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Articolo metodologico

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

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⸱

DOI:

10.3791/50905

⸱

25 novembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

Abstract

La zona subventricolare (SVZ) è uno dei principali nicchie neurogenici nel cervello postnatale. Qui, progenitori neurali proliferano e danno luogo a neuroblasti in grado di muoversi lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) verso il bulbo olfattivo (OB). È necessaria Questa migrazione a lunga distanza per la successiva maturazione dei nuovi neuroni nel OB, ma i meccanismi molecolari che regolano questo processo sono ancora poco chiare. Indagare le vie di segnalazione che controllano la motilità neuroblast può aiutare non solo a capire un passo fondamentale nella neurogenesi, ma hanno anche terapeutico potenziale rigenerativo, data la capacità di questi neuroblasti per indirizzare siti cerebrali colpite da lesioni, ictus, o la degenerazione.

In questo manoscritto si descrive un protocollo dettagliato per l'elettroporazione in vivo postnatale e conseguente time-lapse imaging della migrazione neuroblasti nelle RMS del mouse. Elettroporazione postnatale può efficacemente transfect SVZ progenitorecellule, che a loro volta generano neuroblasti migrano lungo le RMS. Utilizzando la microscopia confocale spinning disk time-lapse sulle culture acuti fetta cervello, la migrazione neuroblasti può essere monitorato in un ambiente molto simili alla condizione in vivo. Inoltre, neuroblast motilità possono essere monitorati e analizzati quantitativamente. Come esempio, si descrive come utilizzare in vivo postnatale elettroporazione di un plasmide GFP che esprimono per etichettare e visualizzare neuroblasti migrano lungo le RMS. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprime plasmidi in topi knockout condizionali che impiegano il sistema loxP può anche essere utilizzato per geni di interesse bersaglio. Manipolazione farmacologica di culture acute fetta cervello può essere eseguita per studiare il ruolo di molecole di segnalazione diverse nella migrazione neuroblasti. Accoppiando in elettroporazione in vivo con time-lapse imaging, speriamo di comprendere i meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppozione di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

Introduzione

Nel cervello dei mammiferi, la generazione di nuovi neuroni (neurogenesi) si verifica dopo la nascita principalmente in due regioni, la zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali e la zona subgranulare nel giro dentato dell'ippocampo 1. Notevole prove raccolte negli ultimi anni sostiene un ruolo fondamentale per la neurogenesi postnatale in funzioni di memoria lampadina ippocampo e olfattive 1-3. È importante sottolineare che la neurogenesi postnatale detiene anche potenziale terapeutico a causa della sua relazione con malattie neurologiche degenerative, e la capacità di neuroblasti di migrare verso siti danneggiati nel cervello 4-6.

La zona subventricolare (SVZ) ha recentemente emerso come una nicchia neurogena cruciale. Neuroblasti SVZ-derivati ​​migrano verso il bulbo olfattivo (OB) attraverso il flusso migratorio rostrale (RMS), rendendo questo il processo di migrazione più lunga del 1,7,8 cervello postnatale. Il / RMS / sistema OB mammiferi SVZ è diventato unmodello utile per studiare varie fasi neurogenesi, quali la proliferazione, migrazione e differenziazione 1,8. Molti fattori di crescita e segnali extracellulari regolano la neurogenesi SVZ e la migrazione lungo le RMS, ma i meccanismi molecolari intracellulari sono ben lungi dall'essere pienamente compreso 1,9. La corretta migrazione lungo le RMS è di fondamentale importanza per la successiva maturazione dei neuroni neonati 10. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che neuroblasts SVZ-derivate possono uscire dalle RMS a siti lesioni cerebrali 4-6,11-13. Così, indagando la migrazione neuroblasti meccanismi di segnalazione di regolazione è fondamentale non solo per capire neurogenesi, ma anche per le potenziali applicazioni terapeutiche.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per etichettare progenitori neurali SVZ da elettroporazione in vivo postnatale e monitorare la loro migrazione lungo le RMS culture acuti fetta cervello usando time-lapse confocale disco rotante microscopy. L'elettroporazione è ampiamente usato in studi sullo sviluppo embrionale da a stadi adulti 14-18. Si tratta di un potente strumento per indirizzare e manipolare progenitori neurali SVZ e rappresenta un'alternativa più economica e molto più veloce di iniezione stereotassica di vettori virali o generazione di modelli transgenici 1,15,19,20. Si tratta di una procedura relativamente semplice che non richiede l'intervento chirurgico e ha alti tassi di sopravvivenza. Elettroporazione di shRNA o CRE-ricombinasi esprimono plasmidi in modelli genetici di topo che impiegano il sistema loxP può essere utilizzato per indirizzare i geni di interesse o per ottenere l'etichettatura permanente dei progenitori SVZ, rappresentando così uno strumento utile per gli studi di neurogenesi adulta 21,22.

