La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

Sommario

Abbiamo sviluppato un modello in vitro che imita un componente importante della risposta infiammatoria acuta durante l'infezione della vescica con uropatogeni Escherichia coli. Il transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili umana attraverso vescica epiteli, coltivate su supporti permeabili, in risposta a infezioni batteriche o di sostanze chemoattractant.

Abstract

Il reclutamento di cellule immuni dalla periferia al sito di infiammazione è un passo essenziale nella risposta immunitaria innata in qualsiasi superficie mucosa. Durante l'infezione della vescica urinaria, leucociti polimorfonucleati (PMN; neutrofili) migrano dal sangue e attraversano l'epitelio vescicale. Mancata soluzione infezione in assenza di una risposta neutrofila dimostra l'importanza di PMN in difesa vescica. Per facilitare la colonizzazione dell'epitelio vescicale, uropatogeni Escherichia coli (UPEC), l'agente eziologico della maggior parte delle infezioni delle vie urinarie (IVU), smorzare la risposta infiammatoria acuta utilizzando una varietà di meccanismi parzialmente definiti. Per approfondire l'interazione tra ospite e patogeno batterico, abbiamo sviluppato un modello in vitro di questo aspetto della risposta immunitaria innata di UPEC. Nel transuroepithelial saggio migrazione dei neutrofili, una variazione sul camera di Boyden, epith vescica coltaElial cellule sono coltivate a confluenza sul lato inferiore di un supporto permeabile. PMN sono isolate da sangue venoso umano e vengono applicati al lato basolaterale degli strati di cellule epiteliali della vescica. Migrazione PMN rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente pertinente in seguito a infezione batterica o molecole chemiotattici viene enumerato con un emocitometro. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le interazioni tra UPEC e cellule eucariotiche nonché per interrogare i requisiti molecolari per l'attraversamento di vescica epiteli da PMN. Il modello di migrazione dei neutrofili transuroepithelial sarà ulteriormente la nostra comprensione della risposta infiammatoria iniziale UPEC nella vescica.

Introduzione

Il movimento delle cellule in tutto il corpo, spesso su lunghe distanze, è necessaria per la crescita e lo sviluppo, la guarigione della ferita, e la risposta immunitaria. La migrazione cellulare è complesso e richiede il coordinamento di molti processi diversi, tra cascate di segnalazione e il riassetto dei componenti del citoscheletro. Le cellule possono muoversi in modo casuale (chemochinesi) così come verso gradienti chimici definiti (chemiotassi). Molte tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione delle cellule in vitro. La più antica e più comune tecnica, la camera di Boyden, costituito da un sistema a due camera verticale quando una sostanza chemiotattico viene posta nella camera inferiore e cellule di interesse vengono inseriti nella camera superiore ^1. Il movimento delle cellule attraverso il filtro permeabile, con pori di dimensioni definite, che separa le due camere è monitorato. Altre tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione cellulare, compresa la camera Zigmond ² e la camera di Dunn^3. Questi approcci collettivi hanno dato una visione significativa nel movimento di molti tipi cellulari diversi.

Oltre a interrogare i principi fondamentali della chemochinesi e chemiotassi, saggi a due camere hanno facilitato l'indagine della migrazione cellulare attraverso componenti della matrice extracellulare e di entrambi gli strati di cellule endoteliali ed epiteliali. Un vantaggio dei sistemi a due camere su altre tecniche è che la membrana porosa può essere rivestito con proteine ​​come il collagene o fibrinogeno e migrazione cellulare attraverso una barriera a matrice extracellulare può essere valutata. Inoltre, linee cellulari coltivate possono essere coltivate e differenziati sui supporti permeabili. Per studiare il movimento delle cellule attraverso una barriera endoteliale, cellule endoteliali coltivate vengono seminate e coltivate nel serbatoio superiore dei supporti permeabili. Cellule mobili, come le cellule immunitarie, vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione nel serbatoio inferiore di tutti i enbarriera endoteliale in direzione apicale a basolaterale fisiologica viene osservata. Questo modello è stato prezioso per comprendere stravaso di cellule immunitarie dal flusso sanguigno. In contrasto transendoteliale migrazione, il movimento delle cellule attraverso una barriera epiteliale verifica in genere nella direzione basolaterale-to-apicale. Per modellare questi eventi in vitro, i ricercatori seme e crescono cellule epiteliali coltivate sul lato inferiore dei supporti permeabili. Cellule mobili vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione attraverso la barriera epiteliale, che rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale, viene monitorato. Tali modelli di migrazione transepiteliale hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione delle risposte infiammatorie a superfici mucose, in particolare quelli del polmone e intestino ^4,5.

