Articolo metodologico

Analisi quantitativa e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nel seno aortico murino

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 dicembre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo le procedure per quantificare e caratterizzare le lesioni aterosclerotiche in modelli murini utilizzando il sezionamento di precisione del seno aortico e dell'aorta ascendente combinato con analisi istochimica e immunoistochimica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'aterosclerosi è una malattia delle grandi arterie e una delle principali cause sottostanti di infarto del miocardio e ictus. Diversi modelli murini sono stati sviluppati per facilitare lo studio della fisiopatologia molecolare e cellulare di questa malattia. In questo manoscritto descriviamo tecniche specifiche per la quantificazione e la caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nel seno aortico murino e nell'aorta ascendente. Il vantaggio di questa procedura è che fornisce una misurazione accurata dell'area della sezione trasversale e del volume totale della lesione, che può essere utilizzata per confrontare la progressione aterosclerotica tra diversi gruppi di trattamento. Ciò è possibile grazie all'uso dei lembi valvolari come punto di riferimento anatomico, insieme a un'attenta regolazione dell'angolo di sezionamento. Descriviamo anche i metodi di colorazione di base che possono essere utilizzati per iniziare a caratterizzare la progressione aterosclerotica. Questi possono essere ulteriormente modificati per studiare antigeni di interesse specifico per il ricercatore. Le tecniche descritte sono generalmente applicabili a un'ampia varietà di modelli dietetici e di aterogenesi geneticamente indotti esistenti e di nuova creazione.

Introduzione

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Negli ultimi due decenni, lo sviluppo e l'uso di modelli murini inclini all'aterosclerosi attraverso la manipolazione dietetica e/o genetica hanno aumentato significativamente la nostra comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nello sviluppo delle lesioni aterosclerotiche1-3. Gran parte della nostra conoscenza e comprensione dell'aterogenesi deriva da studi condotti su apolipoproteina (Apo)-E deficient4 topi, in cui le lesioni aterosclerotiche si sviluppano spontaneamente e deficit del recettore delle lipoproteine a bassa densità (LDLR)5 topi, in cui l'aterosclerosi è indotta dalla dieta. Un importante vantaggio di questi modelli è che consentono lo studio di un numero relativamente elevato di animali geneticamente definiti in condizioni dietetiche e ambientali controllate. Inoltre, le lesioni aterosclerotiche avanzate che si sviluppano in alcuni di questi ceppi di topi sembrano essere molto simili a quelle osservate nei soggetti umani, contenenti nuclei necrotici pieni di lipidi e cappucci fibrosi. L'aterosclerosi si sviluppa rapidamente in questi modelli murini, rendendo molto fattibile lo studio dello sviluppo della lesione, dalla striscia grassa alla placca avanzata, nel giro di poche settimane. Inoltre, è stato dimostrato che i fattori di rischio noti per le malattie cardiovascolari nell'uomo, tra cui il diabete6, la dislipidemia7, l'obesità8, l'ipertensione9, il fumo di sigaretta10 e l'ambiente sedentario11 accelerano ulteriormente lo sviluppo delle lesioni.

Nella maggior parte, se non in tutti i modelli murini inclini all'aterosclerosi, lo sviluppo della lesione può essere rilevato per la prima volta nel seno aortico. Il tempo di insorgenza dipende dal ceppo del topo e dalla dieta. Man mano che le lesioni aumentano di dimensioni, tendono a crescere lungo l'aorta ascendente. Nei topi ApoE-/- e LDLR-/-, il successivo sviluppo della lesione può essere rilevato in corrispondenza delle biforcazioni aortiche nell'arco aortico, nell'aorta discendente e in altre arterie più grandi12-14. La dott.ssa Beverly Paigen e colleghi, oltre a sviluppare alcuni dei primi modelli di aterosclerosi indotta dalla dieta, hanno anche stabilito un test per la quantificazione delle lesioni aterosclerotiche al seno aortico che è diventato lo standard di misurazione delle lesioni nei modelli murini15. Nel corso degli anni questa tecnica è stata affinata e descritta dettagliatamente16. Qui presentiamo una versione modificata del "metodo Paigen" per la quantificazione e la caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche in un topo. L'analisi delle sezioni trasversali aortiche seriali da una specifica regione vascolare e in un orientamento definito e fisso, facilita la raccolta precisa dei dati e consente il rilevamento accurato delle variazioni nello sviluppo delle lesioni in diversi gruppi di trattamento. I metodi qui presentati si basano sulle tecniche precedenti. In particolare, descriviamo come la caratterizzazione della lesione in termini di area, volume, contenuto necrotico e cellulare sia possibile attraverso l'esame di sezioni seriali utilizzando una combinazione di istochimica e immunoistochimica.