Imaging RMS migrazione neuroblasti nel cervello intatto è ancora difficile a causa di limitazioni tecniche. Tuttavia, questo processo può essere monitorato tramite disco confocale spinning time-lapse microscopia di fette di cervello acuto, che forniscono un adeguato system molto simili alla condizione in vivo anche suscettibili di manipolazione farmacologica 23,24. Accoppiamento elettroporazione in vivo postnatale con time-lapse imaging faciliterà la comprensione dei meccanismi molecolari che controllano neuroblast motilità e contribuire allo sviluppo di nuovi approcci per promuovere la riparazione del cervello.

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Protocollo

Questa procedura è in conformità con i regolamenti interni del Regno Unito Office (Procedure di animale scientifici Act, 1986). Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite e approvate dalle loro organizzazioni di regolamentazione nazionali o istituzionali animali.

1. Postnatale elettroporazione

1.1. Preparazione di vetro Capillari, Soluzione DNA e Elettroporatore

  1. Preparare capillari tirato vetro (OD: 1,5 millimetri, ID: 0,86 millimetri) per l'iniezione di DNA. (Impostazioni indicativi per una capillare estrattore Sutter P-97 sono: Heat 283; Tirare 50; Velocity 90; ora 50). Fare un segno sul capillare corrispondente ad un volume di circa 2 ml.
  2. Impostare la tensione del elettroporatore a 5 impulsi quadrati, 50 msec / impulso a 100 V, con intervalli di 850 msec (100 V, impulso ON 50 msec, impulso OFF 850 ​​msec, impulsi 5).
  3. Diluire elevata purezza (OD 260/280> 1,80) privo di endotossine DNA plasmidico ad una concentrazione finale di 1-2 mg / mLcon endotossine liberare tampone Tris-EDTA o PBS. Si consiglia di aggiungere 0,1% Verde veloce per la soluzione di DNA (il colorante si diffonda nel ventricolo quando iniettato con successo).
  4. Preparare gli elettrodi 5-7 mm, il gel dell'elettrodo e riscaldare il rilievo di riscaldamento.

1.2. Elettroporazione

  1. Rimuovere un postnatale giorno 2 del mouse cuccioli da gabbia e anestetizzare che per inalazione isoflurano (in un flusso di ~ 0,6 L / min).
  2. Dopo circa 1 min, determinare lo stato di anestesia utilizzata la risposta piede pinch. Se si verifica nessun movimento, procedere con l'iniezione intraventricolare.
  3. Caricare ago capillare con 1-2 ml di DNA utilizzando un tubo aspiratore collegato al capillare.
  4. Sotto una sorgente di luce fredda, tenere la testa del cucciolo tra il pollice e l'indice della mano meno dominante. Leggermente tirare indietro la pelle sulla testa per aiutare l'identificazione del punto di iniezione di destra.
  5. Si consideri una linea virtuale tra l'occhio e tegli craniometrico punto di riferimento lambda (Figura 1A). Inserire l'ago capillare a circa un terzo della lunghezza di questa linea dalla lambda (circa 1 mm dal punto centrale linea 15). Inserire il capillare circa 2 mm di profondità, avendo cura di evitare la penetrazione in profondità nel cervello.
  6. Iniettare plasmide soffiando lentamente attraverso la bocca (una siringa collegata al capillare può anche essere utilizzato). Durante questa procedura, assicurarsi che le dita non stanno applicando troppa pressione sul cervello, in quanto questo può impedire iniezione plasmide successo.
  7. Arrestare iniezione quando una quantità minima di soluzione di DNA viene lasciato nel capillare. E 'opportuno iniettare meno di 1 ml per evitare deleterio aumento della pressione intracranica.
  8. Coat entrambi gli elettrodi con gel e posizionarle con il lato positivo sul lato laterale dell'emisfero in cui il DNA è stato iniettato (Figura 1A). Per l'incorporazione nel DNA rostrale SVZ, posto gli elettrodi leggermente rostrale alpunto di iniezione. Variando la posizione degli elettrodi può raggiungere specificità regionale di elettroporazione in diverse aree del SVZ 22,25.
  9. Avviare il trasferimento corrente premendo il pedale del pedale a impulsi. Quando l'elettroporazione è completa, controllare la tensione sul display elettroporatore (valori di tensione non deve essere inferiore a 90 V, in quanto i valori di tensione più bassa correlazione con scarsa efficienza elettroporazione).
  10. Rianimare il cucciolo sotto ossigeno a rilievo di riscaldamento per un paio di minuti e tornare alla gabbia, mettendo lontano dalla madre. Assicurarsi che la madre recupera il cucciolo e si riunisce con il resto della cucciolata. Dopo l'elettroporazione, lasciare i cuccioli con la madre per 4-7 giorni prima di passo successivo.

