Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Sommario

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Abstract

La barriera ematoencefalica (BBB) ​​comprende impermeabili ma adattabili capillari cerebrali che controllano saldamente l'ambiente cervello. Fallimento della BBB è stato implicato nell'eziologia di molte patologie cerebrali, creando la necessità di sviluppare umano in vitro BBB per assistere nella ricerca clinicamente rilevante. Tra i numerosi modelli BBB finora descritti, statica (assenza di flusso), contattare modello BBB, dove astrociti e cellule endoteliali cerebrali (BECS) vengono co-coltivate sui lati opposti di una membrana porosa, è emerso come un sistema ancora autentica semplificato per simulare l' BBB con elevato throughput capacità di screening. Tuttavia, la produzione di tale modello presenta alcune sfide tecniche. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di un modello di BBB contatto umano utilizzando una nuova combinazione di BECs umani primari ed astrociti umani immortalati. In particolare, i dettagli di un metodo innovativo per la cella-semina su inserti rovesciati così come specificato inserit tecniche di colorazione e esemplificano come usiamo il nostro modello per la ricerca BBB-correlati.

Introduzione

Il BBB è un'interfaccia specializzata tra la circolazione del sangue periferico e il sistema nervoso centrale, fondamentalmente responsabile del mantenimento dell'emostasi cervello. Esso comprende cerebrali cellule endoteliali microvascolari distinti (BECS) funzionalmente influenzato da pochi componenti cellulari e acellulari (sotto) per formare un gateway stretto e dinamico nel cervello. In condizioni fisiologiche la BBB limita il passaggio di cellule del sangue, componenti del plasma e sostanze nocive, tutti potenzialmente neurotossico, nel cervello. In parallelo, la BBB scambia selettivamente ioni principali e nutrienti (glucosio e amminoacidi) e dei prodotti di scarto del metabolismo tra il cervello e la circolazione di mantenere con precisione l'ambiente cervello ^1,2. Negli ultimi anni sta diventando evidente che fallimento della BBB verifica in una varietà di patologie cerebrali croniche, come le malattie neurodegenerative infiammatorie o anormalità (come morbo di Alzheimer e multiple sclerosi rispettivamente) ^3, nonché in condizioni acute come l'ictus ischemico ^4.

Le proprietà uniche BBB di cellule endoteliali cerebrali (BECS) sono in gran parte indotte dal loro ambiente cerebrale ^5, ed in particolare dagli astrociti ^6,7. Vi è una crescente comprensione che altri tipi di cellule, come i periciti ^8, neuroni e microglia ^1,3, così come la membrana basale ^9, supportano BECs e formano insieme una unità funzionale definita "unità neurovascolare" (NVU) che simultaneamente coppie neuronale richieste metaboliche ai loro capillari che riforniscono ^10.

Il coinvolgimento della BBB in situazioni patologiche alla base di numerosi tentativi di sviluppare modelli in vitro di BBB per aiutare nella ricerca di BBB-correlato ^11,12. Questi modelli mirano a simulare il più vicino possibile in vivo caratteristiche BBB secondo il principio NVU. In vitro Modelli BBB genere si basano su un monostrato di BEC-tight-junction di formatura (principalmente da bovini ^13, umano ^{14, 15} ratto, topo ¹⁶ e suini ^17,18 origini), coltivate su una membrana porosa con astrociti di supporto (ampiamente recensione di Deli et al. 2005 ^11).

Astrociti possono essere coltivate in condizioni di non-contatto sul fondo di una coltura di tessuti e, separato da BECs (coltivate sulla superficie superiore della membrana) dal mezzo di coltura pur comunicanti BECs tramite fattori solubili ^16. In modelli più avanzati che meglio ricordano la struttura anatomica della BBB in vivo, astrociti sono mantenute in condizioni di contatto e coltivate direttamente sul lato opposto della membrana in prossimità BECs ^13,15,17 (Figura 1). Questa configurazione consente il contatto fisico tra BEC e astrociti, stabilita quando progetto astrocitiloro processi attraverso la membrana porosa. Importante, per un vero contatto a verificarsi i pori devono essere ≥ 1μm di diametro, dal momento che astrociti finali piedi non può passare attraverso dimensioni dei pori più piccoli (cioè 0,4 micron) ^14,15. In particolare, i sistemi di contatto BBB sono dimostrate in alcuni studi di essere superiore alle loro controparti non-contatto per quanto riguarda il loro trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) e valori di permeabilità endoteliali dei vari traccianti ^13,17,18. Un'ulteriore dimensione della portata media è stato recentemente inserito in una serie di modelli in vitro BBB per applicare forze di taglio all'endotelio più stretta simulazione del sistema vascolare cerebrale ^12,19.

