La base di Cell-L-Glutatione Protezione saggi per studiare endocitosi e riciclo dei Plasma proteine ​​di membrana

Summary

Il traffico di membrana comporta il trasporto di proteine dalla membrana plasmatica all'interno della cellula (cioè endocitosi) seguito dal traffico ai lisosomi per la degradazione o alla membrana plasmatica per il riciclaggio. I metodi descritti in questo articolo sono progettati per studiare l'endocitosi e il riciclaggio delle proteine della membrana plasmatica.

Abstract

Il traffico di membrana comporta il trasporto di proteine dalla membrana plasmatica all'interno della cellula (cioè endocitosi) seguito dal traffico ai lisosomi per la degradazione o alla membrana plasmatica per il riciclaggio. I saggi di protezione dell'L-glutatione basati su cellule possono essere utilizzati per studiare l'endocitosi e il riciclo di recettori proteici, canali, trasportatori e molecole di adesione localizzate sulla superficie cellulare. Il test endocitico richiede la marcatura delle proteine della superficie cellulare con una biotina impermeabile alla membrana cellulare contenente un legame disolfuro e l'estere N-idrossisuccinimide (NHS) a 4 ºC, una temperatura alla quale non si verifica il traffico di membrana. L'endocitosi delle proteine biotinilate della membrana plasmatica è indotta dall'incubazione a 37 ºC. Successivamente, la temperatura viene nuovamente abbassata a 4 ºC per fermare il traffico endocitico e il legame disolfuro nella biotina attaccato covalentemente alle proteine che sono rimaste sulla membrana plasmatica viene ridotto con L-glutatione. A questo punto, solo le proteine che sono state endocitose rimangono protette dall'L-glutatione e quindi rimangono biotinilate. Dopo la lisi cellulare, le proteine biotinilate vengono isolate con streptavidina agarosio, eluita dall'agarosio, e la proteina biotinilata di interesse viene rilevata mediante western blotting. Durante il saggio di riciclaggio, dopo la biotinilazione, le cellule vengono incubate a 37 °C per caricare le vescicole endocitiche con proteine biotinilate e il legame disolfuro nella biotina legata in modo covalente alle proteine che rimangono sulla membrana plasmatica viene ridotto con L-glutatione a 4 ºC come nel test endocitico. Successivamente, le cellule vengono nuovamente incubate a 37 °C per consentire alle proteine biotinilate delle vescicole endocitiche di riciclarsi nella membrana plasmatica. Le cellule vengono quindi incubate a 4 ºC e il legame disolfuro nella biotina attaccato alle proteine che si riciclano nelle membrane plasmatiche viene ridotto con L-glutatione. Le proteine biotinilate protette dall'L-glutatione sono quelle che non si sono riciclate nella membrana plasmatica.

Introduction

Tutte le cellule viventi elaborano le informazioni trasportando merci, come ligandi extracellulari, microrganismi, nutrienti, proteine transmembrana e lipidi dalla membrana plasmatica alle vescicole endocitiche (cioè endocitosi). Un processo reciproco chiamato riciclaggio bilancia l'endocitosi e restituisce gran parte della membrana e del carico internalizzati alla superficie cellulare. L'equilibrio tra endocitosi e riciclaggio controlla la composizione della membrana plasmatica e fornisce alle cellule informazioni che sono state risolte nel tempo e nello spazio. L'endocitosi e il riciclo sono regolatori principali di diverse funzioni cellulari come l'assorbimento e il metabolismo dei nutrienti, lo sviluppo, la proliferazione, la differenziazione e la polarità, la riprogrammazione, la migrazione, l'adesione e la migrazione cellulare, la citochinesi e la neurotrasmissione^1-3. Le vie endocitiche e di riciclo sono molto dinamiche e altamente coordinate e consentono alle cellule di girare l'equivalente dell'intera membrana plasmatica da 1 a 5 volte all'ora.

I saggi di protezione dell'L-glutahione basati su cellule sono utili per studiare l'endocitosi e il riciclaggio delle proteine transmembrana, inclusi recettori, canali, trasportatori e molecole di adesione nelle cellule epiteliali e non epiteliali^4-8. In precedenza abbiamo studiato l'endocitosi e il riciclo del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) nelle cellule epiteliali delle vie aeree umane e nelle cellule HEK293^9-15. I saggi basati sulla biotinilazione descritti nel manoscritto sono ottimizzati per l'esame dell'endocitosi e del riciclaggio in cellule epiteliali coltivate in condizioni polarizzanti su supporti di crescita semipermeabili. Questi protocolli possono essere modificati per studiare l'endocitosi e il riciclo delle proteine in cellule epiteliali coltivate in piastre di coltura di tessuti plastici o in cellule non epiteliali. Le figure 1 e 2 contengono esempi di saggi endocitici e di riciclo in cellule epiteliali e non epiteliali.

