Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

Laura L. Smith; Alan H. Beggs; Vandana A. Gupta

doi:10.3791/50925

Articolo metodologico

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

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DOI:

10.3791/50925

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13 dicembre 2013

Laura L. Smith¹ , Alan H. Beggs¹ , Vandana A. Gupta¹

¹Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

In questo articolo

Sommario

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Abstract

I pesci zebra (Danio rerio) sono diventati uno strumento particolarmente efficace per modellare le malattie umane che colpiscono il muscolo scheletrico, comprese le distrofie muscolari^1-3, le miopatie congenite^4,5 e le interruzioni nell'assemblaggio sarcomerico^6,7, a causa dell'elevata conservazione genomica e strutturale con i mammiferi⁸. La disorganizzazione muscolare e la compromissione della locomotiva possono essere rapidamente valutate nel pesce zebra nei primi giorni dopo la fecondazione. Due saggi per aiutare a caratterizzare i difetti del muscolo scheletrico nel pesce zebra sono la birifrangenza (strutturale) e la risposta di fuga evocata dal tatto (comportamentale).

La birifrangenza è una proprietà fisica in cui la luce viene ruotata mentre passa attraverso la materia ordinata, come la matrice pseudo-cristallina dei sarcomeri muscolari⁹. Si tratta di un approccio semplice e non invasivo per valutare l'integrità muscolare nelle larve di zebrafish traslucide all'inizio dello sviluppo. I pesci zebra wild-type con muscoli scheletrici altamente organizzati appaiono molto luminosi in mezzo a uno sfondo scuro quando vengono visualizzati tra due filtri di luce polarizzati, mentre i mutanti muscolari hanno modelli di birifrangenza specifici per il disturbo muscolare primario che modellano. Le distrofie muscolari modellate da zebrafish, malattie caratterizzate da degenerazione delle miofibre seguite da ripetuti cicli di rigenerazione, mostrano macchie scure degenerative nel muscolo scheletrico sotto luce polarizzata. Le miopatie non distrofiche non sono associate a necrosi o alterazioni rigenerative, ma provocano miofibre disorganizzate e debolezza muscolare scheletrica. Il pesce zebra miopatico mostra tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza, riflettendo la disorganizzazione dei sarcomeri.

Il saggio di fuga evocato dal tatto prevede l'osservazione del comportamento di nuoto di un embrione in risposta alla stimolazione tattile^10-12. Rispetto alle larve wild-type, le larve mutanti mostrano spesso una debole contrazione di fuga, seguita da un nuoto lento o da un altro tipo di movimento alterato che non riesce a spingere le larve più di una breve distanza¹². Il vantaggio di questi saggi è che la progressione della malattia nello stesso tipo di pesce può essere monitorata in vivo per diversi giorni e che un gran numero di pesci può essere analizzato in breve tempo rispetto ai vertebrati superiori.