Un ostacolo tecnico da superare nella generazione di un modello di contatto BBB è la semina di astrociti contro gravità sulla superficie abluminale della membrana porosa. Protocolli precedenti ^13,20, dove astrociti erano semplicemente seminate in una goccia di supporti in cima a unInserto convertito, ammesso volte solo a breve seeding (vale a dire 10 min ¹³ o 2 ore ^20), che sono stati trovati nelle nostre mani per essere insufficiente per l'adesione delle cellule corretta. Usando questo metodo di base, un periodo più lungo attacco astrociti richiede un monitoraggio costante degli inserti di frequente apertura dell'incubatore (causando sbalzi di temperatura, pH e umidità) ed è anche incline a semina delle cellule irregolare a causa di perdita di mezzi di comunicazione attraverso i pori, soprattutto se pori più grandi di 1 um sono impiegati.

Qui, descriviamo un protocollo generale per la preparazione di un modello di contatto BBB. La nostra procedura prevede un metodo alternativo per cellula-semina su inserti invertiti, che affronta le limitazioni di cui sopra. Il metodo permette di adesione indisturbata degli astrociti sulla superficie della membrana abluminale, in un incubatore equilibrata, per un periodo di tempo prolungato. Come risultato, una semina uniforme di astrociti si ottiene che aumenta la qualità barrierae riduce al minimo le variazioni di permeabilità basali tra inserti.

Come l'uso di cellule umane è importante per la ricerca umana rilevanti ^21, abbiamo inoltre dimostriamo in questo articolo l'utilizzo specifico di una nuova combinazione di BECs umani primari e immortalata astrociti umani per l'istituzione di un modello BBB contatto umano con un elevato throughput capacità di screening . Poiché la visualizzazione di cellule su membrane porose può essere difficile, abbiamo anche particolare tecniche di colorazione che possono aiutare a determinare la confluenza e la morfologia delle cellule sulle membrane porose. Infine, rappresentiamo come il nostro modello BBB umano può essere utilizzato per esaminare l'effetto del tessuto di tipo plasminogeno (t-PA) - un enzima trombolitico che serve come opzione di trattamento unico per l'ictus ischemico acuto - sul BBB.

Protocollo

1. Colture Cellulari (3-7 giorni prima BBB Assembly)

1.1. Primarie cellule cerebrali umane endoteliali microvascolari (BEC)

BECs stati ottenuti commercialmente. Le cellule sono state prodotte dalla dissociazione dispasi del normale tessuto corteccia cerebrale umana e purché congelati a passaggio 3 (<12 raddoppi popolazione).

1. Substrato: navi Coat tessuto-coltura con "Fattore Allegato" secondo le istruzioni del produttore.
2. Mantenimento delle cellule: Mantenere BECs in mezzo completo contenente siero. Per la sperimentazione, la cultura BECs in terreno privo di siero completo. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO _2, 21% O ₂ incubatore a 37 ° C
   Nota: In alternativa ai reagenti specializzati, 0.1% (w / v) di gelatina può servire come reagente di rivestimento mentre DMEM/F-12 supplementato con 15 mM HEPES, 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 2 mM L-glutammina, 50 mcg/ Ml di gentamicina, 20 ug / ml di eparina e 20 ug / ml cellule endoteliali supplemento di crescita possono essere utilizzati per la manutenzione BEC.
3. Sub-coltura per la sperimentazione: BECs confluenti Spalato con un rapporto di 1:03-01:06, a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Modificare il terreno di mantenimento ogni 3 giorni. Utilizzare BEC fino a 15 passaggi.

1.2. SVG umano fetale astrogliali Cell-linea

SVG cellule fetali umane astrogliali ²² sono stati originariamente derivati ​​da colture primarie di cervello fetale umano trasformato con la replica carenti virus delle scimmie 40.