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Protocollo

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Il Comitato Etico per la Ricerca Animale della McMaster University ha preapprovato tutte le procedure qui descritte.

1. Prelievo di cuore e aorta

  1. Anestetizzare il topo e aprire con cura la cavità toracica per rivelare il cuore e l'aorta prossimale.
    1. Estrarre il sangue dal topo mediante punteggiatura diretta del ventricolo destro del cuore.
      Nota: il sangue può essere conservato e utilizzato per l'analisi dei lipidi plasmatici e di altri fattori trasmissibili per via ematica.
  2. Eutanasia del topo mediante lussazione cervicale.
  3. Sciacquare il sistema vascolare con 5 ml di soluzione fisiologica.
    Nota: ciò si ottiene mediante perfusione per gravità attraverso una puntura dell'ago nel ventricolo sinistro. Per consentire il drenaggio, viene praticata una piccola incisione nell'atrio destro. Dopo il risciacquo del sistema vascolare, è possibile raccogliere campioni di tessuto epatico, muscolare e adiposo, congelarli in azoto liquido e conservarli a -80 ºC per analisi future.
  4. La vascolarizzazione è fissata per perfusione gravitazionale nel ventricolo sinistro con formalina tamponata neutra al 10%.
    Nota: una volta avviata la perfusione, il flusso di formalina tamponata neutra al 10% viene regolato su un gocciolamento lento in modo che il processo richieda 1-2 minuti. Gli organi e i tessuti che sono stati fissati per perfusione possono essere utilizzati per lo studio dell'espressione proteica attraverso l'immunofluorescenza o l'istochimica, ma generalmente non possono essere utilizzati come campioni per il western blotting o per lo studio dell'espressione genica.
  5. Estrarre con cautela il cuore e circa 2 mm di aorta prossimale dalla carcassa. Altri tessuti, compresa l'aorta discendente, possono essere raccolti e conservati per successive analisi.
    Nota: l'aorta discendente (fino alla biforcazione iliaca) può essere utilizzata anche per esaminare l'aterosclerosi.
  6. Praticare un taglio trasversale con un bisturi sul cuore asportato in modo perpendicolare all'aorta ascendente.
    Nota: questo è facilitato dall'uso di un microscopio da dissezione e può essere fatto efficacemente tagliando lungo una linea retta che unisce le punte inferiori degli atri destro e sinistro (Figura 1).
  7. Conservare la parte apicale (superiore) del cuore in una cassetta di inclusione e immergerla in formalina tamponata neutra per la lavorazione.