Protocollo

1. Analisi in vivo della struttura del muscolo scheletrico mediante birifrangenza

Prepara le gabbie di accoppiamento che separano i maschi dalle femmine della linea o delle linee di pesce zebra desiderate nel tardo pomeriggio dopo l'alimentazione.
1. Distingui le femmine dal ventre più grande e dalla leggera colorazione blu/bianca, e i maschi dalla forma del corpo snella e dalle sfumature rosa/gialle.
2. Il successo con gli incroci a coppie (un maschio e una femmina) può essere solo del 50% circa. Per un tasso di successo più elevato, accoppia un maschio con 2-3 femmine.
Rimuovete i divisori della gabbia la mattina successiva, poco dopo l'inizio della luce, e lasciate che il pesce si riproduca indisturbato.
Raccogli le uova usando un colino quando un numero sufficiente di uova fecondate è deposto sul fondo della vasca.
Trasferisci gli embrioni in una capsula di Petri profonda sciacquando il colino con acqua di pesce e rimetti i pesci genitori nelle loro vasche. Mettere i piatti di embrioni in un'incubatrice a 28,5 °C.
Pulisci le uova e i detriti inviabili più tardi quel giorno o la mattina seguente e rimetti gli embrioni nell'incubatrice per un'ulteriore crescita.
Gli embrioni/larve raggiungono l'età appropriata per osservare la birifrangenza a 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), poiché i risultati precedenti al 3 dpf possono potenzialmente soffrire di un contrasto limitato. Gli embrioni wild-type si schiudono dai loro corioni tra le 48 e le 60 ore dopo la fecondazione (hpf), seguita da un raddrizzamento dell'asse del corpo. Gli embrioni selvatici o mutanti a schiusa tardiva possono richiedere la decorionazione manuale.
1. Fai delicatamente uno strappo nel corion con una pinza affilata e capovolgilo in modo che l'embrione cada.
2. Lasciare raddrizzare gli embrioni dechorionati prima di iniziare il test.
3. Anestetizzare gli embrioni con tricaina (0,04% nell'acqua di pesce) per facilitare il loro corretto posizionamento.
Montare un microscopio da dissezione con una lente polarizzata che può essere ruotata per regolare l'angolo della luce polarizzata (Figura 1A).
Posizionare gli embrioni dechorionati e anestetizzati direttamente sopra una seconda lente polarizzata lungo l'asse laterale del corpo. La seconda lente deve essere posizionata sotto la lente superiore, sul tavolino del microscopio (Figura 1B). Non utilizzare piastre di Petri in plastica in nessun momento durante il test di birifrangenza, poiché la plastica non è un mezzo appropriato per la trasmissione della luce rifratta.
Ruotare la lente superiore con l'embrione di interesse in vista fino a quando gli assi di polarizzazione delle due lenti sono orientati a 90° l'uno dall'altro e lo sfondo è completamente scuro.
L'output ottimale del test dipende dall'orientamento del pesce tra due lenti polarizzate. Sposta i pesci per assicurarti che siano sdraiati il più distesi possibile.
1. Se il pesce è curvo, solo i segmenti con questo orientamento piatto passeranno la luce polarizzata e mostreranno birifrangenza. In tali casi, misurare la birifrangenza nelle aree pianeggianti e registrare la birifrangenza dell'area corrispondente nei pesci selvatici (ad esempio somiti 1-10 sia nei pesci selvatici che nei pesci mutanti).
Osservare il fenotipo birifrangente del pesce.
1. I pesci selvatici con muscolo scheletrico altamente organizzato mostrano una birifrangenza brillante, poiché l'indice di rifrazione per la luce parallela ai miofilamenti è superiore alla luce polarizzata perpendicolare a queste strutture.
2. I pesci con muscolo scheletrico disorganizzato, suggestivo di una miopatia non degenerativa o di un difetto dello sviluppo, mostrano tipicamente una riduzione complessiva della birifrangenza.
3. I pesci con muscolo scheletrico disorganizzato, caratteristico di una distrofia muscolare, mostrano comunemente un modello di birifrangenza simile a una macchia, con aree scure che rappresentano la degenerazione muscolare tra le aree luminose della normale architettura muscolare.
Quantifica la birifrangenza scattando immagini di pesci selvatici e mutanti sotto luce polarizzata con le stesse impostazioni di esposizione e ingrandimento. Salva le immagini come file .tiff.
1. Apri le immagini di birifrangenza nel software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
2. Per ogni immagine, seleziona l'area del muscolo del pesce zebra disegnando una linea attorno al corpo utilizzando l'opzione "Selezioni poligonali" dalla barra degli strumenti.
3. Utilizzare "Imposta misure" nel menu a discesa "Analizza" per selezionare le statistiche richieste per l'immagine.
  1. La selezione minima richiede che le caselle "Area", "Valore medio di grigio" e "Valore minimo e massimo di grigio" siano selezionate.
  2. Un valore massimo di grigio di >255 indicherà la saturazione dei pixel. Pertanto, utilizzare immagini con valori di grigio massimi inferiori a 255.
4. Normalizzare l'intensità media con l'area selezionata e ripetere la stessa procedura di quantificazione per ogni immagine di birifrangenza.

2. Saggio del comportamento di fuga evocato dal tocco

Prepara le coppie di accoppiamento delle linee di pesce zebra appropriate e raccogli gli embrioni come descritto sopra nei passaggi 1.1-1.5.
A 2-7 giorni dalla fecondazione, posizionare gli embrioni/larve dechorionati singolarmente in una capsula di Petri profonda o nelle camere delle piastre multipozzetto.
Lavorando con un solo embrione alla volta, centrare l'embrione nel campo visivo di uno stereomicroscopio Nikon SMZ1500 con un sistema di fotocamera digitale SPOT RT3 o simile e iniziare l'imaging sequenziale.
1. La stessa frequenza di imaging dovrebbe essere utilizzata sia per i pesci selvatici che per quelli mutanti. Si consigliano frame rate >30 Hz, poiché in genere non sono sufficienti per catturare il nuoto veloce dei pesci selvatici.
Fornire stimoli meccanosensoriali all'embrione toccando la coda con uno spillo da insetto.
Interrompi l'imaging quando l'embrione ha smesso di nuotare o ha nuotato fuori dal campo visivo.
Converti immagini sequenziali in un file video o analizza singoli fotogrammi di immagini time-lapse off-line, utilizzando il software SPOT 5.1 Advanced. Pacchetti software simili includono Open Lab, NIS Elements o ImageJ disponibile gratuitamente (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Quantificare il comportamento di nuoto eseguendo la risposta evocata dal tatto in più embrioni.
1. Ciò può essere ottenuto calcolando la media della distanza in cui gli embrioni sono in grado di nuotare entro un intervallo di tempo fisso utilizzando un software o un righello metrico per contrassegnare i punti di inizio e fine dell'incontro di nuoto.
2. Evita che gli embrioni si abituino allo stimolo tattile nel tempo eseguendo il test con un nuovo embrione per ogni ripetizione sperimentale. I comportamenti nei modelli mutanti wild-type e affidabili tendono ad essere altamente riproducibili.