Al contrario, il traffico delle cellule immunitarie attraverso l'epitelio delle vie urinarie ha ricevuto molta meno attenzione. Per promuovere il nostro understanding delle risposte immunitarie innate nel tratto urinario durante l'infezione con uropatogeni Escherichia coli (UPEC), abbiamo sviluppato un test in vitro, la transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili, che consente di indagine di leucociti polimorfonucleati (PMN, neutrofili) movimento attraverso una barriera epiteliale della vescica ^{6 -8.} Come con altri modelli a due camere di migrazione transepiteliale, colture di cellule epiteliali umane della vescica sono coltivate sul lato inferiore di un supporto permeabile e formano strati epiteliali confluenti. Neutrofili umani, isolate da sangue venoso, vengono applicati sul lato basolaterale dello strato epiteliale, e migrazione attraverso l'epitelio nella direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente rilevanti viene quantificato in risposta a infezione con diversi ceppi di E. coli o la presenza di molecole chemiotattici. Molta ricerca era concentrata sul movimento dei neutrofili, sia chemochinesi e chemiotassi, in assenza di altri tipi di cellule. Il transuroepithelial neutrofili test di migrazione è vantaggioso in quanto tiene conto di complesse interazioni fra le cellule epiteliali della vescica e le cellule del sistema immunitario durante l'infezione. Questo trattabili modello in vitro ha il potenziale per consentire l'esame approfondito delle risposte immunitarie a superfici uroepithelial.

Protocollo

1. Coltura 5637 Cellule epiteliali della vescica

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di tessuto-cultura flusso laminare preparato con irradiazione UV e spazzato via giù con il 70% di etanolo.

1. Preparare mezzo RPMI-1640 contenente 10% siero bovino fetale (FBS) [definito RPMI +], filtro sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron dimensione dei pori e riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Scongelare una esageratamente di 5637 cellule (American Type Culture Collection HTB-9; derivata da carcinoma della vescica) in un bagno d'acqua a 37 °. Trasferire rapidamente le cellule scongelati per un tessuto pallone 75 centimetri ² di coltura contenente 20 ml di RPMI +.
3. Incubare il matraccio a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO ₂ fino a quando le cellule sono circa il 95% confluenti (~ 6 x 10 ⁶ cellule per pallone), circa 4 giorni.
4. Per sottocultura le cellule 5637:
   1. Rimuovere il terreno dal pallone. Lavare le cellule con 10 ml di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere 6 ml calda (37 ° C) 0,05% tripsina, soluzione di EDTA 0,02% al pallone, e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 15 min.
   3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, e pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 min. Rimuovere la soluzione di tripsina / EDTA.
   4. Risospendere le cellule in 6 ml RPMI + (10 ⁶ cellule / ml), e trasferimento 1 ml (10 ⁶ cellule) in un pallone di 75 centimetri ² contenente 20 ml di RPMI +.
5. Ripetere passo 1.4 al sottocultura cellule ogni 4 giorni o quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza.

