Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

Summary

Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Abstract

L'ippocampo gioca un ruolo fondamentale nella formazione e il consolidamento dei ricordi episodici, ed in orientamento spaziale. Storicamente, l'ippocampo adulto è stato visto come una regione anatomica molto statica del cervello dei mammiferi. Tuttavia, recenti scoperte hanno dimostrato che il giro dentato dell'ippocampo è un'area di enorme plasticità negli adulti, coinvolgendo non solo le modificazioni dei circuiti neuronali esistenti, ma anche neurogenesi adulta. Questa plasticità è regolata da reti trascrizionali complesse, in cui il fattore di trascrizione NF-kB gioca un ruolo di primo piano. Per studiare e manipolare neurogenesi adulta, un modello di topo transgenico per l'inibizione neuronale specifico proencefalo dell'attività di NF-kB può essere utilizzato.

In questo studio, sono descritti metodi per l'analisi di neurogenesi NF-kB-dipendente, compresi gli aspetti strutturali, apoptosi neuronale e progenitore proliferazione e significato cognitivo; la cucih specificamente è stato valutato attraverso un giro dentato (DG)-dipendente prova comportamentale, il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale (SPS-BM). Il protocollo SPS-BM potrebbe essere adattato solo per l'uso con altri modelli animali transgenici destinati a valutare l'influenza di particolari geni adulti neurogenesi ippocampale. Inoltre, SPS-BM potrebbe essere utilizzata in altre condizioni sperimentali intesi a studiare e manipolare apprendimento DG-dipendente, ad esempio, utilizzando agenti farmacologici.

Introduction

Ontologicamente, l'ippocampo è una delle più antiche strutture cerebrali anatomiche conosciuti. E 'responsabile di diversi compiti complessi, come le funzioni cardine nella regolazione della memoria a lungo termine, l'orientamento spaziale, e la formazione e il consolidamento della rispettiva memoria. Anatomicamente, l'ippocampo è costituito da strati di cellule piramidali (strato piramidale), tra cui il cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 e CA4), regioni ed il giro dentato (giro Dentato), che contiene granuli e alcuni progenitori neuronali nella propria zona di subgranular . Le cellule granulari proiettano verso la regione CA3 tramite le cosiddette fibre di muschio (assoni delle cellule granulari).

Fino alla fine del secolo scorso, il cervello dei mammiferi adulti è stato creduto di essere un organo statico privo di plasticità e neurogenesi cellulare. Tuttavia, durante gli ultimi due decenni, una crescente quantità di prove dimostra chiaramente neurogenesi adulta si svolgono in almenodue regioni del cervello, la zona subventricolare (SVZ) e la zona subgranulare dell'ippocampo.

I nostri studi precedenti, e quelli di altri gruppi, hanno dimostrato che il fattore di trascrizione NF-kB è uno dei regolatori molecolari cruciali della neurogenesi adulta, e che i suoi risultati de-regolazione di gravi difetti strutturali dell'ippocampo e menomazioni cognitive ^1-6. NF-kB è il nome generico di un fattore di trascrizione inducibile composto da diverse combinazioni dimeriche di cinque-DNA-binding subunità: P50, P52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), gli ultimi tre dei quali hanno domini di transattivazione. All'interno del cervello, la forma più abbondante nel citoplasma è un eterodimero di p50 e p65, che viene mantenuto in una forma inattiva da inibitore di kappa B (IkB)-proteine.

Per studiare e manipolare direttamente neurogenesi NF-kB-driven, usiamo modelli di topi transgenici per consentire semplice inibizione di tutti i subun NF-kBsua, specificamente nel proencefalo ⁷ (vedi figura 1). A questo scopo, abbiamo Incrocio le seguenti linee di topo transgenico, IkB / - e -/tTA. Il transgenico IkB / - linea è stata generata utilizzando un mutante negativo trans-dominante di NF-kB-inibitore IκBa (super-repressore IκBa-AA1) ^8. In contrasto con il wild-type IκBα, IκBα-AA1 è dotato di due residui di serina mutati di alanina (V32 e V36), che ostacolano la fosforilazione e la successiva degradazione del proteasoma dell'inibitore. Per prosencefalo espressione di specifici neuroni del IκBa-AA1-transgene, IkB / - topi sono stati incrociati con i topi ospitare una chinasi calcio-calmodulina-dipendente IIα (CAMKIIα)-promotore che può essere guidato da tetraciclina trans-attivatore (AS) ^9.

p65 topi knock-out hanno un fenotipo letale embrionale, a causa della massiccia apoptosi fegato ^10, quindi l'approccio qui illustrato fornisce un metodo eleganteper indagare il ruolo di NF-kB in postnatale e neurogenesi adulta.

