Articolo metodologico

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

DOI:

10.3791/50934

⸱

12 novembre 2013

 , 
1Australian Centre for Blood Diseases, Monash University

In questo articolo

Sommario

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Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Abstract

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La barriera ematoencefalica (BBB) ​​comprende impermeabili ma adattabili capillari cerebrali che controllano saldamente l'ambiente cervello. Fallimento della BBB è stato implicato nell'eziologia di molte patologie cerebrali, creando la necessità di sviluppare umano in vitro BBB per assistere nella ricerca clinicamente rilevante. Tra i numerosi modelli BBB finora descritti, statica (assenza di flusso), contattare modello BBB, dove astrociti e cellule endoteliali cerebrali (BECS) vengono co-coltivate sui lati opposti di una membrana porosa, è emerso come un sistema ancora autentica semplificato per simulare l' BBB con elevato throughput capacità di screening. Tuttavia, la produzione di tale modello presenta alcune sfide tecniche. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di un modello di BBB contatto umano utilizzando una nuova combinazione di BECs umani primari ed astrociti umani immortalati. In particolare, i dettagli di un metodo innovativo per la cella-semina su inserti rovesciati così come specificato inserit tecniche di colorazione e esemplificano come usiamo il nostro modello per la ricerca BBB-correlati.

Introduzione

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Il BBB è un'interfaccia specializzata tra la circolazione del sangue periferico e il sistema nervoso centrale, fondamentalmente responsabile del mantenimento dell'emostasi cervello. Esso comprende cerebrali cellule endoteliali microvascolari distinti (BECS) funzionalmente influenzato da pochi componenti cellulari e acellulari (sotto) per formare un gateway stretto e dinamico nel cervello. In condizioni fisiologiche la BBB limita il passaggio di cellule del sangue, componenti del plasma e sostanze nocive, tutti potenzialmente neurotossico, nel cervello. In parallelo, la BBB scambia selettivamente ioni principali e nutrienti (glucosio e amminoacidi) e dei prodo....

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Protocollo

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1. Colture Cellulari (3-7 giorni prima BBB Assembly)

1.1. Primarie cellule cerebrali umane endoteliali microvascolari (BEC)

BECs stati ottenuti commercialmente. Le cellule sono state prodotte dalla dissociazione dispasi del normale tessuto corteccia cerebrale umana e purché congelati a passaggio 3 (<12 raddoppi popolazione).

  1. Substrato: navi Coat tessuto-coltura con "Fattore Allegato" secondo le istruzioni del produttore.
  2. Mantenimento delle cellule: Mantenere BECs in mezzo completo contenente siero. Per la sperimentazione, la cultura BECs in terreno privo di siero completo. M....

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Risultati

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Al fine di stabilire un essere umano, modello di contatto BBB abbiamo dovuto coltivare SVG e BECs sulle membrane porose con un 3 micron pori di dimensioni, indicato per consentire il passaggio di astrociti finali piedi per il contatto con le cellule endoteliali 14,15,27,28. Una rappresentazione schematica del modello di contatto completo è illustrato nella Figura 1 (illustrazione a sinistra). La principale sfida tecnica presentata da un sistema di contatto è la necessità di inizializzare astr.......

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Discussione

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La ricerca medica in patologie cerebrali soffre molta difficoltà traslazionale. Nella zona di ictus ischemico acuto, per esempio, molti farmaci che hanno mostrato una grande promessa in modelli animali fallito alla clinica 38,39. Le ragioni di questi risultati deludenti sono diversi e comprendono l'infedeltà dei sistemi di test preclinici per lo scenario tratto umano e sovrastima dei risultati ottenuti da studi su animali 21. Una strategia per migliorare il valore predittivo dei risultati precl.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni concesse alla RLM della Salute e medicina Consiglio Nazionale delle Ricerche of Australia (sovvenzione # 606658).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fattore di attaccoCell-Systems Corporation4Z0-210
Cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BEC), primarie, umaneCell-Systems CorporationACBRI 376
Cell Systems Corporationmedia completa4Z0-500Integrato con CSC JetFuel
Medium completo privo di sieroCell-Systems CorporationSF-4Z0-500Integrato con CSC RocketFue
DMEM/F-12 con 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (di origine bovina)Sigma-AldrichE2759-15MG
Tubo esterno in siliconeWatson-Marlow913.A080.016Marchio Pumpsil, diametro interno 8 mm, parete 1,6 mm
Siero fetale per vitelliLonza14-501F
Gentamicina solfatoLife Technologies15750-060
Eparina sodicaPfizer1.000 U/ml
Esametildisilazano (HMDS)Sigma-AldrichH4875
Cellule endoteliali microvascolari del cervello umanoCell-Systems CorporationACBRI 376
Tubo interno in siliconeWatson-Marlow913.A032.016Marca Pumpsil, diametro interno 3,2 mm, parete 1,6 mm
L-GlutamminaLife Technologies25030
Mayer' s soluzione di ematossilinaAmber ScientificMH
Terreno essenziale minimo con Earle' s soluzione salina bilanciataHyClone LaboratoriesSH30244.01
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140
Collagene di ratto ITrevigen3440-100-01Marchio Cultrex
Inserti per colture tissutaliCorning Life Sciences3472Marchio Transwell, 6,5 mm di diametro, con membrana porosa in poliestere, 3 &; m poro-dimensione

Riferimenti

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  1. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).
  2. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol. Dis. 3....

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