2. Semina e Growing 5.637 celle su supporti permeabili

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica. Per risultati ottimali, utilizzare 5.637 cellule che hanno subito meno di 10 sottoculture.

1. Utilizzando pinze sterili, invertire i supporti permeabili in 25 millimetri piatto di coltura dei tessuti profondi sterile.
2. trypsinize un pallone di 5637 cellule di 75 centimetri ² al 95% di confluenza secondo le fasi 1.4.1-1.4.3.
3. Usando una pipetta 1.000 ml, delicatamente risospendere le cellule in ~ 2 ml RPMI + ad una concentrazione di 3 x 10 ⁶ cellule / ml, determinato da cellule contando con un emocitometro.
4. Applicare 50 ml di sospensione cellulare (1,5 x 10 ⁵ cellule) per ciascun supporto permeabile senza toccare la membrana. Mettere il coperchio sul piatto, e posizionare con cura il piatto a 37 ° C con 5% di CO ₂ per non più di 16 ore.
5. Utilizzando pinze sterili, giusti i supporti permeabili in una piastra a 24 pozzetti contenente 0,6 ml di RPMI + per pozzetto. Aggiungere 0,1 ml RPMI + al serbatoio superiore di ciascun supporto permeabile. Incubare a 37 ° C con 5% di CO _2.
6. Sostituire il mezzo ogni 2 giorni. Primo, Piano aspirato dal serbatoio superiore seguito dal serbatoio inferiore, e quindi applicare fresco RPMI + in ordine inverso, per il serbatoio inferiore (0,6 ml) e poi il Rese superiorervoir (0.1 ml).
7. Sette giorni dopo la semina dei supporti permeabili con 5637 celle, valutare confluenza delle cellule. Riempire il serbatoio superiore con RPMI + (~ 0.35 ml). Le cellule sono sufficientemente confluenti quando il mezzo non equilibrare tra i serbatoi superiore ed inferiore.

3. Preparazione del batterica dell'inoculo

1. Utilizzando una tecnica asettica, aggiungere 20 ml di brodo di coltura appropriato per un pallone da 250 ml con tappo. Utilizzare Luria-Bertani (LB) brodo per E. coli culture e aggiungere antibiotici per il brodo all'occorrenza.
2. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, inoculare il brodo con i batteri provenienti da un glicerolo magazzino o un piatto realizzato. Per i ceppi UPEC, incubare la coltura batterica a 37 ° C per circa 16 ore, senza agitare (per promuovere la produzione di tipo 1 pili).
3. Trasferire la coltura batterica in una provetta da centrifuga. Agglomerare le batteri mediante centrifugazione a 8000 xg per 10 min.
4. Decantare il surnatante, E risospendere i batteri in PBS a OD ₆₀₀ = 1.000, equivalente a ~ 10 ⁹ UFC / ml.
   1. Per generare uno stimolo batterica ucciso al calore, incubare una aliquota (es ~ 1,5 x 10 ⁸ UFC in 150 microlitri) dei batteri risospese a 55 ° C per 30 min. Piatto una aliquota della sospensione calore ucciso per confermare la morte dei batteri.
5. Immediatamente prima dell'uso, diluire i batteri risospeso (vivo o ucciso al calore) di 10 volte a 10 ⁸ CFU / ml nel warm privo di siero RPMI [definito RPMI-] in una provetta per microcentrifuga.

4. Isolamento di neutrofili umani da sangue periferico

La raccolta di sangue da volontari adulti necessita di revisione anticipo e l'approvazione di un comitato di revisione istituzionale. Indossare dispositivi di protezione adeguati e smaltire materiali pericolosi per evitare l'esposizione al sangue umano.