2. Preparazione dell'aorta

  1. Posizionare la cassetta con il tessuto sezionato nel processatore di tessuti.
  2. Processare campioni di tessuto.
    Nota: Generalmente, i processatori di tessuti sono programmati per lavorare durante la notte a causa della durata dell'operazione e delle soluzioni coinvolte in questo processo. I campioni vengono elaborati seguendo un protocollo stabilito:
    1. Formalina tamponata neutra al 10% per 1 ora a 42 ºC.
    2. Formalina tamponata neutra al 10% per 1 ora a 42 ºC.
    3. Etanolo al 70% per 30 minuti a 40 ºC.
    4. Etanolo all'85% per 30 minuti a 40 ºC.
    5. Etanolo al 100% per 45 minuti a 40 ºC.
    6. Etanolo al 100% per 45 minuti a 40 ºC.
    7. Etanolo al 100% per 45 minuti a 40 ºC.
    8. Xilene per 1 ora a 40 ºC.
    9. Xilene per 1 ora a 40 ºC.
    10. Xilene per 1 ora a 40 ºC.
    11. Cera di paraffina per 45 min a 63 ºC.
    12. Cera di paraffina per 45 min a 63 ºC.
    13. Cera di paraffina per 45 min a 63 ºC.
    14. Cera di paraffina per 45 min a 63 ºC.
  3. Sciogliere la cera di paraffina per una notte a 62 ºC (Figure 1D-E). Stimare la quantità totale di cera di paraffina da utilizzare in base ai grammi di cera di paraffina necessari per riempire uno stampo istologico e al numero di blocchi da preparare.
    Nota: uno stampo istologico profondo è preferito allo stampo poco profondo perché fornisce un angolo di rotazione potenziale più ampio durante il sezionamento. Un singolo stampo istologico profondo richiede 11 g di cera di paraffina.
  4. Posizionare ogni tessuto lavorato in uno stampo istologico profondo e quindi versare la cera di paraffina fusa per riempire completamente lo stampo (Figura 1F). Coprire lo stampo con una cassetta di plastica etichettata (Figura 1G).
  5. Raffreddare lo stampo riempito con ghiaccio, o su una superficie fredda (Figura 1H), in modo da creare il blocco solido e separare il blocco dallo stampo (Figure 1I-J).
    NOTA: Quando si posiziona il cuore sezionato nello stampo, assicurarsi che la faccia interna del cuore tocchi la base dello stampo, quindi procedere a riempire il blocco con paraffina fusa. Una cassetta di plastica etichettata copre lo stampo prima che si solidifichi in modo da fornire una base per maneggiare il blocco. Una volta raffreddato, lo stampo viene rimosso e i blocchi di paraffina possono essere conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente.

3. Sezione dell'aorta

  1. Posizionare il blocco con il cuore nel portacampioni del microtomo in modo che possa essere sezionato dall'interno verso la parte superiore del cuore (Figura 2)
  2. Regolare il microtomo per tagliare uno spessore di sezione di 10 μm e procedere alla sezione del cuore.
  3. Raccogli le sezioni su un vetrino ed esaminale al microscopio ottico per determinare la posizione e l'orientamento.
  4. Quando 1 o 2 valvole del seno aortico diventano evidenti, regolare l'angolo del blocco secondo necessità (Figura 3A).
    Nota: il seno dovrebbe apparire come tre basi valvolari bipartite con levette attaccate. Se si osservano solo uno o due lembi valvolari, l'angolo di taglio deve essere regolato di conseguenza.
  5. Regolare il microtomo per tagliare a 4-5 μm e raccogliere le sezioni su vetrini rivestiti.
    Nota: Sebbene la procedura possa essere variata, si raccomanda un approccio sistematico, in base al quale le prime 10 sezioni, dal seno aortico che avanza verso l'aorta ascendente, vengono raccolte sulla parte superiore di un vetrino etichettato (vetrini etichettati 1-10). Le sezioni successive vengono raccolte seguendo lo stesso schema: #11-20, #21-30, #31-40 fino a quando le lesioni aterosclerotiche non sono più osservate (Figura 3B). In questo modo le lesioni aterosclerotiche possono essere esaminate e caratterizzate in punti precisi lungo l'aorta ascendente. Ad esempio, la diapositiva 1 contiene le sezioni 1, 11, 21, 31, 41 e 51, che rappresentano lesioni aterosclerotiche dal seno aortico fino all'aorta ascendente. Se la lesione è di grandi dimensioni, possono essere inclusi vetrini aggiuntivi, etichettati 11-20, per raccogliere più sezioni distali seguendo lo stesso schema.
  6. Continuare a raccogliere le sezioni fino a quando non si osserva alcuna lesione aterosclerotica.
    Nota: i vetrini possono essere conservati a temperatura ambiente per mesi, prima di ulteriori analisi.

