Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Sommario

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica e riproducibile per isolare colture primarie di cellule muscolari lisce delle arterie polmonari (PASMC) da topi giovani come P7, consentendo in tal modo una migliore studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione delle cellule muscolari lisce neonatale e relax.

Abstract

L'ipertensione polmonare è una causa importante di morbilità e mortalità nei neonati. Storicamente, sono stati fatti significativi studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione del muscolo liscio vascolare in PASMC di pecora fetale. Mentre pecore fanno un eccellente modello di ipertensione polmonare termine, sono molto costosi e non hanno il vantaggio di manipolazione genetica presente nei topi. Viceversa, l'incapacità di isolare PASMC da topi era una limitazione significativa di tale sistema. Qui abbiamo descritto l'isolamento di colture primarie di topo PASMC da P7, P14, P21 e topi utilizzando una variazione della tecnica precedentemente descritta di Marshall et al. ²⁶ precedentemente utilizzato per isolare ratto PASMC. Questi PASMC murino rappresentare un nuovo strumento per lo studio delle vie di segnalazione nel periodo neonatale. Brevemente, un impasto di 0,5% (w / v) di agarosio + 0,5% di particelle di ferro in M199 media sta infuse nel letto vascolare polmonare attraverso il ventricolo destro (RV). Gliparticelle di ferro sono 0,2 micron di diametro e non possono passare attraverso il letto capillare polmonare. Così, le logge di ferro nelle piccole arterie polmonari (PA). I polmoni sono gonfiati con agarosio, rimosso e dissociato. I vasi contenenti ferro sono tirato giù con una calamita. Dopo collagenasi (80 U / ml) e l'ulteriore trattamento dissociazione, i vasi vengono posti in coltura tissutale in piatto M199 terreni contenenti il ​​20% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotici (M199 mezzi completi) per consentire la migrazione delle cellule nel piatto di coltura . Questa piastra iniziale di cellule è una miscela 50-50 di fibroblasti e PASMC. Così, la discesa procedura è ripetuta più volte per ottenere una popolazione PASMC più puro e rimuovere eventuali residui di ferro. Smooth identità delle cellule muscolari è confermata da immunoistochimica per la muscolatura liscia e miosina desmin.

Introduzione

Ipertensione polmonare è normale durante la vita intrauterina poiché la placenta funge da organo principale di scambio di gas e solo il 10% della gittata cardiaca viene fatto circolare attraverso il letto vascolare polmonare. In utero, pressione polmonare sono simili alle pressioni sistemiche dovute a elevata resistenza vascolare polmonare . Come gestazione progredisce, vi è una rapida crescita del piccolo PA all'interno del polmone, preparando il feto per il drammatico aumento del flusso sanguigno polmonare che si verifica alla nascita ^1. Quando la normale transizione perinatale fallisce nei neonati a breve termine e pieno termine, il risulta....

Protocollo

La cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Northwestern University hanno approvato questo protocollo.

1. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day One

1. Preparare i completi M199 media - Mix 400 ml M199 con 100 ml (concentrazione finale = 20%) di calore FBS inattivato e 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina.
2. Preparare i livelli di free M199 Media - Mix 500 ml M199 con 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina.
3. Preparare la PA agarosio - Mix 0,05 g di agarosio, più 0.05 g particelle di fe....

Risultati

Durante e dopo l'isolamento, PASMC sono esaminate sia al microscopio ottico e da immunoistochimica per marcatori di cellule muscolari lisce. Al microscopio ottico all'inizio del protocollo, PASMC sono visti migrazione sulla cultura piatto tessuto dal piccolo ferro contenente vasi (Figura 1A). Dopo la messa in comune piastre da uno a tre il giorno tredici, poi le particelle di ferro non sono più visti come quelli che sono stati tirati fuori nella fase finale di messa in comune. Invece, una popola.......

Discussione

In questo manoscritto, si descrive per la prima volta l'isolamento di PASMC da topi a P7, P14, e P21. Per ottenere questo risultato, un impasto di agarosio e 0,2 particelle di ferro m sono infusa attraverso il camper nella PA. A causa della piccola dimensione delle particelle di ferro, non possono passare attraverso il letto capillare polmonare e sono quindi depositati nel piccolo PA. I polmoni sono gonfiati, rimossi e dissociato. I vasi contenenti ferro sono estratti di soluzione con un magnete. In definitiva, i va.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Manico per lama chirurgica Bard Parker	BD	371030
Lame chirurgiche in acciaio inossidabile #10 (sterili)	Siringhe Miltex	4-310
(3 ml e 5 ml, sterili)	Aghi BD	309657 e 306646
(27 G, sterili)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterili)	BD	381412
Monoject cannula smussata (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Suture Fisher	Scientific	NC9782896
Collettore di particelle magnetiche dinali	Invitrogen	120-01D	Questo è uno strumento fondamentale per il protocollo.
Piastre per colture tissutali (35 mm, 60 mm e 10 cm, sterili)	BD	353001, 353004 e 353003	Qualsiasi marca di piastre per colture tissutali va bene.
Forbici dell'iride (acciaio inossidabile da 4 ½ pollici)	American Diagnostic Corporation	3424
Pinze (acciaio inossidabile da 4 pollici)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillina/streptomicina	VWR	TX16777-164NWU
Siero fetale bovino	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Inattivazione del calore a 55 gradi C per 45 min. Per coerenza nei risultati, abbinare tutti i sieri e ottenere dallo stesso fornitore.
Particelle di ferro (polvere di ossido di ferro (II, III)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarosio	Sigma	A9539
Collagenasi (prodotto a 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurano	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U con una fotocamera fotometrica a cascata a 12 bit	Nikon	TE2000-U	Qualsiasi buon microscopio ottico andrà bene per osservare la PASMC in coltura.
Anticorpo anti-desmina	Sigma	D-8281	Utilizzare a diluizione 1:200 per l'immunocolorazione.
Miosina muscolare liscia	Biomedical Technologies	BT-562	Utilizzare a diluizione 1:2.000 per l'immunocolorazione.
Sonde molecolari	secondarie anti-coniglio rosso rodamina	R-6394	Utilizzare a diluizione 1:200 per l'immunocolorazione.
Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse TE-300 e fotocamera digitale Cool Snap	Nikon	TE300	Qualsiasi buon microscopio a epifluorescenza andrà bene per l'immunocolorazione.
Kit per il dosaggio della fosfodiesterasi nucleotidica ciclica	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	Questo è l'unico test colorimetrico dell'attività enzimatica PDE disponibile.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	Un inibitore selettivo della PDE5 è necessario per l'attività dell'enzima PDE per determinare la specificità dell'idrolisi cGMP.

/ Invitrogen