La microscopia time-lapse e le tecniche di elaborazione delle immagini sono state utilizzate per osservare e analizzare la compattazione del gel mediata da fibroblasti e il riallineamento della fibra di fibrina in un bioreattore controllato dall'ambiente per un periodo di 48 ore.
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Articolo metodologico
Osservazione e quantificazione della compattazione del gel di fibrina mediata da fibroblasti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule incorporate nei gel di collagene e fibrina attaccano ed esercitano forze di trazione sulle fibre del gel. Queste forze possono portare alla riorganizzazione locale e globale e al riallineamento della microstruttura del gel. Questo processo procede in modo complesso che dipende in parte dall'interazione tra la posizione delle celle, la geometria del gel e i vincoli meccanici sul gel. Per comprendere meglio come queste variabili producono modelli globali di allineamento delle fibre, utilizziamo la microscopia DIC (Time-Lapse Differential Interference Contrast) abbinata a un bioreattore controllato dall'ambiente per osservare il processo di compattazione tra espianto geometricamente distanziato (ammassi di fibroblasti). Le immagini vengono quindi analizzate con un algoritmo di elaborazione delle immagini personalizzato per ottenere mappe del ceppo. Le informazioni ottenute da questa tecnica possono essere utilizzate per sondare la meccanobiologia di varie interazioni cellula-matrice, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei processi nella guarigione delle ferite, nello sviluppo di malattie e nelle applicazioni di ingegneria tissutale.
Introduzione
Uno strumento importante per studiare le interazioni cellula-matrice è il gel di collagene popolato dallecellule 1,2. Il gel fornisce un ambiente 3D più vicino al carattere in vivo del tessuto e più adatto per comprendere il comportamento cellulare di quanto offerto dalle colture 2D tradizionali3. I primi studi in cui i fibroblasti sono stati distribuiti omogeneamente all'interno di un gel di collagene hanno scoperto che le cellule consolidano rapidamente le fibre di collagene e compattano il gel4,5. I fibroblasti contrattili in gel galleggianti liberi poi si trasformano in uno stato quiescente subito dopo che il gel ha raggiu....
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Protocollo
1. Preparazione stencil
Preparare uno stencil su Parafilm per disartillare la posizione di ogni espianto, seguendo lageometria desiderata (figure 1A e 1B). Distanziare ciascuno di circa 1-2 mm di distanza. Questa distanza corrisponde a una spaziatura ideale per generare l'allineamento delle fibre tra le espianto. Attaccare lo stencil sotto l'area del vetro di copertura in cui il campione verrà preparato con nastro adesivo.
2. Sterilizzazione
Pulire accuratamente tutti i componenti del bioreattore utilizzando il 70% di etanolo e sterilizzar....
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Risultati
Il rimodellamento dei tessuti è un processo complesso che è guidato in parte da interazioni fisiche reciproche tra le cellule e la matrice circostante. Le cellule riorganizzano le fibre circostanti e generano tensione nella rete in fibra. L'allineamento delle fibre e dell'ambiente meccanico a sua volta controlla il comportamento delle cellule, in modo che sia le cellule che la matrice si riorganizzno globalmente per produrre tessuti rimodellati. In questo esperimento, le cellule delle espianto, inizialmente rotonde nella.......
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Discussione
Questo protocollo è stato sviluppato allo scopo di osservare e quantificare la meccanica coinvolta nel rimodellamento ECM mediato dalle cellule. Tali processi sono alla base di una serie di fenomeni biologici e hanno importanti implicazioni per i tessuti ingegneristici2,22, riducendola cicatrice 1,23e comprendendo il rimodellamento patologico deitessuti 12,24. L'uso della microscopia DIC time-lapse consente di risolvere e quantificare lo spostamento e l'allineamento delle fibre di fibrina.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Ringraziamenti
Ringraziamo George Giudice e Steven Eliason per aver donato fibroblasti dermici umani e Ramesh Raghupathy per l'aiuto con l'algoritmo di tracciamento del ceppo. Il sostegno a questo lavoro è stato fornito da un Dipartimento dell'Assistenza ai laureati del Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti nelle aree della National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Sonde molecolari | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Bioreattore Biotense | ADMET | ||
| Microscopio Ti-Eclipe | Nikon | ||
| # 0 Piastra di Petri con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 Piastra di Petri superiore in vetro da 35 mm | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Raccordi Luer in plastica, tubi in PVC con estremità Luer | Cole-Parmer | 30600-65 |
Riferimenti
- Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissu....
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Ristampe e permessi
