluzione di lavoro sulla piastra NGM seminato bene e agitare la piastra per consentire alla soluzione per distribuire uniformemente sulla superficie. Attendere che la piastra si asciughi. Utilizzare la piastra per il saggio lo stesso giorno o metterla in un incubatore a 20 ° C da utilizzare il giorno successivo.
Nota: La soluzione di lavoro è una sospensione farmaco a causa della bassa solubilità della clozapina, soprattutto a maggiore concentrazione. Pertanto, agitare la provetta prima di trasferire la soluzione alla piastra farmaco per garantire che la concentrazione di farmaco è accurato. - Lavare i vermi fuori un piatto 3,5 centimetri contenente molti adulti gravide con tampone M9 e poi girare giù in una provetta da 15 mla 2.000 rpm per 1 min.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 5 ml di soluzione di candeggina (NaOH: ipoclorito: DDH 2 O a 4:01:05) e disturbare i nematodi invertendo delicatamente i tubi.
- Osservare gli animali fino a metà di essi vengono sciolti a circa 5 min. Spin giù le uova a 2.000 rpm per 1 min.
- Aspirare il surnatante e aggiungere rapidamente 14 ml di tampone M9.
- Spin giù le uova a 2.000 rpm per 1 min e aspirare il surnatante, lasciando circa 100 microlitri soluzione. Vortex per sospendere le uova.
- Transfer 2 uova microlitri sospesi in M9 su una piastra NGM regolare per testare quante uova sono trasferiti. Regolare il volume delle uova sospese per garantire che ci sono circa 30-35 uova per ogni trasferimento. Trasferire 30-35 uova in ciascun pozzetto della piastra di dosaggio e quindi incubare in un incubatore a 20 ° C per 24 ore.
- Il primo giorno del test, segnerà il numero di uova schiuse. Regolare il numero totale di animali nati per 25/well da picking fuori i vermi supplementari, se necessario.
- Nei giorni successivi, osservare gli animali e il punteggio loro ogni 24 ore. Stadio di sviluppo è ottenuto in base alla dimensione dell'animale e la forma della vulva 11. L'esperimento dura 5-6 giorni con l'effetto più robusto genere visto il terzo o quarto giorno.
- Inserire i dati in un file di Excel e calcolare la percentuale di animali in ogni fase di sviluppo per ogni giorno dell'esperimento. Generare grafici con la funzione di '100% Stacked Colonna 'in '2-D colonna' menu.
2. Faringeo pompaggio saggio: Giovane adulto Animals per il wild-type e mutanti ceppi sono segnati a tavola Clozapina Assay
- La piastra di saggio viene effettuata seguendo lo stesso protocollo usato per il saggio ritardo dello sviluppo / letalità.
- Accompagnamento 50 L4 animali per ogni ceppo di piastre NGM seminati 24 ore prima del dosaggio e incubare i vermi a 20 ° C.
- Scegli 10 animali ad un assay pozzetti. Poi scegliere 10 animali al prossimo bene ogni 15-20 min.
- Dopo gli animali del primo pozzo sono stati esposti al farmaco per 30 minuti, iniziare l'analisi osservando faringeo pompaggio sotto un microscopio dissezione e segnare le pompe per 20 secondi 9. Una volta faringea pompaggio è segnato, scegliere il verme dalla piastra.
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Risultati
1. Il ritardo dello sviluppo / letalità risultato del test
Un risultato tipico per il dosaggio ritardo dello sviluppo / letalità è dimostrato nelle figure 1a e 1b. Quando wild-type animali del gruppo di controllo sono cresciuti allo stadio adulto gravida (Figura 1a), wild-type animali esposti a clozapina sono ancora nelle giovani stadi larvali o sono morti (Figura 1b). Figura 1c mostra un risultato rappresentativo confronto un ...
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Discussione
Qui, descriviamo metodi per testare gli effetti della APD sullo sviluppo e comportamento di C. elegans. DMSO o etanolo è usato per sciogliere clozapina, in quanto il farmaco è relativamente insolubile in acqua. Dato che i solventi sono stati segnalati per influenzare C. elegans biologia 12, DMSO-alone o gruppi di controllo etanolo-alone sono essenziali. La massima concentrazione di DMSO utilizzata nei nostri test è fino al 3%, che non ha un effetto evidente sul C. elegans sviluppo. ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi sia conflitto di interesse coinvolti.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato da un NIH premio Sviluppo Scienziato Clinico K08NS002083, un Shervert Frazier Research Institute Grant, e un NARSAD Young Investigator Award di Edgar A. Buttner.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clozapina | Sigma | C6305 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Acido acetico (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Ipoclorito | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrifuga 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Agitatore | incubatore New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Incubatore a bassa temperatura 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Stereomicroscopio | Olympus | SZX12 | |
| Piastra di Petri 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12 pozzetti Piastra per coltura tissutale | BD Falcon | REF 353043 |
Riferimenti
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