Articolo metodologico

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

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DOI:

10.3791/50880

⸱

18 novembre 2013

 , 
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

In questo articolo

Sommario

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Abstract

Un recente lavoro dimostra che il sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e tumorigenesi coinvolge popolazioni di cellule staminali (SCS) residenti all'interno del cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi di queste cellule normalmente quiescenti impiegano per assicurare il corretto funzionamento delle reti neurali, così come il loro ruolo nel recupero da un infortunio e la mitigazione dei processi neurodegenerativi sono poco capito. Queste cellule risiedono nelle regioni denominate "nicchie" che forniscono un ambiente di sostegno che coinvolgono i segnali modulanti sia dal vascolare e immunitario. L'isolamento, la manutenzione e la differenziazione di CS del sistema nervoso centrale in condizioni di coltura definite che escludono fattori sconosciuti, li rende accessibili al trattamento con mezzi farmacologici o genetici, fornendo così spaccato il loro comportamento in vivo. Qui offriamo informazioni dettagliate sui metodi per la generazione di colture di SC SNC da regioni distinte del cervello adulto e approcci per valutare la loro dpotenziale ifferentiation in neuroni, astrociti, oligodendrociti e in vitro. Questa tecnica produce una popolazione omogenea di cellule come una coltura monostrato che può essere visualizzato per studiare individuale SC e la loro progenie. Inoltre, può essere applicato a diversi sistemi modello animale e campioni clinici, utilizzato in precedenza per prevedere le risposte di rigenerazione nel sistema nervoso adulto danneggiato.

Introduzione

Il dogma centrale della neurobiologia, stabilito dalle osservazioni fondamentali del citoarchitettura cervello fatto da Ramón Y. Cajal oltre un secolo fa, ha dichiarato che la neurogenesi è improbabile dopo l'adolescenza data la complessità delle reti neurali presenti nel sistema nervoso centrale 1. Nonostante il lavoro di Altman nel 1960, e successivamente Kaplan, dimostrando che 3 H-timidina è stato trovato in neuroni maturi che indicano che in realtà neuroni venivano generati in zone distinte del cervello adulto, il dogma continuato a tenere 2, 3. La prova ha continuato a montare con la ricerca di Nottebohm descrivere i cambiamenti stagionali nel numero di neuroni presenti nel cervello Songbird 4. Non è stato fino al 1999, quando Gould et al. Lavoro pubblicato sulla generazione di neuroni nell'ippocampo aumenta con l'esecuzione di compiti di apprendimento associativo nel ratto, nonché le osservazioni di Kornack e Rakic ​​dimostrazioneting continuato neurogenesi nel macaco adulto che il concetto di una meno rigida, cervello più plastico, è stato riconosciuto 5, 6.

La ricerca della sorgente cellulare di questi neuroni de novo generati portato alla scoperta di una popolazione discreta di cellule staminali (SC) che risiedono in aree del cervello denominato nicchie 7. La zona subventricular e sub zona granulari dell'ippocampo sono considerate le due principali regioni neurogenici 8,9. Le cellule isolate da questi luoghi mostrano la classica caratteristica del SCs derivate embrionali o fetali, self-renewal e potenziale di differenziazione. Nel caso di cellule staminali neurali (NSC), possono essere differenziati in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Inoltre, questi SC macchia positivo per fetali marcatori NSC come il filamento intermedio proteina nestin 10. Lavori più recenti sottolinea che SC potrebbero non essere limitate a queste two aree, e sono infatti localizzati in tutto il cervello come una popolazione in gran parte quiescente di cellule strettamente associati al sistema vascolare 11.