Il test classico comportamentale per studiare l'apprendimento spaziale e la memoria è stata descritta nel 1980 da Richard Morris, un test noto come Morris water-maze (MWM) ^11. In questo open-campo di acqua-labirinto, animali imparano a fuggire da acqua opaca su una piattaforma nascosta basata su orientamento ed extra-labirinto spunti. Una variante secca MWM è il cosiddetto labirinto Barnes (BM) ^12. Questo test utilizza una piastra circolare con 20 fori circolari disposti al confine di un piatto, con un foro definito come una scatola di fuga, e visivi spunti extra-labirinto per l'orientamento. Entrambi i paradigmi sperimentali si basano sul comportamento in volo indotto da un roditore `s avversione per l'acqua, o spazi aperti e luminosi illuminati. Entrambi i test permettono un'indagine di orientamento spaziale, e le prestazioni della memoria correlati. Sebbene l'ippocampo gioca un ruolo generale ed essenziale nella formazione della memoria spaziale, l'ippocampo rEGIONI coinvolti variano a seconda del test applicato. La memoria testato in BM deriva da attività neuronale tra la corteccia enthorinal (CE) ei neuroni piramidali situate nella regione CA1 dell'ippocampo senza il contributo della DG ^13-16. In particolare, il classico BM si basa principalmente sulla navigazione tramite temporo-ammonico percorso monosinaptico da CE III CA1 CE V. È importante sottolineare che il DG è cruciale coinvolto nella cosiddetta pattern recognition spaziale ^17, che non solo comporta il trattamento dei informazioni visive e spaziali, ma anche la trasformazione di rappresentazioni o di ricordi simili in rappresentazioni dissimili, non sovrapposti. Questo compito richiede un circuito tri-sinaptica funzionale da CE II alla DG per CA3 a CA1 e CE VI, che non può essere provato nel BM ^15.

Per affrontare queste sfide, abbiamo ideato SPS-BM come test comportamentali per verificare specificamente le prestazioni giro-dipendente dentate cognitive in collaborazioneanimali ntrol, e nel modello super-repressore IkB / tTA seguente inibizione di NF-kB. È importante sottolineare che, in contrasto con la MWM o la BM, il SPS-BM può rivelare sottili deficit comportamentali derivanti dal deterioramento della neurogenesi. Poiché spaziale-modello-separazione è strettamente dipendente da un circuito funzionale tra CE II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, questo test è altamente sensibile a potenziali cambiamenti di neurogenesi, modifiche del percorso fibra di muschio o alterazioni dell'omeostasi del tessuto all'interno del DG.

Tecnicamente, il set-up del nostro test si basa sullo studio da Clelland et al., In cui il modello di separazione spaziale è stato testato utilizzando un legno 8-braccio braccio radiale labirinto (RAM) ^19. Nel nostro modificata set-up, le otto bracci sono stati sostituiti da sette identici alimento case gialle. In sintesi, i metodi qui riportate, compresa l'analisi dei DCX (+), le cellule-doublecortin esprimono all'interno dell'ippocampo, le proiezioni in fibra di muschio, neuronale delle cellule death e in particolare la SPS-BM qui presentato, può essere applicato a ricerche di altri modelli del mouse incorporano transgeni che hanno un impatto sulla neurogenesi adulta. Ulteriori applicazioni possono comprendere lo studio di agenti farmacologici e misurare il loro impatto sulla separazione modello DG e spaziale.

Protocol

Dichiarazione Etica

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le disposizioni della utilizzazione cura degli animali e del comitato governativo, LANUV dello stato del Nord Reno-Westfalia, (Düsseldorf, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal LANUV, Düsseldorf sotto il numero di licenza 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Sono stati fatti tutti gli sforzi per minimizzare lo stress e il numero di animali necessari per lo studio.