2. Preparazione delle Culture acuta del cervello Slice

2.1. Preparazione di soluzioni e strumenti

  1. Le seguenti soluzioni sono richiesti (è anche possibile utilizzare DMEM ad alto glucosio per dissezione e l'imaging17):
    Dissection Medium (500 ml)
    Supporti Balanced Gey - 500ml
    45% di glucosio - 5ml
    Movie Medio (10 ml)
    45% di glucosio - 0,110 ml
    HEPES 1 M - 0.100 ml
    Pen / Strep - 0.100 ml
    FCS - 0.500 ml
    B27 - 0.100 ml
    Glutammina - 0.200 ml
    Dulbecco Modified Eagle Medium (fenolo libero-rosso) - 8,89 ml
  2. Warm up medio di film a 37 ° C.
  3. Posizionare Millicell inserisce in un piatto di coltura inferiore 35 millimetri di vetro contenente 1 ml di terreno di film e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2.
  4. Preparare vibratome accessori (cacciavite, camera, lame di rasoio, colla).
  5. Preparare strumenti di dissezione: forbici, spatola, pinze diritte.
  6. Preparare gli strumenti per la gestione fette: piccolo pennello morbido o un'ansa da inoculo (dimensioni: 10 ml), pipette Pasteur di plastica, un contenitore di ghiaccio e vari piatti di plastica 6 centimetri.
  7. Preraffreddare il mezzo dissezionea 2-4 ° C.

2.2. Preparazione del cervello fette

  1. Riempire un piatto di 6 centimetri con mezzo dissezione preraffreddata e posizionarlo sul ghiaccio (per mantenere fette appena tagliate).
  2. A seguito di dislocazione cervicale, usare le forbici per decapitare il cucciolo mouse. Rimuovere il cuoio capelluto con un bisturi, tagliare il cranio, lungo la sutura sagittale dalla OB al cervelletto e rimuovere delicatamente i lembi cranici con pinze. Assicurarsi che l'intero cervello è esposto e con attenzione sezionare fuori con una spatola, facendo particolare attenzione a non danneggiare il tessuto. La dissezione deve essere fatto con attenzione, ma allo stesso tempo molto velocemente (meno di un minuto, se possibile). Dislocazione cervicale è il nostro metodo preferito perché anestesia terminali con anestetici farmaci / gas possono influenzare le proprietà migratorie dei neuroblasti e lo stato di salute del cervello fetta culture, che devono essere ripreso in tempi relativamente brevi seguente sacrificio di animali.
  3. Hemisect il cervello con un razo lama (Figura 2). Eliminare emisfero non iniettato o utilizzare per altri esperimenti.
  4. Posizionare un pezzo di nastro sul supporto vibratome e utilizzare la quantità minima necessaria di colla per attaccare l'emisfero cerebrale su di esso (Figura 2). Questo impedisce danneggiamento della superficie titolare causa di colla applicazioni ripetute.
  5. Lasciate asciugare la colla per alcuni secondi.
  6. Collocare supporto nel vassoio vibratome riempito con una soluzione di dissezione preraffreddata. Puntare il bulbo olfattivo verso la lama (Figura 2).
  7. Iniziare a tagliare l'emisfero cerebrale utilizzando le impostazioni appropriate. I seguenti parametri sono raccomandati: spessore di strato di 300 micron; velocità ~ 3-5; frequenza ~ 9. Alta frequenza e bassa velocità sono raccomandati per prevenire danni alla fetta.
  8. Raccogliere le fette con un piccolo pennello o un un'ansa da inoculo morbido. Tenere le fette solo con OB visibile (solitamente 2-3 fette / cervello). In genere, la fetta che contiene la maggior parte delle RMS can disponibile sul ~ 300 micron dalla superficie inferiore.
  9. Controllare le fette sotto un microscopio a fluorescenza standard per il segnale GFP (avendo cura di capovolgere su di loro per controllare la fluorescenza su entrambi i lati), e scegliere quelle che mostrano fluorescenza lungo la maggior parte delle RMS.