Le osservazioni che la SCS sono mobilitati in risposta al danno suggerisce la possibilità di essere in grado di utilizzare queste cellule per scopi rigenerativi per aiutare nel recupero dalla malattia neurodegenerativa e ictus 12, 13. Questo non è dissimile il ruolo che le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono nella guarigione dei tessuti connettivi, che si trovano come cellule perivascolari che hanno il potenziale di diventare osteoblasti, condrociti e cellule adipose 14. Tuttavia, NSC non possono essere raccolti nello stesso modo come MSC da midollo osseo di aspirazione routine e densità gradiente tecniche di centrifugazione e successivamente utilizzati in terapie cellulari basate autologhe. Di conseguenza, altre fonti di cellule, come l'uso di cellule staminali neurali fetali e precursori neuronali derivate da embLe cellule staminali ryonic sono state ampiamente esplorate in malattie animali e modelli di pregiudizio con vari gradi di successo 15. Tecnologie di cellule staminali pluripotenti indotte che utilizzano fonti di cellule somatiche offrono un'altra viale potenziale per la produzione di terapie cellulari terapeuticamente utili per una vasta gamma di applicazioni, superando la limitata disponibilità e preoccupazioni etiche riguardanti l'uso di cellule embrionali e tessuti fetali 16. Tuttavia, la traduzione clinica di questi risultati ha dimostrato di essere un compito difficile, come dimostrato nelle lotte di trattamento di varie condizioni neurologiche con terapeutico basato-SC approcci 17,18, così come un percorso tortuoso di gioco regolamentare. Come approccio alternativo, l'introduzione di specifici trattamenti farmacologici in grado di modulare i numeri NSC e facilitare il recupero in modelli di malattia di Parkinson e ictus 19. Qualunque sia la strategia potrebbe essere, capire come manipolare efficacemente queste cellulerichiede un sistema accessibile in vitro.

Culture del NSC possono essere eseguite sia come culture aggregati, noto anche come neurosfere, o come un monostrato 8,20. Entrambe le tecniche sono stati ampiamente utilizzati, permettendo la creazione di condizioni di coltura definiti, cioè uso di Epidermal Growth Factor (EGF) o fattore fondamentale di crescita dei fibroblasti (bFGF) come fonte mitogeno, che prevedono l'espansione di precursori multipotenti. Mentre colture di neurosfere può essere più adatto per studiare capacità propagazione clonale di un tipo di cellula isolata, il sistema ha dimostrato di produrre una popolazione mista di cellule durante l'espansione 21. Inoltre, la struttura chiusa di neurosfere rende manipolazione farmacologica delle cellule impraticabile, e l'interpretazione dell'influenza questi fattori possono avere potrebbe essere confuso a causa del microambiente stabilito nella neurosfere stesso. Colture monostrato, d'altro canto, possono essereimpiegato in schermi ad alta produttività di librerie di piccole molecole, fornendo un potente strumento per esplorare i meccanismi di trasduzione del segnale che regolano la crescita e la differenziazione SC e si apre la possibilità di scoprire nuovi composti che colpiscono specificamente questa popolazione di cellule.

Di conseguenza, la capacità di generare riproducibile colture di NSC adulte provenienti da diverse regioni di interesse nel cervello può essere utilizzato in una vasta gamma di applicazioni di ricerca comprendono studi di sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS) per esplorare nuovi approcci di medicina rigenerativa . Il protocollo presentato qui dimostra come sezionare e valutare il potenziale di differenziazione della SC SNC isolate dal cervello di roditori adulti.

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Protocollo

Il lavoro aderisce alla Dichiarazione di Helsinski e l'animale dichiarazione ARVO. Gli animali sono stati impiegati per la raccolta dei tessuti e tutti i metodi pertinenti sono state seguite secondo le istruzioni del stabulario dell'Università di Dresda. Gli animali sono stati maneggiati e custoditi secondo le linee guida federali tedesche per l'uso e la cura degli animali da laboratorio, e lo studio è stato approvato dal Landesdirektion Dresda. Si prega di consultare la politica veterinaria del proprio istituto (IACUC o l'altro bordo) per quanto riguarda una metodologia appropriata e l'eutanasia.

Azione specifica e le concentrazioni di lavoro dei reagenti possono essere trovati nelle tabelle reagenti che accompagnano questo protocollo.