I test endocitici vengono eseguiti come descritto in precedenza^9-15. Le cellule vengono coltivate su supporti di crescita semipermeabili rivestiti di collagene^11,14. In alternativa, le cellule possono essere coltivate in piastre di coltura di tessuto plastico rivestite di collagene^10,15. Le cellule vengono raffreddate rapidamente a 4 ºC per fermare il traffico di membrana e le proteine della membrana plasmatica vengono marcate a 4 °C con una biotina impermeabile alla membrana cellulare. La biotina reagisce con ε-ammina di residui di lisina e il legame disolfuro è tiolo-scissibile. Dopo la biotinilazione, le cellule vengono incubate a 37 °C per indurre il traffico proteico e caricare le vescicole endocitiche per 2,5, 5,0, 7,5 o 10 minuti. Successivamente, le cellule vengono raffreddate a 4 °C e il legame disolfuro nella biotina attaccato in modo covalente alle proteine della membrana plasmatica viene ridotto con L-glutatione (GSH). A questo punto del protocollo, solo le proteine che sono state endocitose dalla membrana plasmatica sono protette dal GSH e quindi rimangono biotinilate. Le cellule che rimangono a 4 °C dopo la biotinilazione senza incubazione a 37 ºC o il trattamento con GSH servirebbero a determinare la quantità di CFTR biotinilato al tempo zero. Le cellule che rimangono a 4 °C dopo la biotinilazione senza incubazione a 37 ºC ma con trattamento con GSH servirebbero a determinare l'efficienza della riduzione dei legami disolfuro. A seguito dei trattamenti sopra descritti, le cellule vengono lisate, le proteine biotinilate vengono isolate mediante streptavidina agarosio, eluite in tampone campione SDS e separate mediante SDS-PAGE. La proteina di interesse viene rilevata nei campioni biotinilati mediante western blotting. La quantità di proteina biotinilata a 4 ºC al tempo zero (senza il riscaldamento a 37 ºC) è considerata del 100%. La quantità di proteine che rimangono biotinilate dopo il trattamento con GSH a 4 ºC è considerata di fondo e viene sottratta dalla quantità di proteine che rimangono biotinilate dopo il riscaldamento a 37 ºC in diversi punti temporali. L'endocitosi proteica viene calcolata dopo aver sottratto il fondo ed è espressa come percentuale di proteina biotinilata in ogni punto temporale dopo il riscaldamento a 37 ºC rispetto alla quantità di proteina biotinilata presente al tempo zero.

I saggi di riciclaggio vengono eseguiti come descritto in precedenza^11,16. Le cellule vengono coltivate su supporti di crescita semipermeabili rivestiti di collagene¹¹. In alternativa, le cellule possono essere coltivate su piastre di coltura di tessuti plastici rivestiti di collagene¹³. Le cellule vengono riscaldate a 37 °C dopo la biotinilazione per caricare le vescicole endocitiche con proteine biotinilate. Il tempo di prima incubazione a 37 ºC è determinato dal tempo in cui l'endocitosi della proteina di interesse raggiunge il massimo durante l'aumento lineare del segnale endocitico. Il tempo è specifico della proteina e può dipendere dal tipo di cellula e dalle condizioni della coltura cellulare. Nella nostra esperienza, l'endocitosi CFTR ha raggiunto il massimo a 5,0 o 7,5 minuti^13,14 (Figure 1 e 2). Successivamente, le cellule vengono raffreddate immediatamente a 4 °C e il legame disolfuro nella biotina attaccato alle proteine della membrana plasmatica viene ridotto con GSH. Successivamente, le cellule vengono lisate per determinare la quantità di proteina endocitosa di interesse o riscaldate nuovamente a 37 °C per diversi periodi di tempo per consentire il riciclo della proteina biotinilata endocitosa di interesse nella membrana plasmatica. Le cellule vengono quindi nuovamente raffreddate a 4 °C e il legame disolfuro sulla biotina attaccato alle proteine riciclate nelle membrane plasmatiche viene ridotto con GSH. Il riciclo della proteina di interesse è determinato dalla differenza tra la quantità di proteina biotinilata dopo il primo e il secondo trattamento con GSH.

La fattibilità dei test endocitici e di riciclaggio dipende da diversi fattori. In primo luogo, la formazione di monostrati cellulari è un prerequisito e le cellule che non formano un monostrato o crescono come multistrati non sono adatte per i saggi descritti in questo manoscritto. In secondo luogo, l'abbondanza della proteina di interesse sulla superficie cellulare e la presenza di un anticorpo per rilevare la proteina mediante western blotting sono fondamentali. Si raccomanda che l'abbondanza allo stato stazionario della proteina sia prima determinata nei lisati a cellule intere (WCL). In terzo luogo, dovrebbe essere testata la capacità di biotinilare la proteina specifica della superficie cellulare. La biotina si attacca ai residui di lisina. Pertanto, l'efficienza della biotinilazione dipende in parte dal numero di residui di lisina nel dominio extracellulare della proteina. Di conseguenza, si raccomanda lo screening della sequenza proteica per determinare se i residui di lisina sono presenti nei domini extracellulari. Non tutti i residui di lisina del dominio extracellulare possono essere ugualmente accessibili alla biotina a causa del ripiegamento delle proteine. Pertanto, la biotinilazione delle proteine allo stato stazionario seguita da western blotting dovrebbe essere eseguita non solo per determinare l'abbondanza allo stato stazionario della proteina sulla superficie cellulare, ma anche per esaminare la fattibilità dei saggi basati sulla biotinilazione per la proteina di interesse.

Questo protocollo è ottimizzato per l'esame dell'endocitosi e del riciclaggio di CFTR wild type in cellule epiteliali delle vie aeree umane CFBE41o- coltivate su supporti di crescita semipermeabili da 24 mm in interfaccia aria-liquido^9,10,13-15. CFTR si polarizza nel dominio della membrana apicale; Pertanto, il protocollo descrive la biotinilazione del dominio della membrana apicale. La biotinilazione del dominio della membrana basolaterale sarà necessaria per studiare l'endocitosi e il riciclo delle proteine polarizzanti sulla membrana basolaterale. Il protocollo di dosaggio endocitico descritto in questo manoscritto ha 6 condizioni: solo biotinilato (BT = tempo zero; campione a); Controllo GSH (GSH; campione b); e i punti temporali endocitici di 2,5, 5,0, 7,5 o 10 minuti (campioni c; Tabella 1). Il numero e/o la lunghezza dei punti temporali endocitici nel protocollo possono essere modificati secondo necessità.