4. Colorazione e quantificazione delle lesioni aterosclerotiche

Le lesioni aterosclerotiche possono essere analizzate in molti modi diversi utilizzando una varietà di tecniche. L'analisi più elementare prevede la determinazione dell'area della sezione trasversale della lesione. Al fine di confrontare accuratamente l'area della lesione, è importante che il punto di partenza per la misurazione della lesione sia coerente da campione a campione. Ciò è facilitato dall'utilizzo dei lembi della valvola per l'orientamento. Per facilitare l'identificazione e la quantificazione accurate dell'area della lesione, sezioni trasversali selezionate vengono colorate con ematossilina ed eosina. Ciò comporta l'immersione dei vetrini in una serie di soluzioni per tempi specificati, che deparaffinizzeranno / macchiano il tessuto.

Protocollo per la colorazione con ematossilina ed eosina:

  1. Mettere i vetrini nell'essiccatore ad aria per 8 minuti, quindi deparaffinare le sezioni lavando 4× in xilene, per 3 minuti per lavaggio.
  2. Lavare i vetrini in etanolo al 100% 3× per 3 minuti ciascuno.
  3. Lavare 3× in etanolo al 70% per 3 minuti ciascuno e poi 2× in etanolo al 50% per 3 minuti ciascuno.
  4. Sciacquare con acqua distillata e poi immergere nell'ematossilina di Mayer per 15 minuti.
  5. Lavare in acqua corrente per 5 minuti, quindi lavare in acqua distillata per 5 minuti.
  6. Immergere in Eosin Y per 1-5 minuti.
  7. Lavare in acqua distillata 3× per 5 minuti ciascuno, lavare in etanolo al 50% 2× per 2 minuti ciascuno, quindi etanolo al 70% 3× per 2 minuti ciascuno.
  8. Lavare in etanolo al 100% al 3× per 2 minuti ciascuno, quindi lavare in xilene 4× per 2 minuti ciascuno.
  9. Monta le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene e acquisisci immagini utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio ottico.
  10. Identificare e quantificare l'area della lesione utilizzando il software di imaging.
    Nota: l'area della lesione può essere determinata a distanze specifiche dal seno aortico a intervalli di 40-50 μm (a seconda dello spessore di ciascuna sezione). Un grafico di queste misurazioni dell'area rispetto alla distanza fornisce un profilo della lesione aterosclerotica (Figura 4). L'area sotto la curva rappresenta una stima del volume totale della lesione aterosclerotica. Un'ulteriore caratterizzazione della lesione può includere la determinazione dell'area necrotica. Il nucleo necrotico (nc) di una lesione avanzata è formato da cellule schiumogene apoptotiche. Con la pratica, questo può essere determinato esaminando le regioni acellulari delle sezioni colorate con ematossilina ed eosina (Figura 4A). Le lesioni precoci tendono ad avere una necrosi molto bassa, mentre le lesioni più avanzate hanno aree necrotiche aumentate che possono contribuire all'instabilità della placca. Le sezioni seriali della stessa aorta devono essere esaminate per confermare la presenza di una regione necrotica.

5. Ulteriore caratterizzazione della lesione aterosclerotica

I dettagli specifici riguardanti lo stadio dello sviluppo aterosclerotico possono essere determinati mediante colorazione con anticorpi diretti contro specifici tipi di cellule o marcatori. L'immunoistochimica su sezioni di paraffina è una tecnica standard che viene utilizzata per identificare specifici tipi di cellule o marcatori nel contesto del tessuto circostante non colorato. La rilevazione dell'antigene si ottiene generalmente utilizzando un substrato di perossidasi di rafano.