2.3. Coltura Fette cervello

  1. In una cappa di coltura cellulare, tagliare via il terzo più caudale della fetta cervello e rimuovere eventuali tracce di colla con una pinzetta diritte sottili o un bisturi microdissezione.
  2. Delicatamente aspirare la fetta con una pipetta Pasteur di plastica (tagliata la punta della pipetta per creare un'apertura più grande, questo eviterà di danneggiare la fetta) e collocarlo al centro di un Millicell preriscaldata inserto.
  3. Assicurarsi che il lato con il segnale fluorescente luminosa viene posta in contatto con il Millicell inserto (per l'imaging con un microscopio invertito).
  4. Rimuovere la soluzione dissezione eccesso sulla sommità dell'inserto con una pipetta.
  5. Lasciare culture fetta distabilirsi in un C 5% CO 2 incubatore 37 ° / per almeno per 1 ora prima di imaging.

3. Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti

  1. Almeno 2 ore prima di imaging, accendere il sistema Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocale filatura, invertito microscopio Nikon Ti-E, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) raffreddato CCD digitale, e il sistema di riscaldamento (Solent Scientific) impostato in costante temperatura di 37 ° C.
  2. Aprire il modulo di acquisizione software Volocity e fare clic sul pulsante "Viz" e selezionare il laser (s) per l'imaging.
  3. Entro 2 ore di cervello preparazione fetta, mettere il piatto fondo di vetro contenente la fetta cervello nella camera di imaging sul palco microscopio.
  4. Utilizzare un obiettivo Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 sotto la luce fluorescente appropriato per selezionare e mettere a fuoco l'area della sezione che verrà ripreso (ad esempio, la prima parte discendente della RMS subito dopo il sito di iniezione, o l'Elbow regione RMS, o subito dopo il gomito prima di neuroblasti entrare nel OB).
  5. Impostare il time-lapse imaging con le seguenti azioni:
    1. Al microscopio, fare clic sul pulsante L100 per consentire la scansione laser del campione.
    2. In Volocity, aprire la ULTRAVIEW Laser Changer selezionando il laser appropriato (ad esempio 488 nm laser per GFP).
    3. Impostare il tempo di esposizione (di solito tra 100-500 msec) e l'intensità del laser (di solito 20-30%) a seconda dell'intensità del segnale fluorescente.
    4. Regolare l'immagine guadagno digitale per migliorare la visualizzazione delle cellule.
    5. Selezionare l'intervallo di z-stack per l'immagine all'interno della fetta cervello (di solito nel corso di un intervallo di 100-120 micron). Scegliere un intervallo con un adeguato numero di cellule isolate per evitare possibili sovrapposizioni il più possibile (questo faciliterà la successiva analisi di inseguimento).
    6. Selezionare la spaziatura tra ogni immagine z-stack (di solito 2-4 micron).
    7. Scegliere il tempo di interval tra ogni cattura z-stack (ad esempio 3 min) e la durata totale di imaging (ad esempio 3 ore).
    8. Fare clic sull'icona "Salva" per salvare le modifiche ai parametri di imaging.
    9. Premere il pulsante di registrazione per iniziare imaging.
  6. Immagini alternate di campioni di controllo e sperimentali (per esempio veicolo / trattamento farmacologico o diversi plasmidi elettroporate) durante lo stesso giorno.