Il saggio di riciclaggio viene eseguito dopo aver determinato il punto temporale in cui l'endocitosi della proteina di interesse raggiunge il massimo durante l'aumento lineare del segnale endocitico. Questo punto temporale verrà utilizzato per caricare le vescicole endocitiche con la proteina di interesse prima di indurre il riciclaggio. Il tempo dipende dalle proteine e può differire tra i tipi di cellule e le condizioni di coltura¹⁵. Abbiamo precedentemente stabilito che l'endocitosi CFTR ha raggiunto il plateau al punto temporale di 7,5 minuti nelle cellule epiteliali delle vie aeree umane CFBE41o- che esprimono stabilmente CFTR¹⁵. Al contrario, l'endocitosi CFTR ha raggiunto il plateau al punto temporale di 5,0 minuti nelle cellule HEK293 che esprimono stabilmente CFTR¹³. Il protocollo del saggio di riciclaggio descritto in questo manoscritto ha 5 condizioni: solo biotinilato (BT = tempo zero; campione a); Controllo GSH (GSH; campione b); 5,0 minuti di endocitosi (Endo; campione c), 5,0 minuti di endocitosi seguiti dai punti di tempo di riciclo di 2,5 o 5,0 minuti (Rec; campioni d; Tabella 2). Il numero e/o la durata dei punti temporali di riciclaggio nel protocollo possono essere modificati secondo necessità.

Protocol

1. Semina delle cellule

1. Pretrattare i filtri da 24 mm con il 10% di collagene I (preparare il 10% di collagene I in Minimal Essential Medium (MEM), coprire l'intera superficie del filtro con la soluzione di collagene, incubare sotto la luce UV a temperatura ambiente per 30 minuti e in un incubatore per colture cellulari a 37 ºC per 1 ora, aspirando il collagene in eccesso dopo l'incubazione).
2. Preparare il terreno di coltura cellulare (MEM gassato con CO₂ per 20 minuti, 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 U/ml di penicillina, 50 U/ml di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 0,5 μg/ml di puromicina)
3. Semina le cellule CFBE41o- su sei filtri da 24 mm per l'endocitosi e il riciclaggio, rispettivamente, a 1 x 10⁶/filtro.
4. Rimuovere il terreno apicale il giorno dopo la semina e somministrare quotidianamente solo dal lato basolaterale.
5. Somministrare con terreno antibiotico negativo di selezione 24 ore prima dell'esperimento. Eseguire l'esperimento in cellule CFBE41o- 6-10 giorni dopo la semina.

2. Preparativi prima dell'esperimento (simile per il test di endocitosi e riciclaggio)

1. Allestisci uno spazio per la panca nella cella frigorifera. I test endocitici e di riciclaggio devono essere eseguiti nella cella frigorifera, ad eccezione dell'incubazione a 37 °C. Le piastre contenenti i filtri da 24 mm devono essere posizionate direttamente sul piano di lavoro della cella frigorifera.
2. Accendere l'incubatrice a 37 ºC.
3. Preparare 500 ml di PBS++, pH 8,2 (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1 mM di cloruro di magnesio e 0,1 mM di cloruro di calcio, pH 8,2) e conservare 250 ml a 37 °C in un incubatore e 250 ml a 4 °C in cella frigorifera.
4. Riempire i pozzetti in una piastra a 6 pozzetti con PBS++, pH 8,2, 37 °C e conservare nell'incubatore a 37 °C.
5. Riempire i pozzetti in un'altra piastra a 6 pozzetti con PBS++, pH 8,2, 4 °C e conservare in cella frigorifera a 4 °C.
6. Preparare 100 ml di PBS++, pH 8,6 a 4 °C e conservare in cella frigorifera.
7. Preparare la biotina contenente il legame disolfuro e l'estere NHS ad una concentrazione di 0,8 mg/ml in PBS++, pH 8,2, 4 °C entro 30 minuti dalla fase di biotinilazione (il volume del tampone biotina deve coprire completamente l'intera superficie del filtro); si consiglia un filtro da 1,5 ml/24 mm.
8. Preparare 100 ml di tampone GSH in acqua, pH 8,6 e raffreddare a 4 ºC (75 mM di cloruro di sodio, 1 mM di cloruro di magnesio e 0,1 mM di cloruro di calcio, 50 mM di GSH, 80 mM di idrossido di sodio e 10% di FBS). Il GSH e l'idrossido di sodio devono essere aggiunti appena prima dell'esperimento. Controllare il pH e regolare a 8,6; L'idrossido di sodio neutralizza i gruppi carbossilici e deprotona metà dei residui di cisteina in glutatione. È fortemente tamponato al pKa di questa cisteina, che è 8,6⁴. (Preparare lo stesso volume di tampone GSH per il saggio di riciclaggio).
9. Preparare 50 ml di tampone di lisi, pH 8,2 e mantenere a 4 °C (25 mM HEPES, pH 8,2, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glicerolo); aggiungere il cocktail completo di inibitori della proteasi per 50 ml di tampone di lisi e raffreddare a 4 ºC; controllare il pH dopo aver aggiunto Complete poiché potrebbe verificarsi un calo del pH.
10. Preparare il tampone del campione Laemli con 100 mM DTT.
11. Preparare 1x Running Buffer (100 ml di 10x Running Buffer, 900 ml di acqua).
12. Preparare 1x Tampone di trasferimento e raffreddare a 4 ºC (100 ml di 10x Tampone di trasferimento senza dodecil solfato di sodio (SDS), 200 ml di metanolo, 700 ml di acqua).

