A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Summary

Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

Abstract

Coltura di tessuti è stato uno strumento prezioso per studiare molti aspetti della funzione delle cellule, dallo sviluppo normale della malattia. Metodi di coltura cellulare convenzionali si basano sulla capacità delle cellule sia per legarsi a un substrato solido di un piatto di coltura di tessuti o di crescere in sospensione in mezzo liquido. Diverse linee cellulari immortali sono stati creati e coltivati ​​con tali approcci, tuttavia, questi metodi spesso falliscono quando le cellule primarie devono essere coltivate ex vivo. Tale guasto è stato attribuito alla mancanza dei componenti della matrice extracellulare appropriate del microambiente tessuto dai sistemi standard dove coltura tissutale di plastica è usato come superficie per la crescita cellulare. Matrice extracellulare è parte integrante del microambiente tissutale e la sua presenza è essenziale per il mantenimento delle funzioni fisiologiche come polarizzazione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Qui vi presentiamo un metodo di coltura di tessuto a 3 dimensioni in cui il midollo osseo primario celLS sono cresciuti in matrice extracellulare formulato ricapitolare il microambiente dell'osso umano (sistema RBM). Incorporato nella matrice extracellulare, cellule ricevono sostanze nutritive attraverso il mezzo supplementato con plasma umano, fornendo così un sistema completo in cui la sopravvivenza e la proliferazione cellulare possono essere mantenuti fino a 30 giorni, mantenendo la composizione cellulare del tessuto primario. Utilizzando il sistema RBM siamo cresciuti con successo le cellule del midollo osseo primarie da donatori sani che in pazienti con amiloidosi, e varie neoplasie ematologiche. Il sistema RBM permette, visualizzazione diretta in matrice tempo reale del comportamento delle cellule e la valutazione di efficacia preclinica di nuove terapie. Inoltre, le cellule possono essere isolate dal MLF e successivamente utilizzati per trapianto in vivo, selezione cellulare, citometria a flusso, e acido nucleico e proteina analisi. Nel loro insieme, il metodo RBM fornisce un sistema affidabile per la crescita di ossa primario Marrow cellule in condizioni fisiologiche.

Introduction

Coltura tissutale è stato sviluppato per studiare il comportamento delle cellule in un ambiente controllato per ridurre al minimo la variabilità sistemica quando si confrontano i vari processi in organismi intatti. Questo metodo è stata fondata nei primi anni del 1900 ^{a 1,2} e si riferisce ad una tecnica in cui espianti di tessuto sono state coltivate ex vivo in un piatto di vetro. A metà del 1900 il sistema è stato adattato per far crescere le cellule disperse piuttosto che frammenti di tessuti intatti, e 'la cultura del tessuto' i termini e 'di coltura cellulare' diventato sinonimo ^3. In tali sistemi di colture cellular....

Protocol

1. Preparazione preliminare

1. Tenere pipette sierologiche sterili e relativi puntali a 4 ° C.
   Risoluzione dei problemi: gel Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizzando pipette fredde e suggerimenti impediranno Matrigel di gelificazione durante l'installazione cultura.
2. Scongelare una bottiglia di Matrigel a 4 ° C per una notte.

2. Preparazione dei reagenti

1. Preparazione della fibronectina soluzione stock: Fare un / ml soluzione madre 1 mg di fibronectina sciogliendo 100 mg fibronectina umana in 100 ml di acqua distillata. Una volta che la fibronectina è dissolta, filtro s....

Results

Poiché le cellule del midollo osseo primario non riescono a proliferare in condizioni di coltura tissutale standard, il sistema di meccanismo è stato creato per imitare strettamente microambiente dell'osso, fornendo un sistema di coltura ed espandere cellule BM ex vivo. I principali componenti della matrice extracellulare BM, fibronectina, collagene I, collagene IV, laminina e ^21, sono state incorporate nella matrice meccanismi per fornire l'impalcatura strutturale di questa cultura 3-D. Endosteum, l.......

Discussion

Il modello RBM fornisce un sistema completo in cui la composizione cellulare della BM è mantenuta ex vivo per un massimo di 30 giorni. Cellule BM coltivate in RBM self-stratificare in base alla loro funzione mimando l'architettura BM trovato in vivo. Inoltre, questo è il primo sistema che permette l'espansione del mieloma multiplo clone ^8. I passi più critici per assicurare la robusta crescita delle cellule BM e il successo complessivo della coltura sono: 1) per ottenere una popolazi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di proliferazione CellTrace CFSE per citometria a flusso	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronectina da plasma umano	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matrice della membrana basale Matrigel	BD Biosciences	354234
Collagene a coda di ratto di tipo I	BD Biosciences	354249	Collagen I di Millipore non polimerizza correttamente utilizzando questo protocollo
Mezzo di montaggio VECTASHIELD per fluorescenza (set regolare)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX compresse	Sigma-Aldrich	F4648	Per la colorazione TRAP
SigmaFast BCIP/NBT compresse	Sigma-Aldrich	B5655	Per la colorazione con fosfatasi alcalina
Microscopio confocale Zeiss LSM 510	Software Carl Zeiss
Zeiss 510	Carl Zeiss		Software per l'analisi confocale
Microscopio invertito Zeiss Axiovert 200M	Software Carl Zeiss
MetaMorph	Molecular Devices		Software di analisi delle immagini per citometro a flusso Axiovert 200M
FACSort	Software BD Biosciences
CellQuest Pro	BD Biosciences		Software per l'analisi dei dati di citometria a flusso