1. Manutenzione: cellule Culture SVG in mezzo essenziale minimo con la soluzione salina bilanciata di Earle supplementato con 20% (v / v) FCS (stessa percentuale siero utilizzato per mantenere i loro genitori pile ^22), 2 mM L-glutammina, 50 U / ml di penicillina e 50 streptomicina mcg / ml. Mantenere le cellule in un umidificata al 5% di CO _2, O ₂ 21% incubatore a 37 ° C.
2. Sub-coltura per la sperimentazione: SVG confluenti Spalato con un rapporto da 1:5 a 1:10 a seconda del tempo previsto per un uso successivo (3-7 giorni). Rimozione di tripsina non è necessaria a causa dell'elevato contenuto di siero nel mezzo. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Usare SVG fino a 20 passaggi.

2. Montaggio e Coculturing di umani in vitro BBB Model (giorno 0)

Commento: L'essere umano in vitro modello di contatto BBB viene preparato secondo protocolli pubblicati ^13,23, con modifiche.

2.1. Rivestimento di Inserti

1. Posizionare gli inserti di tessuto-cultura (6,5 millimetri di diametro con poliestere membrana porosa, a 3 micron pori-size) nei pozzetti della piastra da 24 pozzetti in dotazione. Ricoprire la superficie luminale degli inserti durante la notte in un incubatore umidificato a 37 ° C con ratto collagene I (20 mg / cm ^2; 50 pl di 132 mcg/ Ml di collagene I in 0,02% acido acetico in acqua Milli-Q (MQH ₂ O)). Lavare gli inserti tempo (sia dal lato abluminale e luminale) con MQH ₂ O per rimuovere l'acido residuo.
   Nota: membrana basale dei capillari cerebrali non contiene collagene I, ma soprattutto laminine, isoforme di collagene di tipo IV, nidogens, e proteoglicani eparan solfato ^9. Per questo motivo, alcuni ricercatori utilizzano agenti di rivestimento quali collagene IV, fibronectina ^13, o Matrigel (BD Biosciences) ¹⁶ per una più autentica modellazione BBB.

2.2. SVG semina sul lato inferiore (abluminale) membrana di superficie

1. Invertire l'inserto e montare intorno al bordo della membrana porosa un breve pezzo di tubo in silicone elastico ("tubo esterno"; ~ lunga 10 mm 8 mm diametro interno 1,6 mm Parete), essenzialmente creando un nuovo pozzo di sopra della superficie abluminale (Figura 2A).
2. La parte inferiore del nee dell'insertods da sigillare per evitare perdite media. In primo luogo, preparare un tappo (Figura 2A e 2B) in un tubo di silicone ("tubo interno" definito; ~ lunghezza 8 3,2 mm di diametro interno 1,6 mm Parete; Figura 2B), sigillato ad una estremità con un cono di tenuta di plastica (~ 3mm lungo; preparata tagliando il fondo di una reazione a catena 0,2 ml della polimerasi (PCR) tubo; Figura 2B). Questo cono sigilla non solo il lume tubi interni, ma anche allarga il suo bordo per stretto raccordo nell'inserto. Successivamente, utilizzando una pinza sterile, inserire la spina silicone nella cavità luminale e farlo avanzare fino a raggiungere fino ad ~ 1-2 mm dalla membrana (Figura 2A).
3. Avanti, sementi 4 x 10 ⁴ cellule SVG in 200 microlitri SVG terreno di mantenimento (section 1.2.2 sopra) direttamente nel silicone ben al di sopra della superficie della membrana abluminale (Figura 2A). Consentire SVG di aderire per almeno 4 ore in incubatrice.
   Nota: Per preservare la sterilità trasportare gli inserti assemblati tra due piastre da 6 pozzetti (una piastra capovolta rispetto all'altra; Figura 2C) per minimizzare l'esposizione all'aria non filtrata durante la procedura. Tubi di silicone e le spine vengono lavati in etanolo e sterilizzati in autoclave per un uso successivo.
   Nota: Usare tappi (paragrafo 2.2.2) solo per inserti con membrana pori di dimensioni superiori a 1 micron. Membrane con diametro dei pori ≤ 1 micron raramente perdite e richiedono solo il raccordo del tubo in silicone esterno (punto 2.2.1). Inoltre, alcuni agenti di rivestimento diversi da collagene I (vedi nota la sezione 2.1) possono impedire leakiness anche attraverso 3 micron pori. Determinare questo empiricamente.
4. Al fine di monitorare lo stato di aderenza delle vostre astrociti, seminare in parallelo ina 96 pozzetti un volume identico standard della astrociti cellule sospensione. Questo bene ha la stessa superficie dell'inserto 6,5 millimetri (0,33 cm ²⁾ e permettere una più facile visualizzazione di cellule al microscopio a contrasto di fase rispetto alla membrana inserto. Quando si osserva sufficiente aderenza del astrociti nel controllo a 96 pozzetti, astrociti hanno adeguatamente aderito anche alla membrana inserto.
5. Quando gli astrociti hanno sufficientemente aderito nel controllo a 96 pozzetti, trasferire le assemblee di inserimento alla cappa coltura tissutale (vedi nota sopra) e rimuovere delicatamente il tubo in silicone esterno e le spine. Inserti tornare alla (cioè verticale) orientamento normale nei pozzetti forniti contenenti 800 ml / pozzetto di BEC terreno di mantenimento (precedente paragrafo 1.1.2).