3. Saggio endocitico

CFTR polarizza al dominio della membrana apicale; quindi, il protocollo descrive la biotinilazione del dominio della membrana apicale. La biotinilazione del dominio della membrana basolaterale sarà necessaria per studiare l'endocitosi delle proteine che si polarizzano sulla membrana basolaterale.
Flusso di lavoro: Biotinilazione delle proteine della superficie cellulare a 4 ºC → Riscaldamento a 37 ºC per caricare le vescicole endocitiche con proteine biotinilate → Raffreddamento a 4 ºC per fermare il traffico endocitario → Riduzione del legame disolfuro nella biotina legata alle proteine che sono rimaste sulla superficie cellulare → Lisi cellulare → Isolamento di biotinilati (es. proteine endocitose) con streptavidina agarosio → Eluizione di proteine biotinilate da streptavidina agarosio → Elettroforesi proteica e western blotting.

1. Prelevare la piastra contenente sei filtri da 24 mm (Tabella 1: campioni a-c) dall'incubatore per colture cellulari e trasferirla rapidamente nella piastra riempita con PBS++ freddo (4 ºC), pH 8,2 su ghiaccio.
2. Lascia che PBS++ trabocchi dalla superficie apicale per coprire rapidamente l'intera superficie. Portare il piatto con ghiaccio nella cella frigorifera e posizionarlo sul piano di lavoro.
3. Rimuovi rapidamente PBS++ capovolgendo la piastra, tenendo i filtri in posizione per evitare che cadano. Aggiungere ~2 ml di PBS++ sul lato apicale e basolaterale.
4. Lavare i filtri con ~2 ml di PBS++ freddo, pH 8,2 3x per 2 min. Aspirare il lavaggio da un lato alla volta, apicale o basolaterale e aggiungere PBS++ fresco, pH 8,2 su un lato alla volta.
5. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere 1 ml di PBS++, pH 8,2 sul lato basolaterale. Aggiungere 1,5 ml di tampone biotina sul lato apicale e incubare al buio per 30 minuti. Evitare di rovesciare i tamponi sul lato controlaterale.
6. Aspirare il tampone biotina dal lato apicale e lavare con PBS++, pH 8,2 3x per 2 min.
7. Mettere da parte in un'altra piastra due filtri (Tabella 1: campioni a e b), aggiungere ~2 ml di PBS++, pH 8.2 sul lato apicale e basolaterale e conservare in cella frigorifera. Conservare i restanti 4 filtri in una piastra (Tabella 1: campioni c) e aggiungere ~2 ml di PBS++ pH 8.2 sul lato apicale e basolaterale di ciascun filtro. Posizionare la piastra sul ghiaccio e portarla sul piano di lavoro accanto all'incubatrice a 37 ºC.
8. Trasferire rapidamente i filtri dal ghiaccio alla piastra nell'incubatore a 37 ºC riempito con PBS++ pH 8.2 preriscaldato e incubare un filtro ciascuno con precisione per 2,5, 5,0, 7,5 o 10 minuti coprendo l'intera superficie di ciascun filtro con PBS++ pH 8.2 caldo.
9. Durante l'incubazione, riempire completamente quattro pozzetti della piastra con ghiaccio con pH PBS++ freddo (4 ºC) 8,2.
10. Dopo il tempo di incubazione indicato, capovolgere ciascun filtro per drenare il PBS++ caldo (37 ºC), pH 8.2 e trasferire sulla piastra con ghiaccio. Aggiungere PBS++ freddo, pH 8.2 per traboccare dal lato apicale e coprire rapidamente l'intera superficie di ciascun filtro.
11. Dopo aver trasferito i filtri nel ghiaccio, portare la piastra nella cella frigorifera e posizionarla sul piano di lavoro.
12. Aspirare PBS++ da entrambi i lati in tutti i filtri (campioni a-c) e riempire il lato basolaterale con 1 ml di PBS++ pH 8.6. Aggiungere 1,5 ml di PBS++, pH 8,6 sul lato apicale del filtro a (Tabella 1: campione a).
13. Ridurre il legame disolfuro nella biotina attaccato alle proteine della membrana apicale con il tampone GSH (pH 8,6) nei filtri b e c (Tabella 1: campione b e c).
14. Aggiungere 1,5 ml di tampone GSH sul lato apicale, incubare per 15 minuti e ripetere sei volte.
15. Conservare 1 ml di PBS++ pH 8.6 sul lato basolaterale. Evitare di rovesciare il tampone sul lato basolaterale.
16. Dopo aver completato la procedura 3.15, lavare brevemente tutti i filtri (Tabella 1: campioni a, b e c) con PBS++ pH 8.2 2x, aspirare il lavaggio dal lato apicale e basolaterale e impostare la piastra con i filtri a un angolo di 45° per drenare nuovamente tutto il lavaggio e l'aspirazione.
17. Posizionare la piastra in piano sul banco di lavoro e aggiungere 500 μl di tampone di lisi sul lato apicale di ciascun filtro e incubare in cella frigorifera agitando per 15 minuti.
18. Raschiare le cellule con un poliziotto di gomma e raccoglierle in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
19. Centrifugare a 14.000 x g per 10 min a 4 °C.
20. Trasferire i surnatanti in provette fresche da 1,5 ml ed eliminare i pellet. I surnatanti sono ora chiamati lisati a cellule intere (WCL).
21. Aggiungere 100 μl di tampone per campioni Laemli con DTT a 50 μl di WCL (10% dell'intero WCL) e incubare a 37 °C per 30 minuti (campioni WCL).
22. Preparare 200 μl di aliquote di streptavidina agarosio al 50% e rimuovere tutto il tampone di lavaggio con un ago da 27 G collegato a un'aspirazione: lavare 2 volte con 1 ml di PBS, perle di pellet con centrifuga a impulsi tra i lavaggi; lavare una volta con 1 ml di tampone di lisi per equilibrare prima di aggiungere WCL; aspirare asciugare l'agarosio prima di aggiungere WCL.
23. Incubare il WCL rimanente con streptavidina agarosio lavata (portare il volume a 1,2 ml con tampone di lisi e ruotare al buio per almeno 2 ore o O/N nella cella frigorifera).
24. Lavare tre volte i complessi proteici streptavidina agarosio-biotinilata con 1 ml di tampone di lisi (il tampone di lisi non deve contenere Complete durante il lavaggio), centrifugare l'agarosio a impulsi tra un lavaggio e l'altro e aspirare a secco dopo l'ultimo lavaggio.
25. Incubare i complessi proteici streptavidina agarosio-biotinilata con 65 μl di tampone campione di Laemli con DTT a 85 °C per 5 minuti.
26. Pulse, spin e raccogli i complessi proteici biotinilati eluiti.
27. Caricare il 7,5% dei gel con 40 μl di campioni WCL e l'intero volume dei campioni biotinilati (BT) per pozzetto.
28. Far funzionare i gel a 120 V in SDS contenente il buffer di corsa.
29. Trasferire le proteine su una membrana in PVDF a 90-95 V per 1,5 ore (fino a <400 A) in un tampone di trasferimento senza SDS.
30. Bloccare il latte scremato al 5% in TBS-T 0,1% O/N. Tamponare entrambe le membrane con l'anticorpo monoclonale di topo anti-CFTR CFF596 e un anticorpo secondario coniugato HRP anti-topo di capra.
31. Eseguire la chemiluminescenza. Ritamponare entrambe le membrane con anticorpi anti-ezrin o anti-actina.