1. Circa 25 ml di sangue venoso da un adulto sano volunteer deve trarre in 3 provette sterili di sodio-eparina contenente la raccolta del sangue da parte del personale qualificato in salasso.
   1. Strettamente avvolgere un laccio emostatico di gomma attorno al braccio, sopra il gomito.
   2. Disinfettare il sito di ingresso, fossa antecubitale, utilizzando una sterile alcool al 70% pulire.
   3. Collegare un supporto di tubo di plastica ad un sistema di ago a farfalla dalle ali.
   4. Inserire l'ago in una vena antecubitale ad un angolo di 30 ° o meno, smusso rivolto verso l'alto. L'ago ha perforato la vena quando un getto di sangue appare nel tubo di plastica.
   5. Inserire un tubo di raccolta di sangue nel supporto tubo di plastica. Quando il primo tubo di raccolta è pieno, sostituirlo con il secondo tubo di raccolta. Ripetere con il terzo tubo.
   6. Quando il terzo tubo di raccolta è di circa mezzo pieno, rimuovere il laccio emostatico.
   7. Coprire il sito di puntura con un batuffolo di cotone sterile e ritirare lentamente l'ago dalla vena. Far scorrere lo schermo protettivo sopra l'ago e il luogo ina rischio biologico sharps container.
   8. Applicare pressione sul sito di puntura. Coprire la palla sito di puntura e cotone con un bendaggio adesivo.
   9. Capovolgere delicatamente le provette per il prelievo del sangue per disperdere l'eparina.

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica.

2. Usando una pipetta 10 ml, trasferire delicatamente il sangue ad una, 50 ml sterile tubo conico fresca. Aggiungere un volume equivalente di 3% (w / v) destrano in 0.9% NaCl e mescolare per inversione. Incubare la provetta in posizione verticale a temperatura ambiente per 20 min.
3. Senza interrompere lo strato inferiore, aspirare accuratamente lo strato superiore e trasferirlo in una nuova provetta conica da 50 ml. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min. Scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet di cellule in un volume di 0,9% NaCl equivalente al volume iniziale di sangue.
5. Strato 10 ml di soluzione di centrifugazione densità inferiore sospensione cellulare, priservando l'interfaccia tra le due fasi. Centrifugare a 400 xg per 30 min senza freno. Scartare il surnatante.
6. Per lisare restanti globuli rossi, risospendere il pellet cellulare in 10 ml freddo 0,2% NaCl. Incubare per 30 secondi, e poi aggiungere subito 10 ml di freddo 1.6% NaCl per ripristinare isotonicità.
7. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 6 min. Scartare il surnatante.
8. Ripetere i passaggi 4,6-4,7 finché non appare il pellet cellulare per essere liberi di globuli rossi, in genere 3 turni di lisi.
9. Usando una pipetta 1,000 microlitri, risospendere il pellet cellulare, principalmente PMN, in acqua calda (37 ° C) RPMI-ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml, determinato per conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Conservare le cellule a 37 ° C fino all'utilizzo. Tipicamente, PMN vitalità e purezza sono> 99% come valutato dal trypan blu e la visualizzazione della morfologia nucleare dopo colorazione, rispettivamente.

5. Transuroepithelial neutrofili migrazionedire

Effettuare le seguenti operazioni in una cappa di coltura di tessuti con tecnica asettica. Utilizzare solo supporti permeabili cuscinetto confluenti 5637 strati di cellule, come determinato al punto 2.7. Le piastre a 24 pozzetti contenenti RPMI-possono essere preparati in anticipo e conservati a 37 ° C con 5% di CO ₂ fino al momento dell'uso.