1. Animal Care and Housing

1. Tutti gli animali impiegati nei protocolli qui descritti devono essere tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, come definito dalla Federazione europea Laboratory Animal Science Association (FELASA).
2. I topi dovrebbero essere tenuti in gabbie standard in temperatura e umidità controllata (22 ° C), camera in condizioni diurni (12 ore di luce / buio ciclo) con HEPA aria filtrata.
3. Cibo standardizzato e acqua dovrebbero essere forniti ad libitum.
4. Se / IkB / tTA e IkB - sono utilizzati topi di controllo, la genotipizzazione basato su PCR deve essere eseguita per ogni animale, come descritto in ^{7, 18.}
5. I maschi con una differenza di età di meno di quattro giorni dovrebbe per essere utilizzati per ridurre la variabilità individuale.
6. (OPTIONAL): Per gli esperimenti di riattivazione NF-KB, doxiciclina deve essere somministrato in acqua potabile (2 mg / ml con il 2,5% di saccarosio) per almeno 14 giorni.

2. Spatial modello di separazione-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Tutti i test comportamentali dovrebbe essere effettuata secondo le linee guida internazionali e locali.
2. IMPORTANTE! Utilizzare solo topi maschi con una età di sei mesi o più. La differenza di età tra gli animali di una serie di test deve essere inferiore a quattro giorni. La prova deve essere eseguita dallo stesso operatore per ogni serie. I topi dovrebbe ricevere una dieta standard prima del test per aumentare ulteriormente la motivazione parzialmente guidata da comeweet ricompensa in cibo.
3. Impostare una piastra circolare bianco fatto da plastica dura (diametro 120 cm, vedi figura 5A) in un e umidità ambiente a temperatura controllata (22 ° C), illuminata con almeno 4 x 80 W e 3 x 215 W lampade fluorescenti al neon . IMPORTANTE! Garantire la corretta illuminazione è usata, come la motivazione dei topi per entrare nelle case di cibo è in parte guidato dalla loro avversione per luminose, luoghi esposti.
4. Impostare il sistema video-tracking. La telecamera deve essere posizionata 115 centimetri al di sopra del centro della piastra (vedi figura 5A).
5. Attaccare multicolore spunti extra-labirinto (EMC) per un panno di colore bianco in posizioni ben visibili per gli animali, circa 100 cm dal bordo della piastra (vedi figura 5A).
6. Pulire accuratamente la piastra con un rapido disinfettante che può rimuovere qualsiasi odore dal set-up sperimentale.
7. Posizionare sette identiche case gialle alimentari (12 cm x 7 cm x 8 centimetri, vedere Figura 5A ) sulla piastra bianca. Le posizioni dovrebbero essere inequivocabilmente contrassegnati (vedi figura 5A).
8. Posizionare dolci ricompense pellet cibo (un quarto di una casa Froot Loop / cibo Kellogs `s) all'interno di tutte le case di cibo sulle posizioni definite (vedi Figura 5A) con una sola casa cibo definito essere liberamente accessibili per l'animale (posizione F, si veda la Figura 5A ). Chiudere le case alimentari non bersaglio con un foglio trasparente.
9. Prima della prova, eseguire assuefazione (un giorno prima di iniziare l'attività). Fai tutte le case alimentari liberamente accessibile e permettere ai topi di esplorare il labirinto liberamente e per recuperare una ricompensa pellet alimentare (10 min / animale).
10. Accendere il computer e la fotocamera e avviare il software di sistema di video-tracking.
11. Avviare la registrazione.
12. Posizionare l'animale al punto iniziale definito sulla piastra circolare (Figura 5A, S: posizione iniziale) e permettere ai topi per cercare la casa cibo di destinazione per 10 min.
13. Stop video-tracking.
14. IMPORTANTE! Pulire la piastra circolare e le case alimentari dopo ogni prova con un rapido disinfettante.
15. Ripetere la prova giorno per sette giorni consecutivi (per animale).
16. Analizzare i risultati (latenza, distanza percorsa e errori) utilizzando il software di statistiche adeguate. Definire gli errori come avvicinarsi alla casa cibo sbagliato e / o contatto con l'apposita casella senza entrare e recuperare la ricompensa pellet cibo. Per l'analisi raggruppati utilizzare ANOVA a due vie con il test di Bonferroni post-hoc.
17. (FACOLTATIVO) Sacrifica i topi e analizzare il dell'ippocampo come descritto di seguito.

