Articolo metodologico

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

DOI:

10.3791/50870

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13 febbraio 2014

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1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

In questo articolo

Sommario

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Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Abstract

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L'ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l'ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell'ippocampo è un'area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l'inibizione neuronale specifico proencefalo dell'attività di NF-kB può essere utilizzato.

In questo studio, sono descritti metodi per l'analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l'uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l'influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.

Introduzione

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Ontologicamente, l'ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E 'responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l'orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l'ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le c....

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Protocollo

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Dichiarazione Etica

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le disposizioni della utilizzazione cura degli animali e del comitato governativo, LANUV dello stato del Nord Reno-Westfalia, (Düsseldorf, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal LANUV, Düsseldorf sotto il numero di licenza 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare lo stress e il numero di animali necessari per lo studio.

1. Animal Care and Housing

  1. Tutti gli animali impiegati nei protocolli qui descritti devono essere tenuti in condizioni esenti da orga....

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Risultati

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Incroci delle IkB / - linee topo transgenico e tTA porta all'inibizione condizionale dell'attività di NF-kB nell'ippocampo.

Per studiare l'espressione del IκBα-AA1-transgene nel doppio topo transgenico (Figura 1A), i cervelli sono stati isolati, cryosectioned e colorazione con un anticorpo contro GFP (green fluorescent protein). Microscopio confocale a scansione laser rivelato alta espressione del transgene nelle regioni CA1 e CA3, e nella DG (Figura.......

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Discussione

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Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l'inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei dife.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Angela Kralemann-Köhler per un eccellente supporto tecnico. Il lavoro sperimentale qui descritta è stata eseguita nel nostro laboratorio ed è stata sostenuta da sovvenzioni del Consiglio di ricerca tedesco (DFG) a CK e BK e una borsa di studio del ministero tedesco della Ricerca e dell'Istruzione (BMBF) per BK.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Moria MC17 Cucchiaio Forato FST10370-18rimozione del cervello
Microscopio da dissezioneCarl ZeissStemi SV8rimozione del cervello
Forbici chirurgiche FST14084-08rimozione del cervello
Forbici chirurgiche FST14381-43rimozione del cervello
Dumont #5 pinzeFST11254-20rimozione del cervello SuperFrost
SlidesCarl Roth1879vetrini per immunoistochimica
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148fissativo
TissueTek OCT compostoSakura Finetek1004200018l'inclusione del cervello
Siero di capra normaleJackson Immunolabs005-000-001blocco in IHC
Siero normale di coniglioJackson Immunolabs011-000-001blocco in IHC
Siero d'asino normaleJackson Immunolabs017-000-001blocco in IHC
anticorpi anti-neurofilamento-MStudi sullo sviluppo Banca degli ibridomi2H3IHC, diluizione 1:200
anti-Doublecortin  anticorposc-8066Santa CruzIHC, diluizione 1:800
anticorpo anti-GFPAbcamab290IHC, diluizione 1:2.000
anticorpo anti-BrdUOBT0030GAccurate ChemicalsIHC, diluizione 1:2.000 
Fluoro-Jade CFJ-CHistoChemDeterminazione della morte cellulare neuronale
BetadineMundipharmadisinfettante D08AG02
CriomicrotomoLeicaCM1900preparazione di fette di cervello
Eparina sale sodicoSigma-AldrichH3393
perfusione Piastra circolare in plastica dura (diametro 120 cm)realizzatain laboratorionessunapiastra per SPS-BM, diametro 120 cm
Disinfettante rapido Buraton Schü lke Mayr113 911disinfettante
Sistema di videolocalizzazione TSE VideoMot 2 con pacchetto software VideoMot2TSE Systems302050-SW-KITtracciamento e analisi di SPS-BM
Triton X-100 Permeabilizzazione Sigma AldrichT8787IHC
CriotomoReichert Jung/LeicaFrigomobil 1206preparazione di 40 &; m fette di cervello
Mowiol 4-88Carl RothArt.-Nr. 0713inclusione dei vetrini
SYTOX verdeInvitrogenS7020Colorazione nucleare
Pellet alimentari (Kellog's Froot Loops)Kellog'sSPS-BM
Prism, versione 3.0Graph Pad Software, San Diego, USAValutazione statistica del software SPS-BM
Zen 2008 o Zen 2011Carl ZeissSoftware (microscopio confocale
D.P.XSigma-Aldrich317616mezzo di montaggio per la colorazione Fluoro-Jade C
/)

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
  2. Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....

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NF kappa Bseparazione spaziale dei patternlabirinto di Barnesmicroscopia confocaleanalisi istologicatopi transgenicigiro dentatotest comportamentalicolorazione in immunofluorescenza

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