4. Analizzando neuroblasti migrazione

  1. Nel modulo Volocity Quantitation, aprire la libreria desiderata creato dopo aver completato un esperimento di time-lapse. Selezionare "Focus avanzata" dalla casella in alto a sinistra (Figura 4A, punto 1).
  2. Fare clic sulla scheda "di misure" per visualizzare la finestra di misura (Figura 4A, punto 2).
  3. Un elenco di attività è visibile in basso a sinistra dello schermo. Trascinare "Track" (presente nella sezione "Varie" voce in fondol'elenco) nello spazio sopra. Questo richiederà l'apertura di una nuova finestra chiamata "Track" nella parte superiore sinistra della schermata (Figura 4A, punto 3).
  4. Selezionare "Punti" dal tab "Input" nella finestra Track (Figura 4A, punto 4).
  5. Fai clic sullo strumento Point (4A, punto 5).
  6. Iniziare a monitorare la migrazione di neuroblasti cliccando con il mouse sulla zona centrale del corpo cellulare e tenere traccia il movimento delle cellule fino all'ultimo punto ora del time-lapse viene raggiunta (ad esempio il punto numero 61 per un film di 3 ore lungo) .
  7. Per ottenere dati scegliete "Make Voce di misura" dal menu Misure (Figura 4B, punti 6-7). Apparirà una finestra al centro dello schermo.
  8. In questa finestra, selezionare "Un nuovo elemento di misura denominata:" e digitare un nome (Figura 4C, punto 8). Ricordate di selezionare l'opzione "tutti i momenti" prima pressing OK (Figura 4C, punto 9). Un file oggetto di misurazione apparirà sotto il time-lapse e conterrà i parametri di analisi quantitativa (ad esempio la distanza di migrazione, velocità, spostamento e velocità di spostamento).
  9. Fare doppio clic sul file elemento di misurazione per aprirlo come una finestra (Figura 4D, punto 10).
  10. Per visualizzare le singole tracce di cellule analizzate, scegliere "cingolati Point" dalle opzioni del "Display" (Figura 4D, passo 11).
  11. Fare clic destro sul file Misura Item ed esportarlo come file di testo, che può essere importato in programmi come Excel per analizzare i parametri di migrazione.
  12. Per misurare movimenti tra fotogrammi consecutivi e pause effettuate da ciascun cellulare durante il periodo di riprese, nel file di misura Item selezionare tra le opzioni "Display", "Point" o "popolazioni" e clicca su ID (ogni brano ha un ID univoco). Esportare il file risultante da procederezione come spiegato al punto 4.10.

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Risultati

Etichettatura dei neuroblasti migratori SVZ-derivati ​​può essere osservato lungo le RMS, di solito 4-8 giorni dopo il elettroporazione di successo (Figura 1B). Punti di tempo più lunghi possono anche essere scelti, ma meno cellule si trovano nelle RMS poiché la maggior parte di loro sono entrati nel OB. Neuroblasti cominciare ad acquisire tipica morfologia e le caratteristiche di cellule granulari mature nella OB intorno 2-3 settimane dopo l'elettroporazione (non mostrato). Dopo coltura per ~ 1 ora...

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Discussione

Migrazione efficiente di progenitori neurali lungo le RMS garantisce la loro successiva maturazione in neuroni funzionali 10. Flussi importanti di progenitori neurali diretti verso l'OB sono visibili nella prima infanzia umana e possono svolgere un ruolo importante nei primi mesi del postnatale sviluppo del cervello umano 27. Inoltre, queste cellule sono in grado di siti del cervello colpite da lesioni e neurodegenerazione 4,28 bersaglio. Essere in grado di monitorare in tempo reale ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

MS e YZ sono supportati da KCL e KCL-Cina borse di dottorato. MO è stato finanziato da una Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council PhD borsa di studio. Ringraziamo Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki per il plasmide PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti per preziosi consigli su elettroporazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MillicellMilliporePICM0RG50
35 mm Piatto di coltura con fondo in vetroMatTekP35G-0-14-C
Terreni bilanciati Gey'sSigmaG9779-500ML
Glucosio, 45%SigmaG8769-100ML
HEPESSigmaH3375-25G
Pen/ StrepGIBCO15140-122
FCSGIBCO10109-163
B27 supplementoInvitrogen Life Technologies17504044
L-GlutamminaInvitrogen Life Technologies25030-081
DMEM (senza rosso fenolo)GIBCO31053-028
Fast GreenSigmaF7252-5G
Capillari in vetro per iniezioneHarvard Apparatus30-0057
Tubo aspiratoreSigmaA5177
Estrattore capillare Sutter P-97Sutter InstrumentP-97
ECM830 Elettroporatore a onda quadraHarvard Apparatus45-0052
Pinzetta in platino 7 mmHarvard Apparatus45-0488
Interruttore a pedale Modello 1250FHarvard Apparatus45-0211
Gel per elettrodiCefar Compex6602048
IsofluranoMerialAP/DRUGS/220/96
VibratomoLeicaVT1000S
CollaRoti collRoti coll 1
UltraViEW VoX sistema di dischi rotantiPerkin ElmerConfigurazione personalizzata (è possibile utilizzare più sorgenti laser) dotata di telecamera CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B
Software VolocityPerkin ElmerModuli di acquisizione, quantificazione e visualizzazione Camera
ambientale per microscopiaSolent ScientificMicroscopio
invertito Ti-ENikonL'obiettivo CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA è consigliato per l'applicazione descritta in questo documento
su misura

Riferimenti

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