4. Saggio di riciclaggio

Flusso di lavoro: Biotinilazione delle proteine della superficie cellulare a 4 ºC → Riscaldamento a 37 ºC per caricare le vescicole endocitiche con proteine biotinilate → Raffreddamento a 4 ºC per fermare il traffico endocitario → Riduzione del legame disolfuro nella biotina attaccato alle proteine che sono rimaste sulla superficie cellulare → Riscaldamento a 37 °C per consentire alle proteine biotinilate dalle vescicole endocitiche di riciclarsi sulla superficie cellulare → Raffreddamento a 4 ºC per fermare il traffico endocitario → Riduzione del legame disolfuro nella biotina legata alle proteine che si sono riciclate sulla superficie cellulare → Lisi cellulare → Isolamento di proteine biotinilate (cioè quelle che non sono state riciclate) con streptavidina agarosio → Eluizione di proteine biotinilate da streptavidina agarosio → Elettroforesi proteica e western blotting.

1. Biotinilare le proteine della superficie apicale in cinque filtri da 24 mm (Tabella 2: campioni a-d) seguendo la procedura descritta nel saggio endocitico (sezione 3.1-3.6).
2. Nella cella frigorifera, inserire in una nuova piastra due filtri (Tabella 2: campioni a e b), aggiungere ~2 ml di PBS++, pH 8.2 sul lato apicale e basolaterale e conservare in cella frigorifera.
3. Conservare i restanti 3 filtri in una piastra (Tabella 2: campioni c e d) con ~2 ml di PBS++ pH 8.2 sul lato apicale e basolaterale di ciascun filtro. Posizionare la piastra con i filtri c e d sul ghiaccio e portare sul banco all'esterno dell'incubatrice a 37 ºC.
4. Trasferire rapidamente i filtri dalla piastra con ghiaccio alla piastra riempita con PBS++ pH 8.2 preriscaldato nell'incubatore e conservare per 5.0 min.
5. Durante l'incubazione, riempire 3 pozzetti della piastra con ghiaccio con pH PBS++ freddo (4 ºC) 8.2.
6. Trasferire i filtri dopo 5,0 minuti di incubazione a 37 ºC sulla piastra su ghiaccio. Lascia che il pH PBS++ freddo 8.2 trabocchi dal lato apicale e copra rapidamente l'intera superficie di ciascun filtro.
7. Portare il piatto con ghiaccio nella cella frigorifera e posizionarlo sul piano di lavoro.
8. Aspirare PBS++ pH 8.2 da entrambi i lati dei filtri a, b, c e d e aggiungere 1 ml di PBS++ pH 8.6 sul lato basolaterale.
9. Tenere i filtri a e b separati dai filtri c e d. Aggiungere 1 ml di PBS++ pH 8.6 sul lato apicale dei filtri a e b.
10. Ridurre il legame disolfuro nella biotina che rimane sulla superficie cellulare nei filtri b, c e d seguendo la procedura descritta nel test endocitico (fasi 3.13-3.15).
11. Lavare brevemente i filtri b, c e d con PBS++ pH 8.2 2x e sostituirli con PBS++ fresco, pH 8.2. Posizionare i filtri d in una nuova piastra e portare il ghiaccio sul piano di lavoro all'esterno dell'incubatore a 37 ºC.
12. Trasferire rapidamente i filtri dalla piastra su ghiaccio alla piastra nell'incubatore riempito con PBS++ pH 8.2 preriscaldato e incubare un filtro ciascuno con precisione per 2,5 o 5,0 minuti come descritto sopra nei passaggi 4.4-4.9.
13. Ridurre il legame disolfuro nella biotina attaccato alle proteine della membrana apicale con il tampone GSH dopo la seconda incubazione a 37 ºC nei filtri d come descritto in 4.4 con l'eccezione che durante questa fase verranno effettuate solo tre incubazioni di 15 minuti con il tampone GSH. Durante questa fase, mantenere i filtri a, b e c in PBS++ pH 8.6 sul lato apicale e basolaterale.
14. Per la lisi cellulare e il Western blotting seguire le procedure descritte nel test endocitico (fasi 3.16-3.31).

