Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione.
In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l'elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.
Introduzione
Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell'ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali.
1. Postnatale elettroporazione
1.1. Preparazione di vetro Capillari, Soluzione DNA e Elettroporatore
- Preparare capillari tirato vetro (OD: 1,5 millimetri, ID: 0,86 millimetri) per l'iniezione di DNA. (Impostazioni indicativi per una capillare estrattore Sutter P-97 sono: Heat 283; Tirare 50; Velocity 90; ora 50). Fare un segno ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Etichettatura dei neuroblasti migratori SVZ-derivati può essere osservato lungo le RMS, di solito 4-8 giorni dopo il elettroporazione di successo (Figura 1B). Punti di tempo più lunghi possono anche essere scelti, ma meno cellule si trovano nelle RMS poiché la maggior parte di loro sono entrati nel OB. Neuroblasti cominciare ad acquisire tipica morfologia e le caratteristiche di cellule granulari mature nella OB intorno 2-3 settimane dopo l'elettroporazione (non mostrato). Dopo coltura per ~ 1 ora.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l'OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Piatto di coltura con fondo in vetro | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Terreni bilanciati Gey's | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucosio, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/ Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplemento | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutammina | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (senza rosso fenolo) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Capillari in vetro per iniezione | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Tubo aspiratore | Sigma | A5177 | |
| Estrattore capillare Sutter P-97 | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Elettroporatore a onda quadra | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Pinzetta in platino 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Interruttore a pedale Modello 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel per elettrodi | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurano | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratomo | Leica | VT1000S | |
| Colla | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX sistema di dischi rotanti | Perkin Elmer | Configurazione personalizzata (è possibile utilizzare più sorgenti laser) dotata di telecamera CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B | |
| Software Volocity | Perkin Elmer | Moduli di acquisizione, quantificazione e visualizzazione Camera | |
| ambientale per microscopia | Solent Scientific | Microscopio | |
| invertito Ti-E | Nikon | L'obiettivo CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA è consigliato per l'applicazione descritta in questo documento |
Riferimenti
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