2.3. Semina del BECs in Aula al di sopra delle astrociti Luminal

Seed 2x10 ⁴ BECs in 200 microlitri sulla superficie luminale collagene rivestita e restituire l'inserts nell'incubatrice.

2.4. Coculturing

Coculture gli inserti SVG / BEC-teste di serie per 3 giorni in BEC mezzo senza cambiare supporto prima sperimentazione.

3. La sperimentazione del Modello BBB umano (3 ° giorno)

1. Per stimolare le vitro BBB prime cellule di lavaggio a sostituendo media abluminale e luminali con 600 ml e 100 ml di serum-free BECs medio, rispettivamente.
2. Aspirare nuovamente il mezzo luminale e sostituirlo con 100 ml di terreno privo di siero con agenti stimolanti.
   Nota: se è necessaria la stimolazione della camera abluminale (per attivare la vitro BBB dal vano astrociti), aspirare il terreno abluminale e sostituirlo con 600 ul di mezzo privo di siero con agenti stimolanti.
3. Verifichiamo ogni gruppo sperimentale in triplice copia (quindi, se non si esegue la stimolazione del lume, che richiede 3 x 100 ml, si consiglia di diluire il re agenti alle loro concentrazioni finali in 350 ml di terreno privo di siero per gruppo per ridurre al minimo gli errori di pipettaggio tra pozzi).
4. Eseguire paracellular standard e / o saggi transcellulare permeabilità di traccianti marcati ^16,24 (per quest'ultimo usiamo isotiocianato di fluoresceina (FITC) coniugato con albumina) e / o misura di TEER ^13,16,25 come precedentemente descritto.

Per tenere conto di variazioni nella permeabilità basale tra esperimenti, analizzare variazioni di permeabilità relativa ad un inserto rivestito senza cellule (che serve come riferimento per la permeabilità massima) e al gruppo trattato con veicolo utilizzando la formula: permeabilità (% max) = ( valore di permeabilità di inserto sperimentale - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) / (valore di permeabilità dell'inserto blank - valore medio permeabilità del gruppo veicolo) X 100.

4. Visualizzazione di celle porosi Membrane

nt "> Commento: cellule non colorati sulle membrane inserti sono difficili da osservare per contrasto di fase o di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio in quanto la membrana è abbastanza opaco e interferisce con la trasmissione della luce Per affrontare questo problema abbiamo sviluppato diverse procedure di colorazione delle celle. inserti, che migliorano notevolmente l'aspetto delle cellule sulla membrana. Generalmente, macchia le membrane inserto mentre ancora attaccati l'inserto, nei pozzetti. Le membrane devono essere rimossi solo al termine della procedura di colorazione per scopi di montaggio.

4.1. Ematossilina colorazione

1. Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 130 mM NaCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, pH 7.2) per 20 min. Risciacquare una volta in PBS.
2. Immergere l'inserto in soluzione ematossilina 0,1% di Mayer per 2 min.
3. Lavare delicatamente l'inserto con acqua di rubinetto (immergendo gli angoliERT in un bicchiere contenente acqua di rubinetto e pipettando delicatamente l'acqua in eccesso). Trasferire l'inserto alla soluzione di Scott acqua di rubinetto (2 g / L _NaHCO3, 20 g / L _MgSO4) per ~ 20 secondi finché il colore blu desiderato sviluppa. Lavare nuovamente l'inserto con acqua di rubinetto (punto 4.1.3). Un eosina opzionale può essere introdotto qui immergendo l'inserto in soluzione eosina 1% per 10 secondi seguita da un lavaggio con acqua del rubinetto.
4. Air-asciugare la membrana inserto. Usando un bisturi (taglio attorno al bordo membrana) rimuovere la membrana e montarlo su un vetrino per l'imaging in campo chiaro
   Nota: Se di-N-butylphthalateinxylene (DPX) mezzo di montaggio è utilizzato lavare l'inserto con 100% di etanolo seguito da xilene prima di rimuovere e montare la membrana.