1. Culture Dish Preparazione

  1. Piatti cappotto con un volume sufficiente di 75 ug / ml di poli-L-ornitina (cioè 2 ml / pozzetto di una piastra da 6 pozzetti) durante la notte in incubatrice coltura cellulare 2 giorni prima della data dissezione programmata.
  2. Aspirare il poli-L-ornitina giorno lavare i pozzetti 2x con 3 ml di PBS per 5 min seguente.
  3. Rimuovere il lavaggio finale, quindi aggiungere la fibronectina (diluito 1:250, 4 mg / ml in PBS) alla piastra e posizionare i piatti in incubatrice durante la notte.
  4. Aspirare il fibronectina il giorno della dissezione e lavare i piatti 2x con PBS. Riportare le piastre ancora contenenti la finale PBS lavare per l'incubatore fino a quando il tessuto dissociato è pronto per la coltura. A quel tempo, togliere la PBS prima di placcatura del tessuto.
  5. Conservare le piastre rivestite con poli-L-ornithinein l'incubatrice per un massimo di 3 settimane. Piastre rivestite con fibronectina possono essere conservati per un massimo di 1 settimana. Fibronectina rivestimento può essere fatto in meno di 2 ore se urgente. La fibronectina è suscettibile di denaturazione, non agitare la soluzione o lasciare asciugatura delle stoviglie.

2. Dissection / placcatura

  1. Questo protocollo si applica all'uso di 3 ratti adulti (3-6 mesi di età).
  2. Chill cervello di sezionamento blocco di ghiaccio prima di eutanasia ratto.
  3. Posizionare un tubo Falcon da 15 ml che contiene 5 ml di N2 media con aggiunta di bFGF sul ghiaccio.
  4. Euthanize i ratti in base alla politica veterinaria dell'istituto.
  5. Rimuovere il cervello dal cranio facendo un'incisione lungo la linea mediana della testa. Utilizzare pinze a staccarsi l'osso permettendo al cervello di essere attentamente estratto.
  6. Mettere il cervello in un piatto di 10 centimetri di Petri contenente ghiacciata PBS. Questo consente di eliminare ogni residuo di capelli e di sangue. (Figura 1A)
  7. Mettere il cervello nel blocco sezionamento refrigerata. (Figura 1B)
  8. Inserire una nuova lama di rasoio pulito nel blocco, come illustrato nella figura 1C.
  9. Inserire una seconda lama di rasoio pulito 3 millimetri caudale al primo, come illustrato nella Figura 1D.
  10. Sollevare delicatamente le lame dal blocco, portando con loro la sezione di interesse.
  11. Float l'secZIONE fuori la lama immergendolo in PBS. (Figura 1E)
  12. Tessuto raccolto dalla zona di interesse (in questo esempio abbiamo usato commessura anteriore, (anteriore) ACA, Figura 1F) utilizzando # 5 pinze raccogli in una provetta conica da 15 ml contenente 1 ml di mezzo contenente N2 bFGF.
  13. Spostare il tubo in una cappa a flusso laminare coltura cellulare, continuando il resto del protocollo in condizioni sterili.
  14. Meccanicamente dissociare il tessuto con una punta di pipetta 1 ml collegato a una pipetta P1000. Pipetta su e giù diverse volte (circa 20x ad una velocità di 1 ciclo di pipettaggio al secondo) mentre si preme l'apertura della punta della pipetta contro il fondo della provetta conica (figure 1-3) 1G. Smettere di triturazione quando la soluzione diventa omogenea.
  15. Lasciare agire la soluzione per 2 minuti per consentire qualsiasi tessuto nondissociated più grande per depositarsi sul fondo. (Figura 1G 4)
  16. Raccogliere il homogendell'EOUS surnatante e posto in una provetta contenente 8,5 ml di mezzi N2 più 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 e 200 nMJAK inibitore.
  17. Li piastra in 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 3 ml di soluzione diluita di cellule / e.
  18. Porre la piastra in un incubatore umidificato a cella 37 ° C, 5% CO 2, 5% O 2.

