Metodi per identificare le risonanze NMR dell'ammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente

Sommario

Vengono descritti due metodi per assegnare i segnali di risonanza magnetica nucleare α- e ε-dimetilammina di una lisina N-terminale riduttivamente ^{metilata 13}C. Un metodo utilizza la selettività indotta dal pH della reazione di metilazione riduttiva e l'altro utilizza l'aminopeptidasi per rimuovere selettivamente la lisina N-terminale.

Abstract

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica collaudata per studi sulla struttura e la dinamica delle proteine. Per studiare le proteine con NMR, gli isotopi magnetici stabili sono tipicamente incorporati metabolicamente per migliorare la sensibilità e consentire l'assegnazione sequenziale della risonanza. La C-metilazione riduttiva del ¹³è un metodo di marcatura alternativo per le proteine che non sono suscettibili di sovraespressione dell'ospite batterico, il metodo più comune di incorporazione degli isotopi. La C-metilazione riduttiva ¹³è una reazione chimica eseguita in condizioni blande che modifica i gruppi amminici primari di una proteina (gruppi ε-amminici della lisina e gruppo α-amminico N-terminale) in ¹³gruppi C-dimetilamminici. La struttura e la funzione della maggior parte delle proteine non vengono alterate dalla modifica, rendendola una valida alternativa alla marcatura metabolica. Poiché la metilazione riduttiva ^{del 13}C aggiunge marcature isotopiche sparse, i metodi tradizionali di assegnazione dei segnali NMR non sono applicabili. È stato sviluppato un metodo di assegnazione alternativo che utilizza la spettrometria di massa (MS) per facilitare l'assegnazione dei segnali NMR della proteina ¹³C-dimetilammina. Il metodo si basa su quantità parziali e diverse di ¹³C-marcatura in ciascun gruppo amminico primario. Una limitazione del metodo sorge quando il residuo N-terminale della proteina è una lisina perché i gruppi α- e ε-dimetilamminico di Lys1 non possono essere misurati individualmente con la MS. Per aggirare questa limitazione, vengono descritti due metodi per identificare la risonanza NMR delle ¹³C-dimetilammine associate sia alla α-ammina N-terminale che alla catena laterale ε-ammina. I segnali NMR della α-dimetilammina N-terminale e della catena laterale ε-dimetilammina del lisozima dell'albume d'uovo di gallina, Lys1, sono identificati in ¹spettri di coerenza quantistica singola eteronucleare ^H-13C.

Introduzione

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è un prezioso strumento di chiarimento della struttura per le proteine¹. La spettroscopia NMR può essere utilizzata per determinare la struttura in soluzione di una proteina nel suo stato nativo. Per superare la bassa abbondanza naturale di isotopi magnetici stabili, è necessario incorporare ¹³C e ¹⁵N nella proteina di interesse. Il metodo più comunemente impiegato è l'espressione ricombinante in un ospite batterico^2-3. Tuttavia, due svantaggi della sovraespressione dell'ospite batterico sono che non può produrre modifiche post-traduzionali e non funziona per tutte le pr....

Protocollo

1. Metilazione riduttiva del lisozima

1. Preparare 500 ml di un tampone fosfato di sodio 50 mM a pH 7,5. Conservare a temperatura ambiente.
2. Etichettare tre provette per microcentrifuga da 1 ml per campioni completamente marcati (FLS), campioni parzialmente marcati a basso pH (LpH) e campioni parzialmente marcati a pH elevato (HpH).
3. Pesare 10 mg di lisozima e sciogliere in 2 ml di tampone fosfato di sodio per creare una soluzione acquosa con una concentrazione di 5 mg/ml. Coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere la formaldeide dalla degradazione dovuta all'esposizione alla luce. Aggiungere 500 μl di soluzione di lisozim....

Risultati

Metilazione riduttiva e pH

È stata dimostrata una reazione chimicamente selettiva di riduttiva metilazione con ¹³C su lisozima indotta dal pH. A pH basso, la reazione preferisce l'ammina α del gruppo N-terminale rispetto alle ammine ε delle catene laterali, e viceversa a pH elevato. In soluzione, i gruppi amminici della proteina esistono in equilibrio tra l'ammina libera e l'acido coniugato, equilibrio regolabile tramite il pH. L'intervallo di pH ottimale per questa reazione d.......

Discussione

L'assegnazione dei segnali NMR di ¹³proteine C-metilate in modo riduttivo è necessaria per utilizzare appieno questo metodo di marcatura isotopica. L'uso della MS per facilitare l'assegnazione dei segnali NMR attraverso la correlazione dei dati parziali di ^{incorporazione del C 13}è una tecnica promettente. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di assegnazione è che è necessaria solo la sequenza di amminoacidi primari. Il metodo di assegnazione assistita da MS è limitato quando l'amm.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetonitrile	Sigma	34851
Filtro centrifugo Amicon Ultra 4 ml (3k MWCO)	Fisher Scientific	UFC800308 (8pk)
Aminopeptidasi	Creative Biomart	Aminopeptidasi-86A
Bicarbonato di ammonio	Sigma	A6141
Solfato di ammonio	Sigma	A5132
Complesso borano-dimetilammina	Sigma	180238	Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.
Acido borico	Sigma	B6768
Insulina pancreas bovina	Sigma	I5500
C18 Colonne di rotazione	Thermo Scientific	89870
Ossido di deuterio	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-4-100
1,2-dicloroetano-13C2	Sigma	714321	Soluzione madre da 80 mM conservata a -80 °C. Utilizzata come riferimento negli spettri NMR a 24 mM.
Formaldeide (36,5% in peso/peso)	Sigma	33220	Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.
13C-formaldeide (99%)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-806-1	Preparare una soluzione fresca 1 M prima dell'uso.
Lisozima (albume d'uovo di gallina)	Sigma	L6376
Sodio fosfato (eptaidrato bibasico)	Sigma	S9390
Sodio fosfato (monobasico)	Sigma	S9638
Tricine	Sigma	T0377
Acido trifluoroacetico	Sigma	302031
700 MHz Varian VNMRS con sonda HCN 5922 da 5 mm	Agilent Tecnologie
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF	Bruker