Results

L'endocitosi CFTR è stata studiata in cellule CFBE41o- coltivate su filtri rivestiti di collagene (Figura 1). Il CFTR biotinilato è stato visualizzato mediante western blotting con anticorpo monoclonale di topo, clone 596 e un anticorpo anti-perossidasi di rafano di topo utilizzando il sistema di rilevamento del western blotting seguito da chemiluminesenza. La quantificazione del CFTR biotinilato è stata eseguita mediante densitometria utilizzando esposizioni all'interno dell'intervallo dinamico lineare del film. L'endocitosi CFTR è stata calcolata dopo aver sottratto il fondo ed è stata espressa come percentuale di CFTR biotinilato in ogni momento dopo il riscaldamento a 37 ºC rispetto alla quantità di CFTR biotinilato presente al tempo zero (Figure 1A e 1B). L'endocitosi CFTR è stata lineare tra 0-7,5 minuti. Gli esperimenti in cui il CFTR di fondo era del >10% sono stati esclusi a causa di un trattamento inefficiente con GSH (Figura 1D).

Il riciclaggio del CFTR è stato studiato in cellule HEK293 coltivate in piastre di coltura tissutale rivestite di collagene (Figura 2). L'endocitosi CFTR è risultata lineare tra 0,0 e 5,0 minuti e ha raggiunto il massimo al punto temporale di 5,0 minuti (Figura 2A), quindi le cellule sono state incubate a 37 ºC per 5,0 minuti per caricare le vescicole endocitiche con proteine biotinilate tra cui CFTR (Figure 2B e 2C). Il riciclo del CFTR endocitoso è stato calcolato come la differenza tra la quantità di CFTR biotinilato dopo il primo e il secondo trattamento con GSH.

Tabella 1. Saggi endocitici.

Endocitosi	Bt	GSH	Endo-2.5	Endo-5.0	Endo-7.5	Endo-10.0
Campione	a	b	c2.5	c5.0	c7.5	c10.0
Biotina	+	+	+	+	+	+
37 ºC	(-)	(-)	2.5 min	5.0 min	7.5 min	10 min
GSH	(-)	+	+	+	+	+

Tabella 2. Saggio di riciclaggio.

riciclaggio	Bt	GSH	Endo-5	Rec-2.5	Rec-5.0
Campione	a	b	c	d2.5	d5.0
Biotina	+	+	+	+	+
1st 37 ºC	(-)	(-)	5 min	5 min	5 min
1st GSH	(-)	(-)	+	+	+
2nd 37 ºC	(-)	(-)	+	+	+
2nd GSH	(-)	(-)	(-)	2.5 min	5 min

Figura 1. Riassunto dei saggi endocitici eseguiti per determinare l'endocitosi CFTR nelle cellule CFBE41o-. Le cellule sono state coltivate su filtri rivestiti di collagene. Western blot rappresentativi (A), valori rappresentativi di densitometria (B) e sintesi degli esperimenti (C) che dimostrano l'endocitosi CFTR in funzione del tempo. La biotinilazione selettiva della superficie cellulare e il western blotting sono stati utilizzati per determinare l'abbondanza di CFTR della membrana plasmatica. L'abbondanza proteica è stata quantificata mediante densitometria utilizzando esposizioni all'interno dell'intervallo dinamico lineare del film. Al tempo zero, la quantità di CFTR biotinilato (BT) è stata considerata del 100% (Tabella 1: campione a). Al tempo zero, la quantità di BT CFTR rimanente dopo il trattamento con GSH è stata considerata un fondo CFTR (campione b; si prega di notare che si tratta di un fondo diverso da quello sottratto da tutti i campioni, come mostrato nella Figura 1B). Il CFTR di fondo era del 6,7 ± 0,9% (media ± S.E.M.) negli esperimenti inclusi per l'analisi. Il CFTR di fondo è stato sottratto dal CFTR BT dopo il riscaldamento di 2,5, 5,0, 7,5 o 10 minuti a 37 ºC (campioni c meno campione b). L'endocitosi CFTR è stata espressa come la percentuale di CFTR che rimane biotinilata nei punti temporali di 2,5, 5,0, 7,5 o 10 minuti dopo aver sottratto il CFTR di fondo. L'endocitosi CFTR è risultata lineare tra zero e 7,5 minuti. L'abbondanza di Ezrin nell'intero lisato cellulare (WCL) è stata utilizzata come controllo del carico. 4 esperimenti/gruppo. Gli esperimenti in cui il CFTR di fondo era del >10% sono stati esclusi a causa di un trattamento inefficiente con GSH (D). La quantità di CFTR biotinilato nel controllo GSH (campione b) nell'esperimento escluso era del 14,5%.

