Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.
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Articolo metodologico
Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine svolgono compiti cruciali negli organismi esercitando funzioni suscitate dalle loro specifiche pieghe tridimensionali. Sebbene le strutture native dei polipeptidi soddisfino molti scopi, è ormai riconosciuto che la maggior parte delle proteine può adottare un assemblaggio alternativo di amiloide ricca di beta-fogli. Le fibrille amiloidi insolubili sono inizialmente associate a molteplici disturbi umani, ma si dimostrano sempre più come attori funzionali che partecipano a vari importanti processi cellulari. Inoltre, l'amiloide depositata nei tessuti dei pazienti contiene componenti non proteici, come acidi nucleici e glicosaminoglicani (GAG). Questi cofattori possono facilitare la formazione di amiloide, con conseguente generazione di diversi tipi di precipitati insolubili. Sfruttando la nostra comprensione di come le proteine si ripiegano in modo errato attraverso uno stadio intermedio del precursore dell'amiloide solubile, abbiamo ideato un metodo per convertire le proteine native in fibrille amiloidi in vitro. Questo approccio consente di preparare amiloide in grandi quantità, esaminare le proprietà dell'amiloide generata da proteine specifiche e valutare i cambiamenti strutturali che accompagnano la conversione.
Introduzione
Le proteine sono le macromolecole biologiche più abbondanti presenti in tutti i tipi di cellule. Si presentano in una grande varietà di dimensioni, strutture e modificazioni post-traduzionali e svolgono un'enorme gamma di importanti funzioni biologiche quando si trovano nelle loro forme native. Più di due dozzine di polipeptidi aberranti sono stati implicati in numerose condizioni patologiche umane, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e il diabete di tipo 21-4. Le proteine terminali mal ripiegate accumulano come fibrille amiloidi gli aggregati stabili insolubili che si verificano extracellulare o intracellulare.
Nonostante l'implicazione di proteine specifiche in alcune malattie, prove crescenti supportano l'idea che tutti i polipeptidi abbiano proprietà intrinseche che consentono la trasformazione dell'amiloide. Un'indagine di sequenza sull'intero genoma ha identificato l'"amiloma", mediante il quale i frammenti inclini all'amiloide costituiscono circa il 15% di tutti i segmenti peptidici codificanti da E. coli all'uomo5. Di conseguenza, negli ultimi anni è stato scoperto un numero crescente di amiloidi funzionali, che partecipano a vari importanti processi cellulari. Ad esempio, i batteri assemblano gli amiloidi per formare biofilm e strutture di spore che sono fondamentali per la loro sopravvivenza e patogenesi6-9. Gli ormoni peptidici formano depositi di amiloide durante la conservazione all'interno dei granuli secretori dei mammiferi prima di essere rilasciati, implicando ulteriormente che la forma amiloide proteica può svolgere funzioni biologiche benefiche6,10,11. Inoltre, le proteine possono anche assemblarsi in fibrille amiloidi per trasmettere segnali cellulari critici12,13.
Per molti anni, gli amiloidi più studiati sono stati preparati da singoli peptidi associati a malattie umane, come l'amiloide-beta o il peptide prionico. Questi peptidi di solito mancano di una struttura ben definita e formano spontaneamente amiloide in soluzione nel tempo, un processo mediato da un intermedio parzialmente mal ripiegato che funge da precursore dell'amiloide insolubile. Il precursore dell'amiloide è anche chiamato oligomero proteico solubile, che è raro e instabile se generato da peptidi naturali14,15. Tuttavia, come descritto in precedenza, quasi tutte le proteine in linea di principio possono adottare la conformazione amiloide nelle condizioni appropriate. Recentemente abbiamo messo a punto un metodo per preparare oligomeri solubili stabilizzati di proteine native, che formano facilmente amiloide in presenza di vari cofattori16. Le fibrille amiloidi risultanti riflettono la natura complessa degli aggregati di misfolding delle proteine terminali17,18. Qui usiamo il termine amiloide solo proteica per riferirci alle fibrille proteiche senza cofattori e amiloide ibrida per le fibrille contenenti componenti non proteici.
In precedenza, sono stati sviluppati vari metodi per generare amiloide in vitro applicando condizioni note per favorire il ripiegamento errato delle proteine, come l'alta temperatura, l'ambiente idrofobico e le variazioni di pH19-23. Tuttavia, si associano a vari problemi, come la bassa efficienza, la piegatura reversibile, le variazioni di grandi lotti o la cinetica lenta. L'approccio qui descritto è riproducibile, facile da scalare e consente di controllare con precisione i tempi e le condizioni della conversione dell'amiloide.