3. Manutenzione giornaliera

  1. Sostituire il supporto sulle piastre di coltura con N2 Piano contenenti bFGF, Ang2, Dll4, e JAK inibitore 24 ore dopo la placcatura.
  2. Aggiungere un bolo di bFGF, Dll4, Ang2, e l'inibitore JAK il giorno successivo.
  3. Continuare questo processo alternato di cambiamenti dei media e integrazioni fattore per un totale di 10-14 giorni.

4. Induzione di differenziazione

  1. Ritirare bFGF, Dll4, Ang2, e JAK inibitore contenente il mezzo e sostituirlo con mezzo N2 che non contiene elementi aggiuntivi.
  2. Cambia il mezzo ogni secondo giorno.
  3. Fissare le cellule dopo 10 giorni ed effettuare immunocitochimica.

5. Rilevamento immunocitochimico

  1. Aspirare il mezzo e il fissaggio delle piastre di coltura cellulare con 2 ml di paraformaldeide al 4% per 20 min.
  2. Lavare 2x con 3 ml di PBS per 5 min ciascuno.
  3. Aspirare il PBS, poi permeabilize e bloccare le cellule aggiungendo 2 ml di PBS contenente 5% di siero normale asino (NDS) e 0,1% Triton X-100 per 20 min.
  4. Preparare la miscela di anticorpo primario in PBS contenente 5% NDS. Anticorpo anti-nestin può essere utilizzato per identificare SC, mentre TUJ1 (classe III β-tubulina), anticorpi GFAP, e CNPase possono essere utilizzati insieme per una colorazione tripla di marcatori di differenziazione.
  5. Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 1,5 ml della miscela anticorpo primario a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 90 min.
  6. Rimuovere gli anticorpi primari e lavare 2x con 3 ml di PBS, e 1x con 3 ml di PBS contenente 5% NDS per 5 minuti ciascuna.
  7. Prepae gli anticorpi secondari in PBS contenente 5% NDS.
  8. Aspirare il lavaggio finale e aggiungere 1,5 ml di soluzione di anticorpo secondario in ciascun pozzetto. Incubare al buio per 40 minuti a temperatura ambiente.
  9. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e aggiungere 2 ml di una macchia DAPI preparata (500 ng / ml in PBS). Incubare per 3 min.
  10. Aspirare la soluzione DAPI poi lavare 3x con 3 ml di PBS per 5 minuti ciascuna. Le cellule possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza.

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Risultati

Identificare la regione di interesse che per raccogliere le cellule staminali neurali è il primo punto critico e definirà la quantità di tempo necessario per ottenere un piatto confluenti di cellule. Ad esempio, la SVZ è una zona neurogena classico e ha quindi una relativa proporzione elevata di cellule staminali neurali. Tuttavia, la tecnica qui presentata può essere utilizzato con altre regioni spesso non riconosciuti come aventi un potenziale neurogena robusto nell'età adulta. Ai fini del presente protocollo, abb...

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Discussione

Molti dei passaggi critici all'isolamento successo, l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali neurali dal cervello adulto sono condivise in comune con le tecniche di coltura di tessuti standard. L'obiettivo da tenere a mente è che le cellule staminali neurali isolate dal cervello adulto dovrebbe mantenere come molti dei loro caratteristiche in vivo come possibile (Figura 2J). Spesso un equilibrio tra la necessaria prudenza e velocità adeguata deve essere colpito. Ma...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato (in parte) dal Helmholtz Alliance ICEMED - Imaging e Malattie Metaboliche polimerizzazione ambientale, attraverso il Fondo Initiative e la rete dell'Associazione Helmholtz, una sovvenzione dalla Else Kroener-Fresenius Foundation, e un finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: cellule in tessuti).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzettiBD Biosciences353934
Poli-L-ornitinaSigma-AldrichP-3655

5 mg/ml soluzione madre preparata in acqua distillata doppia (stabile per diversi mesi a -20 ° C).