4.2. Microscopio Elettronico a Scansione (SEM)

1. Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20min. Lavare tre volte in PBS.
2. Post-fissare le membrane per 30 min a 1% (w / v) Tetrossido di osmio in MQH ₂ O.
3. Lavare inserti in acqua (punto 4.1.3) e disidratare in un gradiente crescente di etanolo (50%, 70%, 90% per 5 minuti ciascuno, poi 3x con il 100% di etanolo per 10 min per intervallo).
4. Trattare inserti disidratati con un misto di esametildisilazano (HMDS): etanolo (1:02 poi 2:01 per 5 min).
5. Trattare gli inserti con il 100% HMDS per 5 minuti, asciugare e conservare in condizioni essiccati.
6. Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio attorno al bordo della membrana). Esaminare membrane mediante microscopia elettronica a scansione.

4.3. Immunofluorescenza

1. Fissare con inserti ghiacciata 4% (w / v) in PBS PFA per 20 min, lavare una volta in soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 154 mM NaCl, 0,22 micron filtrato).
2. Eseguire immunocolorazione delle cellule sulla membrana inserto come descritto in precedenza ^26.
3. Rimuovere la membrana con un bisturi (taglio intorno al bordo della membrana) e montarlo sul agdiapositiva lass con mezzo di montaggio fluorescenza. Esaminare membrana mediante microscopia a fluorescenza.

Risultati

Al fine di stabilire un essere umano, modello di contatto BBB abbiamo dovuto coltivare SVG e BECs sulle membrane porose con un 3 micron pori di dimensioni, indicato per consentire il passaggio di astrociti finali piedi per il contatto con le cellule endoteliali ^14,15,27,28. Una rappresentazione schematica del modello di contatto completo è illustrato nella Figura 1 (illustrazione a sinistra). La principale sfida tecnica presentata da un sistema di contatto è la necessità di inizializzare astr...

Discussione

La ricerca medica in patologie cerebrali soffre molta difficoltà traslazionale. Nella zona di ictus ischemico acuto, per esempio, molti farmaci che hanno mostrato una grande promessa in modelli animali fallito alla clinica ^38,39. Le ragioni di questi risultati deludenti sono diversi e comprendono l'infedeltà dei sistemi di test preclinici per lo scenario tratto umano e sovrastima dei risultati ottenuti da studi su animali ^21. Una strategia per migliorare il valore predittivo dei risultati precl...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fattore di attacco	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BEC), primarie, umane	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Cell Systems Corporation	media completa	4Z0-500	Integrato con CSC JetFuel
Medium completo privo di siero	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Integrato con CSC RocketFue
DMEM/F-12 con 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (di origine bovina)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Tubo esterno in silicone	Watson-Marlow	913.A080.016	Marchio Pumpsil, diametro interno 8 mm, parete 1,6 mm
Siero fetale per vitelli	Lonza	14-501F
Gentamicina solfato	Life Technologies	15750-060
Eparina sodica	Pfizer		1.000 U/ml
Esametildisilazano (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Cellule endoteliali microvascolari del cervello umano	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Tubo interno in silicone	Watson-Marlow	913.A032.016	Marca Pumpsil, diametro interno 3,2 mm, parete 1,6 mm
L-Glutammina	Life Technologies	25030
Mayer' s soluzione di ematossilina	Amber Scientific	MH
Terreno essenziale minimo con Earle' s soluzione salina bilanciata	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicillina/streptomicina	Life Technologies	15140
Collagene di ratto I	Trevigen	3440-100-01	Marchio Cultrex
Inserti per colture tissutali	Corning Life Sciences	3472	Marchio Transwell, 6,5 mm di diametro, con membrana porosa in poliestere, 3 &; m poro-dimensione