3. BrdU Etichettatura

1. Iniettare per via intraperitoneale 50 mg / kg ip BrdU una volta al giorno per 3 giorni (analisi di differenziazione e integrazione) o ip 200 mg / kg per una singola iniezione (analisi della proliferazione).
2. Sacrificare gli animali, sezionare l'ippocampo e preparare 40 sezioni micron come descritto di seguito.
3. Denaturate l'sezioni con 2 M HCl per 10 min e incubare in 0,1 M tampone borato per 10 min.
4. Etichettare una serie uno su dodici di 40 sezioni micron (240 micron a parte) da ciascun animale immunoistochimiche, come descritto di seguito utilizzando anticorpi diretti contro BrdU.
5. Quantificare le cellule marcate mediante analisi al microscopio confocale in tutta l'estensione rostrocaudale dello strato di cellule dei granuli e la zona subgranular. Moltiplicare i numeri risultanti per 12 per ottenere il numero totale stimato di cellule BrdU marcato per ippocampo e dividere per due per ottenere il numero totale di cellule marcate per DG.

4. La rimozione dei cervelli e preparazione di criosezioni da Nonperfused Animali

1. Osservare le procedure approvate a livello locale per eutanasia degli animali. I topi possono essere eutanasia direttamente da dislocazione cervicale.
2. (OPTIONAL) Gli animali possono essere anestetizzati prima euthanization secondo le linee guida locali e internazionali, ad esempio inje intraperitonealection di 0,8 ml Avertin per un mouse 33 g (appena fatto mescolando 150 ml di soluzione fatta di 2,2 mg 2,2,2-tribromoethanol in 1 ml di etanolo isoamyl con 1,85 ml di soluzione fisiologica o tampone fisiologico).
3. Sterilizzare la testa con Betadine (10% povidone-iodio)-garza imbevuta e tampone, successivamente con una garza imbevuta di etanolo al 70%.
4. Decapitare l'animale utilizzando opportuni forbici chirurgiche e tirare la pelle da parte.
5. (OPZIONE) fissatori possono essere adottate per evitare di ripiegamento della pelle ritardato.
6. Effettuare una incisione mediana nel cranio e tirare con attenzione i frammenti di cranio da parte.
7. Rimuovere con attenzione l'intero cervello con uno strumento chirurgico adeguato (ad es Moria Spoon).
8. Preraffreddare 25 ml di 2-metilbutano in un becher da 50 ml (ad es Schott Duran) a -30 a -40 ° C in ghiaccio secco.
   Nota: Per la colorazione libera fluttuazione delle sezioni "spesse", che sono ideali per microscopio confocale a scansione laser, rimuovere il cervello, lavare 3volte in tampone e conservare a 4 ° C in tampone fosfato soluzione di saccarosio al 30% in 50 ml di tubo fino al cervello ha affondato giù alla parte inferiore (tipicamente durante la notte).
9. Posizionare con cura il cervello su un pezzo di Nescofilm (Parafilm) e coprire con grande quantità di composto TissueTek ottobre, congelare il Nescofilm in 2-metilbutano, conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
   Nota: Per la conservazione a lungo tempo a -20 ° C in negozio il 9% di saccarosio, 7 MgCl ₂ mM, 50 mM tampone fosfato, 44% glicerolo.
10. Tagliare il cervello in 10-12 micron di spessore sezioni su appropriate cryomicrotome.
    Nota: Per spessore, sezioni free-floating, congelare cervello su cryotome fase di un'adeguata cryotome (es. Reichert Jung, Frigomobil.) E tagliare 40 micron sezioni orizzontali a -20 ° a - 25 ° C. Raccogliere sezioni da coltello con pennello fine e raccogliere in tampone o mantenere in soluzione di storage (punto 4.9) a -20 ° C per la conservazione a lungo tempo.
11. Montare con cautela due fette su vetrini da microscopio singoli. Il use di vetrini Superfrost UltraPlus è altamente consigliato per massimizzare l'adesione delle sezioni.
12. Essiccare i vetrini per 5 min a temperatura ambiente. I vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.