Figura 2. Riassunto dei saggi endocitici e di riciclo eseguiti in cellule HEK293 che esprimono stabilmente CFTR. Le cellule sono state coltivate in piastre di coltura tissutale rivestite di collagene. Riassunto dei dati che dimostrano che l'endocitosi CFTR era lineare tra 0-5 min (A). Pertanto, nei saggi di riciclaggio, le vescicole endocitiche sono state caricate con proteine biotinilate (BT), tra cui CFTR, riscaldandosi a 37 ºC per 5 minuti. L'abbondanza proteica è stata quantificata mediante densitometria utilizzando esposizioni all'interno dell'intervallo dinamico lineare del film. Western blot rappresentativo (B), valori rappresentativi della densitometria (C) e sintesi degli esperimenti (D) che dimostrano il riciclo del CFTR in funzione del tempo. Al tempo zero, la quantità di BT CFTR è stata considerata al 100% (Tabella 2: campione a). Al tempo zero, la quantità di BT CFTR rimanente dopo il trattamento con GSH è stata considerata un fondo CFTR (campione b; si prega di notare che questo è un fondo diverso da quello sottratto da tutti i campioni come mostrato in C). Gli esperimenti in cui il CFTR di fondo era del >10% sono stati esclusi a causa di un trattamento inefficiente del GSH. Le vescicole endocitiche sono state caricate con proteine BT, tra cui CFTR, mediante incubazione a 37 ºC per 5 minuti, seguita dal trattamento con GSH per scindere la biotina dalle proteine rimaste sulla membrana plasmatica (campioni c e d). La quantità di BT CFTR dopo il riscaldamento di 5 minuti a 37 ºC seguito dal trattamento con GSH rappresenta CFTR endocitoso (campione c). Dopo il riscaldamento di 5 minuti a 37 ºC e il primo trattamento con GSH, le cellule sono state riscaldate nuovamente a 37 ºC per 2,5 o 5,0 minuti per consentire alle proteine endocitose di riciclarsi nella membrana plasmatica e la biotina sul CFTR riciclato è stata ridotta dal secondo trattamento con GSH (campioni d). A questo punto solo il CFTR che non si è riciclato dagli endosomi alla membrana plasmatica è rimasto biotinilato (campioni d). Il riciclo del CFTR è stato calcolato come la differenza tra il BT CFTR dopo il primo trattamento con GSH (campione c) e il secondo trattamento con GSH a 2,5 e 5,0 minuti (campioni d) ed è stato espresso come percentuale di CFTR endocitosizzato. Il riciclo CFTR è stato rapido e ha raggiunto il massimo di 2,5 minuti. L'abbondanza di Ezrin nell'intero lisato cellulare (WCL) è stata utilizzata come controllo del carico. 3 esperimenti/gruppo.

Discussion

Il successo dei test endocitici e di riciclo dipende dall'efficiente biotinilazione del CFTR sulla membrana plasmatica. La biotina deve essere preparata immediatamente prima dell'uso perché la porzione di estere NHS si idrolizza facilmente e diventa non reattiva. Inoltre, la fase di biotinilazione richiede un rigoroso controllo della temperatura a 4 ºC per fermare il traffico proteico. Se la temperatura viene aumentata durante la fase di biotinilazione al di sopra di 4 ºC, può verificarsi un traffico proteico con conseguente biotinilazione di quantità variabili di CFTR.

Il successo dei test endocitici e di riciclo dipende anche da un'efficiente riduzione del legame disolfuro nel CFTR biotinilato che rimane sulla membrana plasmatica. La quantità di CFTR che rimane biotinilato dopo il trattamento con GSH dovrebbe essere pari al <10% del CFTR biotinilato totale al tempo zero. Devono essere esclusi gli esperimenti in cui la quantità di CFTR biotinilato è del >10% nel campione di controllo GSH. La Figura 1D mostra l'esperimento "fallito" in cui la quantità di CFTR biotinilato nel controllo GSH era del 14,5%. Un'insufficiente riduzione del legame disolfuro nel CFTR biotinilato può essere secondaria a uno scarso controllo della temperatura durante l'esperimento. Se la temperatura viene aumentata durante il trattamento con GSH al di sopra di 4 ºC, può verificarsi un traffico proteico e il CFTR biotinilato endocitoizzato a seguito dell'aumento involontario della temperatura aumenterà il CFTR di fondo. In alternativa, un'insufficiente riduzione del legame disolfuro nel CFTR biotinilato può derivare da una ridotta emivita del GSH in soluzione acquosa causata dall'ossidazione nell'aria o da un pH inappropriato. Come precedentemente determinato, il GSH rimane fortemente tamponato a pH 8,6⁴. Nella nostra esperienza, sei trattamenti di 15 minuti con il tampone GSH hanno ridotto il legame disolfuro di oltre il 90%, in modo più efficiente rispetto a un trattamento di 90 minuti.