Concentrazione di lavoro 0,5 mg/ml in acqua (stabile per 1 mese a 4 gradi; C).

FibronectinaR& D Systems1030-FnNon agitare la soluzione madre
Apparecchio di filtrazioneCorning Life Sciences430769
DMEM/F-12Mediatech10-090-CVVedere la nota seguente per la preparazione completa del terreno N2
Apo-transferrinaSigma-AldrichT-2036
InsulinaSigma-AldrichI-0516
PutrescinaSigma-AldrichP-57801 M soluzione stock in ddH2O (stabile a 20 gradi; C per 6 mesi)
Selenito di sodioSigma-AldrichS-5261500 µ Soluzione madre M in ddH2O (stabile a -20 ° C per 6 mesi)
ProgesteroneSigma-AldrichP-8783100 µ Soluzione madre M in etanolo (stabile a -20° C per 6 mesi)
Penicillina/streptomicinaInvitrogen15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfatoMediatech21-040-CV
Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF)R& D Systems233-FBConcentrazione di lavoro 20 ng/ml 
Delta4 (Dll4)R& D Systems1389-D4Concentrazione di lavoro  500 ng/ml
Angiopoetina 2 (Ang2)R& D Systems623-ANConcentrazione di lavoro  500 ng/ml
Inibitore JAKCalbiochem420099Concentrazione di lavoro 200 nM 
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA-2058
Provette coniche da 15 e 50 mlCorning Life Sciences430053, 430829
Altri articoli necessari includono: Strumenti di dissezione generale, tra cui lama di rasoio e pinze, Ratto adulto (3-6 mesi; Sprague-Dawley o Long Evans), camera di intossicazione CO2, Cappa a flusso laminare per colture cellulari e incubatore Incubatore (umidificato, 37 °C) C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Per la preparazione completa dei terreni N2, a un flacone di DMEM/F-12 (500 ml) aggiungere 0,05 g di apotransferina, 0,0125 g di insulina (appena predisciolta in 1 ml di 10 mM di NaOH), 50 μ l di putrescina, 30 μ l di selenito di sodio, 100 μ l di scorte di progesterone e 5 ml di soluzione di penicillina/streptomicina. Regolare il pH a 7,2, se necessario. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 gradi C per un massimo di 3 settimane e proteggere dalla luce.
Tabella dei reagenti per immunofluorescenza Microscopia
ParaformaldeideScienze15719
Siero d'asino normale (NDS)Sigma-AldrichD-9663
Triton X-100Sigma-AldrichT-8787
4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Sigma-AldrichD-84175 mg/ml stock soluzione in metanolo
Tabella degli anticorpi primari
NestinChemiconMAB353

Fattore di diluizione: 1:400

Specie: Topo IgG1

Hes3Santa Cruzsc-25393

Fattore di diluizione: 1:100

Specie: IgG di coniglio

Sox2R& Sistemi DMAB2018

Fattore di diluizione: 1:100

Specie: IgG2a di topo

CNPasiChemiconMAB326

Fattore di diluizione: 1:200

Specie: IgG1 di topo

β-tubulina III (TUJ1)R& Sistemi DMAB1195

Fattore di diluizione: 1:500

Specie: IgG2a di topo

Proteina acida fibrillare gliale (GFAP)Dako North AmericaZ0334

Fattore di diluizione 1:500

Specie: Coniglio

Tabella degli anticorpi secondari
Alexa    568InvitrogenA-21124

Fattore di diluizione: 1:200

Specie: Capra anti Topo IgG1

Alexa 488InvitrogenA-21131

Fattore di diluizione: 1:200

Specie: Capra anti Topo IgG2a

Cy5Jackson ImmunoResearch59883

Fattore di diluizione: 1:200

Specie: Capra anti coniglio

elettronica

Riferimenti

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