5. Preparazione di sezioni da irrorati Animali

1. Anestetizzare gli animali come descritto sopra (passo 4.2).
2. Profumato con attenzione l'animale transcardially con tampone fosfato (PBS) contenente eparina (0,025 g/100 ml PBS) e procaina (0,5 g/100 ml PBS) per 2-4 min, seguiti da 4% paraformaldeide in PBS per 10-15 min . Perfusione viene eseguita in modo ottimale mediante perfusione attraverso il ventricolo sinistro e l'apertura dell'atrio destro utilizzando una pressione idrostatica di circa 1,2-1,4 m o utilizzando una pompa peristaltica impostato a circa 15 ml / min. Risultati di perfusione ottimale in un cervello bianco pallido, con vasi sanguigni rossi essere visibile.
3. Sezionare e post-fissare i cervelli in paraformaldeide 4% a 4 ° C per 24 ore.
4. Cryoproteggere i cervelli in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C per almeno 24 ore.
5. Congelare il cervello sul palco cryotome.
6. Preparare 40 micron sezioni orizzontali di intere forebrains utilizzando un cryotome appropriato.
7. I vetrini possono essere conservati in soluzione crioprotettore (tampone fosfato 0,1 M, 50% glicerolo, 0,14% MgCl _2, 8,6% di saccarosio) a -20 ° C fino all'utilizzo.

6. L'immunoistochimica di sezioni di cervello di Nonperfused Animali

1. Post-fissare le criosezioni, preparate come sopra descritto, utilizzando -20 ° C metanolo freddo per 10 min.
2. Bloccare con siero normale 5% contenente 0,3% Triton-X (dalla specie che è stato utilizzato per sollevare l'anticorpo secondario) per una notte a 4 ° C.
3. Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi primari notte a 4 ° C.
4. Risciacquare 3x con 1x PBS e incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per un'ora.
5. Sciacquare 3x con 1x PBS
6. Counterstain la sezione di DNA utilizzando Sytox verde, o DAPI (o un colorante DNA alternativo).
7. Sciacquare 3x con 1x PBS
8. Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento.
9. Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per almeno 48 ore.

7. L'immunoistochimica di sezioni di cervello di perfusione Animali

1. Blocca come descritto nel passaggio 6.2 e successivamente incubare le sezioni di cervello fisse in soluzione di anticorpo primario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (fluttuante) notte a 4 ° C.
2. Risciacquare tre volte con PBS 1x e incubare in soluzione di anticorpo secondario diluito in PBS contenente 0,3% Triton-X (liberamente fluttuante) a temperatura ambiente per 3 ore.
3. Sciacquare 3x con 1x PBS
4. Controcolorare la sezione di DNA utilizzando Sytox verde o DAPI (o un colorante DNA alternativo).
5. Lavare tre volte con PBS 1x
6. Incorporare le sezioni in un mezzo acquoso incorporamento.
7. Lasciate che il mezzo di inclusione polimerizzare per unt almeno 48 ore.

8. Indagine su Mossy fibra Proiezioni

1. Sacrificare gli animali, preparare 40 micron sezioni coronali come descritto sopra e macchiare la sezione dell'ippocampo utilizzando un anticorpo per neurofilament M.
2. Scansione delle sezioni alla lunghezza d'onda appropriata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser per visualizzarne le fibre coperte di muschio e nuclei. Avviare la scansione a basso ingrandimento.
3. Utilizzare le immagini a basso ingrandimento per l'orientamento e indirizzare l'ippocampo con le proiezioni in fibra di muschio.
4. Scansione delle sezioni (z-sezionamento) ad alta risoluzione e alto ingrandimento.
5. Analizzare l'aspetto morfologico e la connettività delle fibre muschio visualizzate tramite colorazione per NF-M.
6. (OPTIONAL) Analizzare le dimensioni e il volume di lame dell'ippocampo. Utilizzare il segnale DNA per le misurazioni.