La coltura cellulare richiede un'attenzione particolare. La biotina deve raggiungere il dominio della membrana plasmatica nelle cellule intatte dove è espressa la proteina di interesse. Abbiamo utilizzato i saggi endocitici e di riciclo basati sulla biotinilazione per studiare l'endocitosi e il riciclo di CFTR espresso nel dominio della membrana apicale. Questi saggi possono essere utilizzati anche per studiare il traffico endocitico di proteine localizzate nel dominio basolaterale della membrana in cellule coltivate su supporti di crescita semipermeabili. Le cellule epiteliali che formano multistrati non sono adatte per questi saggi poiché i tamponi di biotina e GSH raggiungeranno solo lo strato superiore delle cellule per rilevare le proteine della membrana apicale o lo strato inferiore per rilevare le proteine della membrana basale. Le cellule epiteliali coltivate su plastica possono essere più inclini al lavaggio durante i saggi. La perdita casuale di cellule durante l'esperimento comprometterà i risultati. Si consiglia di esaminare periodicamente l'integrità del monostrato al microscopio negli esperimenti in cui le cellule vengono coltivate in piastre di coltura di tessuti plastici. Il rivestimento di piastre di coltura tissutale con collagene può aumentare l'aderenza cellulare.

I campioni di proteine biotinilate devono essere sottoposti a test di routine per verificare la presenza di contaminazioni con proteine intracellulari. Il rilevamento di proteine intracellulari nei campioni di proteine biotinilate può indicare un lavaggio insufficiente dei complessi proteici streptavidina agarosio-biotinilati dopo l'incubazione con WCL. Pertanto, il primo passo è aumentare l'efficienza di lavaggio. Inoltre, la presenza di cellule con integrità della membrana plasmatica compromessa consentirà l'accesso della biotina alle proteine intracellulari. Il western blotting per una proteina espressa esclusivamente in un compartimento intracellulare come il reticolo endoplasmatico potrebbe essere utilizzato per rilevare la biotinilazione delle proteine intracellulari. In alternativa, le proteine del citoscheletro come l'actina o l'ezrina possono essere utilizzate per testare la contaminazione dei campioni di proteine biotinilate con proteine intracellulari. Le proteine del citoscheletro possono formare complessi con le proteine transmembrana e piccole quantità di proteine del citoscheletro possono essere rilevate nei campioni di proteine biotinilate. Tuttavia, nella nostra esperienza, il rapporto tra ezrin biotinilato/WCL o actina è <1:1.000 e quindi queste proteine sono adatte per la determinazione dell'integrità della membrana cellulare nei saggi basati sulla biotinilazione.

La reazione di biotinilazione può essere spenta con glicina o Tris per rimuovere il reagente di biotinilazione non reagito come precedentemente riportato¹⁷. Inoltre, il GSH può essere spento con iodoacetammide⁶. Nella nostra esperienza, il reagente di biotinilazione non reagito e il GSH possono essere rimossi in modo efficiente mediante lavaggio delicato con PBS++ senza l'uso di reagenti di tempra.

La scelta tra streptavidina e neutrovidina agarosio per isolare i complessi proteici biotinilati deve essere determinata caso per caso. Nella nostra esperienza, l'agarosio di streptavidina fornisce un isolamento efficiente dei complessi proteici biotinilati con un legame minimo di proteine non biotinilate, a differenza dell'agarosio di neutravidina dove il legame aspecifico avviene a livelli che interferiscono con i risultati del saggio (osservazione non pubblicata).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFBE41o- riferimento cellule			10,11,13,14,15
HEK293 referenza cellule			13
Medium essenziale minimo (MEM)	Gibco	11095
L-Glutammina	Cellgro	25-005-CL
Penicillina	Sigma	P0781
Streptomicina
Puromicina	InvivoGen	ant-pr-1
PureCol  Collagene bovino  Soluzione  Tipo I
s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	14190
Cloruro di calcio	Sigma	C3306
Cloruro di magnesio	Sigma	M2670
Cloruro di sodio	Sigma	S3014
EZLink Sulfo-NHS-SS-Biotina	Pierce	21331
L-Glutatione ridotto (GSH)	Sigma	G6529
Resina di streptavidina-agarosio	Thermo Fisher	20353
Idrossido di sodio	Sigma	224165
Siero fetale bovino	Gemini Bioscience	100-106
Milli-Q acqua	Millipore	Advantage System
HEPES	Sigma	H3375
Triton X-100	Bio Rad	161-0407
Glicerolo	FisherScientific	G33
Laemli Tampone per campioni	BioRad	161-0737
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	646563
Proteasi Completa  Cocktail inibitore	Roche	1697498
Perle di streptavidina	Thermo Scientific	20353
Chemiluminescenza	Perkin Elmer	NEL104001EA
Reagenti
Latte secco scremato	Garofano	N/A
Tween-20	BioRad	170-6539
Soluzione salina tamponata tris (TBS)	BioRad	170-6435
Albumina sierica bovina (BSA)	Gibco	15120
Primaria e secondaria
Anticorpi per Western Blotting
Topo monoclonale Anti-CFTR 596	Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc., Chapel Hill, NC
Anti-ezrin
Buffer di funzionamento 10x	BioRad	161-0772
Buffer di trasferimento 10x ( senza SDS)	BioRad	161-0771
Metanolo	Fisher	A4129
Contatore di coultri	Beckman Coulter	Z1Coulter Contatore di particelle Cella
standard  Attrezzature per colture
Cappa per colture cellulari con luce
Palloni
Filtri Transwell-24mm	Corning	3412
Piastre per colture cellulari da 4 cm Misuratore
pH Provette
coniche da 15 ml e 50 mlTubi
Poliziotto
di gomma Cella
Secchielli per ghiaccio e ghiaccio
27 G aghi
37 º C Incubatore
Termometro
Centrifuga
Centrifuga
Apparecchiature
Sviluppatore
Film	GE Amersham	28-9068-36
Membrana	PVDFMillipore	IPVH00010
software ImageJ	NIH