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Protocollo
1. Prepara il buffer MES
- Utilizzare il tampone MES (acido 0,1 M 2-(N-morfolino)etansolfonico e 0,9 M NaCl) per preparare sia oligomeri di sola proteina amiloide che oligomeri proteici solubili stabilizzati. Pesa 1,95 g di MES e 5,27 g di NaCl. Aggiungere H2O e regolare il pH a 4,7. Portare il volume finale a 100 ml. Conservare a 4º C per un massimo di 6 mesi.
2. Prepara l'amiloide di sole proteine direttamente dalle proteine native
- Pesare la proteina di scelta (qualsiasi proteina o peptide nativo) e ricostituirla a 10 mg/ml in tampone MES.
- Incubare a 65 ºC in bagnomaria per 4 ore. Alla fine del periodo, il precipitato bianco è visibile in soluzione.
- Neutralizzare il campione con il 10% (v/v) di Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
- Dializzare la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per passare al tampone desiderato per ulteriori analisi.
- Un campione di controllo di proteina nativa può essere preparato seguendo i passaggi 2.1, 2.3 e 2.4 senza precipitazione di calore (passaggio 2.2).
3. Prepara l'amiloide ibrida da oligomeri solubili stabilizzati di proteine native
- Preparare oligomeri proteici solubili stabilizzati
- Pesare la proteina di scelta e ricostituirla a 10 mg/ml in tampone MES. Lasciare a temperatura ambiente per 15 min.
- Pesare l'1-etil-3-[3-dimetilamminopropil]carbodiimmide cloridrato (EDC) e preparare una nuova scorta di 20 mg/ml in tampone MES.
- Mescolare le soluzioni proteiche e EDC in un rapporto di 2:5 (v/v), cioè 2 mg di proteine per ogni 10 mg di EDC.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Neutralizzare il campione con il 10% (v/v) di Tris-HCl (1 M, pH 10,5).
- Dializzare la proteina in una cassetta per dialisi durante la notte per passare al tampone desiderato per ulteriori analisi.
- Conservare l'oligomero proteico solubile stabilizzato a 4 ºC fino a 4 settimane.
- Preparare amiloidi ibride da oligomero proteico solubile stabilizzato.
- Per preparare l'amiloide contenente DNA, mescolare il DNA e l'oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.
- Per preparare l'amiloide contenente RNA, mescolare l'RNA e l'oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.
- Per preparare l'amiloide contenente eparina, mescolare eparina e oligomero proteico solubile stabilizzato in rapporto 1:1 (p/p). Lasciare agire a 4 ºC per almeno 2 ore. Durante questo periodo, il precipitato insolubile è visibile in soluzione quando la concentrazione proteica iniziale è pari o superiore a 0,5 mg/ml.
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Risultati
La capacità di convertire direttamente le proteine native in amiloidi si basa sul cambiamento conformazionale indotto ad alta temperatura nel tampone MES. La precipitazione nella soluzione è un buon indicatore dell'aggregazione proteica e, possibilmente, della formazione di amiloidi. D'altro canto, per permettere la stabilizzazione di oligomeri proteici solubili, l'EDC viene utilizzato per cross-linkare le proteine, fissando così la conformazione oligomerica indotta nel tampone MES. Di conseguenza, gli oligomeri proteici...
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Discussione
Il metodo qui descritto offre un mezzo rapido e flessibile per preparare fibrille amiloidi in vitro praticamente da qualsiasi proteina o peptide di scelta. Diversi tipi di amiloide possono essere preparati in modo affidabile: fibrille di sole proteine o aggregati ibridi contenenti DNA, RNA o glicosaminoglicani. Le procedure coinvolte sono semplici, dirette e non richiedono una formazione tecnica avanzata. L'amiloide preparata con questo metodo è abbastanza stabile e può essere conservata in sicurezza a 4 ºC o co...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni a W.C. dal National Institutes of Health Grant AI074809 e dal programma di sovvenzioni per la ricerca istituzionale del M. D. Anderson Cancer Center dell'Università del Texas.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES) | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| 1-etil-3-[3-dimetil-amminopropil] cloridrato di carbodiimmide (EDC) | Thermo/Pierce | 22980 | |
| DNA da spermatozoo di salmone | Sigma | D1626 | |
| RNA da lievito torula | Sigma | R6625 | |
| Eparina dalla mucosa intestinale suina | Sigma | H3149 | |
| Tris base | Fisher | BP152-1 | |
| Attrezzatura: | |||
| Bagnomaria | Fisher Science | Isotemp 210 | |
| Slide-A-Lyzer cassetta per dialisi | Thermo/Pierce | 66380 |
Riferimenti
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