9. Fluoro-Jade C Assay (neuronale morte cellulare)

1. Sacrificare gli animali, sezionare il hippocAmpus, e preparare 12 sezioni micron come descritto sopra.
2. Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Fissare le sezioni in PFA 4% per 40 min a temperatura ambiente.
4. Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
5. Incubare le sezioni con permanganato di potassio 0,06% (KMnO ₄₎ per 10 min in continuo, agitando delicatamente.
6. Lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
7. Incubare le sezioni con 0,002% di soluzione Fluoro-Jade C per 20 min a temperatura ambiente.
8. (Opzionale) per colorazioni nucleari simultanee, una soluzione 0,002% Fluoro-Jade C può essere completato con 10 mg / ml DAPI.
9. Brevemente lavare le sezioni 3x con DDH ₂ O.
10. Let sezioni asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente.
11. Incubare le sezioni con xilene (1 min)
12. Montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene (DPX).

Results

Incroci delle IkB / - linee topo transgenico e tTA porta all'inibizione condizionale dell'attività di NF-kB nell'ippocampo.

Per studiare l'espressione del IκBα-AA1-transgene nel doppio topo transgenico (Figura 1A), i cervelli sono stati isolati, cryosectioned e colorazione con un anticorpo contro GFP (green fluorescent protein). Microscopio confocale a scansione laser rivelato alta espressione del transgene nelle regioni CA1 e CA3, e nella DG (Figura...

Discussion

Neurogenesi adulta, e la possibilità della sua manipolazione attraverso l'inibizione di NF-kB nei neuroni, e la sua riattivazione in seguito con doxiciclina, offre un affascinante sistema di indagini neuroni nel cervello adulto, così come in neuronale de-e ri-generazione . La bellezza di questo sistema è che NF-kB via di segnalazione inibizione dei neuroni non solo si traduce in cambiamenti nella morte neuronale, proliferazione progenitore e migrazione, i cambiamenti strutturali e anatomiche gravi, ma anche nei dife...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Cucchiaio Forato	FST	10370-18	rimozione del cervello
Microscopio da dissezione	Carl Zeiss	Stemi SV8	rimozione del cervello
Forbici chirurgiche	FST	14084-08	rimozione del cervello
Forbici chirurgiche	FST	14381-43	rimozione del cervello
Dumont #5 pinze	FST	11254-20	rimozione del cervello SuperFrost
Slides	Carl Roth	1879	vetrini per immunoistochimica
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	fissativo
TissueTek OCT composto	Sakura Finetek	1004200018	l'inclusione del cervello
Siero di capra normale	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocco in IHC
Siero normale di coniglio	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocco in IHC
Siero d'asino normale	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocco in IHC
anticorpi anti-neurofilamento-M	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	2H3	IHC, diluizione 1:200
anti-Doublecortin  anticorpo	sc-8066	Santa Cruz	IHC, diluizione 1:800
anticorpo anti-GFP	Abcam	ab290	IHC, diluizione 1:2.000
anticorpo anti-BrdU	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, diluizione 1:2.000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determinazione della morte cellulare neuronale
Betadine	Mundipharma	disinfettante D08AG02
Criomicrotomo	Leica	CM1900	preparazione di fette di cervello
Eparina sale sodico	Sigma-Aldrich	H3393
perfusione Piastra circolare in plastica dura (diametro 120 cm)	realizzata	in laboratorionessuna	piastra per SPS-BM, diametro 120 cm
Disinfettante rapido Buraton	Schü lke Mayr	113 911	disinfettante
Sistema di videolocalizzazione TSE VideoMot 2 con pacchetto software VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracciamento e analisi di SPS-BM
Triton X-100	Permeabilizzazione Sigma Aldrich	T8787	IHC
Criotomo	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparazione di 40 &; m fette di cervello
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	inclusione dei vetrini
SYTOX verde	Invitrogen	S7020	Colorazione nucleare
Pellet alimentari (Kellog's Froot Loops)	Kellog's		SPS-BM
Prism, versione 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Valutazione statistica del software SPS-BM
Zen 2008 o Zen 2011	Carl Zeiss	Software (microscopio confocale
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mezzo di montaggio per la colorazione Fluoro-Jade C