La colorazione in immunofluorescenza comporta l'uso di anticorpi coniugati con fluorofori e richiede un microscopio a fluorescenza e filtri appropriati per la rilevazione. Questa tecnica consente la colorazione simultanea di due (o più) antigeni.

Protocollo generale per la colorazione immunoistochimica:

  1. Posizionare i vetrini nell'essiccatore ad aria per 8 minuti.
  2. Deparaffinizza le sezioni in 4 cambi di xilene, 3 min each.
  3. Lavare in etanolo al 100% 3× per 3 minuti ciascuno per rimuovere lo xilene.
  4. Lavare 3× in etanolo al 70% per 3 minuti ciascuno, quindi 2× in etanolo al 50% per 3 minuti ciascuno.
  5. Lavare in acqua distillata per 5 minuti ciascuno, quindi lavare 3× in PBS per 5 minuti ciascuno.
  6. Eseguire il recupero dell'antigene. Ciò può essere ottenuto utilizzando il metodo HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) in una pentola a pressione a microonde e una soluzione per il recupero dell'antigene (10 mM di tampone citrato, pH 6,0).
    Nota: Il processo di fissazione della formalina può mascherare gli antigeni di interesse. Nella nostra esperienza, l'HIER migliora significativamente le prestazioni di alcuni anticorpi, ma non è necessario per altri. Inoltre, sono disponibili altre alternative al metodo HIER per il recupero dell'antigene.
  7. Quando la pentola a pressione si è raffreddata, posizionare i vetrini nel PBS per 15 minuti.
  8. Incubare le sezioni in siero normale (della stessa specie da cui è derivato l'anticorpo secondario) per 30 minuti. NON LAVARE I VETRINI - SCOLARE IL SIERO.
  9. Incubare con anticorpi primari diluiti in siero bloccante normale per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
  10. Lavare con PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  11. Incubare le sezioni con l'anticorpo secondario biotinilato che è stato diluito in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
  12. Incubare i vetrini con streptavidina perossidasi di rafano per 30 minuti, quindi lavare con PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  13. Reazione cromogenica: incubare i vetrini in DAB fresco (3,3'-diaminobenzidina) per 5-30 min. Questa reazione deve essere monitorata utilizzando un microscopio. Arresta la reazione lavando gli scivoli nell'acqua del rubinetto.
  14. Contromacchiare con ematossilina per 1 min. Lavare con acqua di rubinetto per 5 min, quindi lavare in acqua distillata 3× per 5 min ciascuno.
  15. Ripetere i passaggi 4.7-4.9 per il montaggio delle guide.

6. Protocollo generale per la colorazione in immunofluorescenza

Un protocollo simile, con piccole modifiche, può essere seguito per la colorazione in immunofluorescenza.

  1. Posizionare i vetrini nell'essiccatore ad aria per 8 minuti, quindi deparaffinare le sezioni in 4 cambi di xilene, 3 minuti ciascuno.
  2. Lavare in etanolo al 100% 3× per 3 minuti ciascuno per rimuovere lo xilene.
  3. Lavare 3× in etanolo al 70% per 3 minuti ciascuno, quindi 2× in etanolo al 50% per 3 minuti ciascuno.
  4. Lavare in acqua distillata per 5 minuti ciascuno, quindi lavare in PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  5. Eseguire il recupero dell'antigene. Ciò può essere ottenuto utilizzando il metodo HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) in una pentola a pressione a microonde e una soluzione per il recupero dell'antigene (10 mM di tampone citrato, pH 6,0).
    Nota: Il processo di fissazione della formalina può mascherare gli antigeni di interesse. Nella nostra esperienza, l'HIER migliora significativamente le prestazioni di alcuni anticorpi, ma non è necessario per altri. Inoltre, sono disponibili altre alternative al metodo HIER per il recupero dell'antigene.
  6. Quando la pentola a pressione si è raffreddata, posizionare i vetrini nel PBS per 15 minuti.
  7. Incubare le sezioni in siero normale (della stessa specie da cui è derivato l'anticorpo secondario) per 30 minuti. NON LAVARE I VETRINI - SCOLARE IL SIERO.
  8. Incubare con anticorpi primari diluiti in siero bloccante normale per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
  9. Lavare con PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  10. Aggiungere un anticorpo secondario fluoroforico coniugato che viene diluito nel normale siero bloccante (o PBS). Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
  11. Lavare con PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  12. Contromacchia con DAPI.
  13. Lavare in PBS 3× per 5 minuti ciascuno.
  14. Applicare un vetrino coprioggetti utilizzando un supporto di montaggio antisbiadimento.