1. Aliquota 1 ml caldo RPMI-per bene in un 24-pozzetti; preparare 3 pozzetti per il supporto permeabile.
2. Aspirare il mezzo dai serbatoi superiore ed inferiore dei supporti permeabili.
3. Utilizzando pinze sterili, trasferire i supporti permeabili alla piastra 24 pozzetti preparato al punto 5.1. Lavare i supporti permeabili tre volte trasferendo i supporti da pozzetto a pozzetto.
4. Se un inoculo batterico deve essere utilizzato, invertire i supporti permeabili in 25 mm piatto di coltura dei tessuti profondi sterile. Se un chemiotattico (ad esempio, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) o IL-8), deve essere utilizzato, passare al punto 5.6.
5. Per gli esperimenti con bact vivo o uccisostimoli Erial, inoculare la parte apicale di ciascun supporto permeabile con 60 microlitri RPMI-(infezione finto) o con l'inoculo batterico (6 x 10 ⁶ CFU) preparato al punto 3.5. Posizionare il coperchio sul piatto e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 1 ora.
6. Aggiungere 0,6 ml di RPMI-per bene ad una piastra a 24 pozzetti basso attaccamento; preparare 1 e per il supporto permeabile. Preparare 3 pozzetti contenenti 0,5 ml RPMI-per enumerare ingresso PMN.
   1. Se un fattore chemiotattico viene utilizzato al posto di batteri, aggiungere il fattore chemiotattico per 0,6 ml RPMI-nella piastra a 24 pozzetti preparato al punto 5.6.
7. Destra supporti permeabili nella piastra a 24 pozzetti low-attacco.
8. Aggiungere 0,1 ml PMN (10 ⁶ PMN), preparato nella fase 4.9, al serbatoio superiore (lato basolaterale) di ciascun supporto permeabile. Aggiungere 100 microlitri PMN direttamente nei pozzetti contenenti 500 ml RPMI-. Incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 1 ora.
9. Utilizzando pinze sterili, raschiare delicatamente lamembrana del supporto permeabile contro il bordo del pozzo per rimuovere PMN supplementare dal lato apicale e poi smaltire il supporto.
10. Raccogliere PMN raschiando delicatamente la parte inferiore di ogni bene con la punta della pipetta 1.000 microlitri, e trasferire le sospensioni PMN per microcentrifuga tubi.
11. Enumerare PMN utilizzando un emocitometro.
12. Per calcolare il numero totale di PMN nel serbatoio inferiore, moltiplicare il numero di PMN in 1 mm ² (100 nl) da 6.000. I dati possono essere presentate come percentuale di input di PMN, o come numeri PMN normalizzati 10 ⁶ ingresso PMN.

Risultati

Il transuroepithelial saggio migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione PMN umano di tutti gli strati cellulari epiteliali della vescica coltivate in risposta a vari stimoli (Figura 1B). Mentre il protocollo è semplice, ci sono una serie di variabili che possono influenzare la migrazione PMN e conseguentemente influenzare la riproducibilità del saggio. Occorre adottare misure volte durante la preparazione dei supporti permeabili e PMN per ridurre la variabilità tra i...

Discussione

Usando una linea di cellule epiteliali della vescica colta e preparata isolato PMN umani, abbiamo stabilito un modello in vitro di migrazione dei neutrofili transuroepithelial. Questo modello è stato determinante nel cominciare per analizzare la complessità della risposta immunitaria innata durante l'infezione del tratto urinario (UTI), un'infezione batterica molto comune in genere causata da UPEC ^9. Durante l'infezione della vescica o cistite, assunzione di PMN al lume della vescica è es...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inserti Transwell (i.e.  supporti permeabili)	Corning	3472	6,5 mm, 3 μ m poro, inserto a membrana in poliestere
BD Vacutainer Provette per la raccolta del sangue	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	Provette con tappo verde da 16 mm x 100 mm x 10 ml contenenti eparina sodica
Set per la raccolta e l'infusione del sangue BD Safety-Lok	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0,75 pollici ago x 12 pollici tubo
BD Vacutainer monouso, supporto non impilabile	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Da Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS soluzione di centrifugazione a densità GE	Healthcare	17-1440-02
Piastre di fissaggio ultra-basse	Corning	3473	a 24 pozzetti, fondo
piatto trasparenteN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	ricostituito in DMSO a 10 mM
Ricombinante CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	Ricostituito in PBS a 100 μ g/ml