Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.
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Articolo metodologico
High-throughput Citometria a Flusso test cellulare per individuare gli anticorpi per N-metil-D-aspartato Receptor o dopamina-2 recettore nel siero umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel corso degli ultimi anni, gli anticorpi contro le proteine di superficie e conformazionali coinvolti nella neurotrasmissione sono state rilevate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale nei bambini e negli adulti. Questi anticorpi sono stati utilizzati per guidare la diagnosi e il trattamento. Saggi cellulari hanno migliorato il rilevamento di anticorpi nel siero del paziente. Essi si basano sulla superficie espressione di antigeni cerebrali sulle cellule eucariotiche, che vengono poi incubate con sieri diluiti paziente seguito da anticorpi secondari coniugati con fluorocromi. Dopo il lavaggio, il legame anticorpo secondario viene quindi analizzata mediante citometria a flusso. Il nostro gruppo ha sviluppato un flusso di high-throughput citometria saggio basato su cellule-live per rilevare in modo affidabile gli anticorpi contro recettori dei neurotrasmettitori specifici. Questo metodo di citometria a flusso è dritto in avanti, quantitativa, efficiente, e l'uso di un sistema di campionamento ad alta velocità permette di grandi coorti di pazienti di essere facilmente analizzati in un breve lasso di tempo. Inoltre, questa cella basata comedire che può essere facilmente adattato per rilevare gli anticorpi a molti diversi target antigenici, sia dal sistema nervoso centrale e la periferia. Alla scoperta di biomarcatori supplementari romanzo di anticorpi consentirà una diagnosi tempestiva e accurata e migliorare il trattamento dei disturbi immuno-mediate.
Introduzione
Negli ultimi anni, sono state individuate forme autoimmuni del sistema nervoso centrale (SNC) malattie. E 'stato dimostrato che queste malattie sono associate e definiti dalla presenza di autoanticorpi. Questi anticorpi si legano ai recettori neuronali o proteine sinaptiche coinvolte nella neurotrasmissione 1,2. Sono stati rilevati diversi antigeni, come recettore N-metil-D-aspartato (NMDAR) 3-5, recettore γ-amminobutirrico B (GABA B) recettore 6, α-ammino-3-idrossi-5-metil-4- L'acido isoxazolepropionic (AMPA) recettore 7, canale del potassio voltaggio-dipendenti (anti-VGKC) proteine associate: leucin....
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Protocollo
1. Subclonaggio Strategia Per costruire pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R o NMDAR
- Ottenere full-length cDNA clone di D2R umana o NMDAR subunità 1 (NR1).
- Scegliere un vettore di espressione, come pIRES2-EGFP, che è adatto per l'espressione di proteine transmembrana con una proteina migliorata verde fluorescente (GFP) reporter sotto il controllo di un sito di entrata del ribosoma interno (IRES), permettendo sia antigeni e GFP essere coespressi in cellule separatamente.
- Subclone cDNA umano all'interno pIRES2-EGFP vettoriale.
- Per subclonare cDNA, utilizzare appropriati enzimi di restrizione (ad esempio NheI e....
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Risultati
Cellule vive HEK293 D2R + e HEK293 CTL sono stati acquisiti al citofluorimetro utilizzando un campionatore high-throughput. Durante l'analisi, le cellule sono state gated basato su forward scatter (dimensione) e parametri (granularità) (Figure 1A e 1D) side scatter. Cellule HEK293 trasfettate espressi molecola reporter, GFP, nel citoplasma, e le cellule non trasfettate sono stati esclusi dall'analisi (Figure 1B e 1E). All&#.......
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Discussione
Questo articolo descrive una nuova applicazione di citometria a flusso saggio basato su cellule in tempo reale per individuare gli anticorpi specifici mirati proteine neuronali superficie cellulare utilizzando un campionatore high-throughput. Utilizzando questa tecnica, si segnala che un sottogruppo di pazienti affetti da malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale hanno anticorpi sierici di superficie NMDAR o alla superficie D2R.
Passi essenziali per la rilevazione ottimale degli ant.......
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Dichiarazioni
Conflitto di interessi: Un brevetto è stato depositato da FB e RCD (Università di Sydney), sostenendo D2R come obiettivo per autoanticorpi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Australian Health and Medical Research Council Nazionale, Star Scientific Foundation (Australia), sindrome di Tourette Association (USA), la sclerosi multipla Trish Fondazione per la Ricerca e la sclerosi multipla Research Australia, Petre Foundation (Australia), la Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australia). Ringraziamo tutti i pazienti ei familiari che hanno fornito i campioni per il nostro studio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| vettore pIRES2-EGFP | Clontech | 6029-1 | |
| Recettore umano HA-Dopamina-2 (D2R) cDNA | Missouri S & T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Subunità umana 1 di NMDAR (NR1) cDNA | Dono dal Prof A. Vincent (Oxford, Regno Unito) | ||
| Anticorpo monoclonale purificato di topo anti-umano NR1 (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| IgG monoclonale purificato di topo anti-DRD2 (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 asino anti-topo IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 capra anti-umano IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium modificato (1x) 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina e 110 mg/L di piruvato di sodio | Invitrogen | 11995-065 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicina | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) con fenolo rosso | Invitrogen | 12605-028 | |
| Cloruro di sodio 0,9% | Baxter | AHF7975 | |
| Polietilenimmina | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligasi | Roche | ||
| Plasmide Più Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Nome dell'apparecchiatura/Software | Azienda | Numero di catalogo | Modello/Versione Citometro |
| a flusso con sistema di campionamento ad alta produttività | BD Biosciences | BDLSRII con | |
| HTS Microscopio invertito | Olympus | CKX41 (con lampada al mercurio e alimentatore U-RFLT50) | |
| Pipetta elettronica multicanale (15-300 μ l) | Eppendorf | 613-2240P | Xplorer a 12 canali Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| Provette coniche in polipropilene da 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| Piastra a 6 pozzetti | BD Biosciences | 353046 | |
| Pallone per colture tissutali (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96 pozzetti piastra | Corning | 651180 | |
Riferimenti
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....
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Ristampe e permessi