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Risultati

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Topi LDLR-/- di cinque settimane sono stati alimentati con una dieta standard o una dieta ricca di grassi per dieci settimane. I topi sono stati sacrificati e perfusi con formalina come descritto sopra. Le sezioni trasversali del seno aortico sono state preparate e colorate con ematossilina ed eosina per determinare l'area e il volume della lesione (Figura 4). Quando i topi vengono alimentati con una dieta standard, lo sviluppo aterosclerotico è molto limitato e potrebbe non essere rilevabile a 15 setti...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'aterosclerosi è una malattia cronica complessa delle grandi arterie muscolari che è una delle principali cause alla base dell'infarto del miocardio e dell'ictus. La progressione della malattia comporta l'interazione di molti tipi di cellule diverse all'interno della parete arteriosa, con cellule del sangue circolanti, particelle lipoproteiche e altri fattori trasmissibili per via ematica che stiamo appena iniziando a comprendere. Gran parte delle nostre attuali conoscenze riguardanti lo sviluppo e la progressione dell'...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione operativa del Canadian Institutes of Health Sciences e della Canadian Diabetes Association. DEV è supportato da una borsa di studio della Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Cile).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi carenti di LDLR ( D2.129S7(B6)-LDLRTM1Her/J)The Jackson Laboratorystock #002207
FormalinaSigma-AldrichHT5011
Stampi per istologiaTed Pella Inc27195
ParaffinaParamat19286-10
Vetrini rivestitiFisher12-550-15
Contenitori per solventiTissue Tek II4457
MicrotomoLeicaRM22S5
BagnomariaVWR80086-982
MicroscopioOlympusBX41TF
FotocameraOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
ProcessoreSakura FinetekVIP6-A1
Cassette di elaborazioneVWR18000-134
Fornello a pressioneNordic Ware
Vetrino coprioggettiFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Lama per microtomoThermo Scientific30-518-35
Supporto per montaggio antifadingSigma-AldrichF-4680
Montaggio in xilene medio Sigma-Aldrich44581
Mezzo di montaggio acquosoSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80 anticorpoAbcamAb6640
Alpha actina anticorpoSanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’ s ematossilinaSigma-AldrichE4382
eosina ysigma-aldrichMHS16
DAB (3,3'-diaminobenzidina)DakoK3468

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).
  2. Daugherty, A., Rateri, D. L. Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice. Methods. 36, 129-138 (2005).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Diet and murine atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).
  4. Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  5. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  6. Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice. J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).
  7. Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).
  8. King, V. L., Hatch, N. W., et al. A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis. Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).
  9. Taylor Weiss, D. &, R, W. Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II. Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).
  10. Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice. Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).
  11. Pynn, M., Schäfer, K., et al. Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice. Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).
  12. Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  13. Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression. Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).
  14. Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice. J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).
  15. Paigen, B., Morrow, A., et al. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  16. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root. Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).
  17. Lee, T. Y., Muschal, S., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  18. Ballon, G., Chen, K., et al. Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice. J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).
  19. Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis. PLoS One. 5 (1), e8852(2010).
  20. Rotzius, P., Thams, S., et al. Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice. Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).
  21. Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).
  22. Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. Observations on localization of arterial plaques. Circ. Res. 11, 63-73 (1962).
  23. Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  24. Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).
  25. McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).
  26. Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice. Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).
  27. Kirkby, N. S., Low, L., et al. Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography. PLoS One. 6 (2), e16906(2011).

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